Anexo II Capítulo 5. ROTINAS DE ANÁLISES FÍSIC0 QUÍMICAS DE LEITE (Procedimentos Para Avaliação Do Estado de Conservação do Leite)

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1 80 Anexo II Capítulo 5 ROTINAS DE ANÁLISES FÍSIC0 QUÍMICAS DE LEITE (Procedimentos Para Avaliação Do Estado de Conservação do Leite) (Créditos: Mariza Sobreira de Mendonza Sessa) 1.1 DETERMINAÇÃO DA ACIDEZ DO LEITE a) Prova do Alizarol Descrição: Preparado da solução alcoólica Preparo do alizarol: Visa à determinação rápida e aproximada da acidez do leite por colorimetria. A realização pode ocorre na propriedade e plataforma de recepção. Esta prova consiste em colocar em um tudo de ensaio parte iguais de leite e uma solução de alcoólica de alizarina a 2% e interpretar a cor resultante. Elaborar a solução com a seguinte constituição: 72 partes de álcool absoluto e 28 partes de água destilada A solução alcoólica é preparada dos seguintes passos: (i) dissolver alizarina a 2% em álcool de 68 a 70%, (ii) deixar a em repouso por 12 horas, e (iii) filtrar a solução. Interpretação dos resultados: Cor Interpretação Vermelho lilás (tijolo) Sem coagulação Leite normal Acidez de 16 a 18ºD Vermelho Castanho Coagulação fina Leite com acidez de 19 a 21ºD Amarelo Coagulado Coagulação mais espessa Leite com acidez superior a 21ºD Violeta sem Coagulação Leite fraudado ou alcalino Leite com acidez abaixo e 16ºD. Material Necessário: Tubos de ensaio Reagentes: alizarina e álcool a 68% ou 70% b) Prova do Álcool Descrição: Tem por objetivo verificar se o leite pode ser pasteurizado, pois a alteração dos valores da acidez do leite leva a instabilidade das proteínas, o que pode levar o surgimento de coágulos, e estes podem entupir o pasteurizador. - Misturar partes iguais de leite (2ml) e 2ml de álcool a 68% em tubo de ensaio; - Tampar o tubo com o dedo; - Virar várias vezes; - Examinar as paredes do tubo para observar se há formação de partículas brancas (caseína coagulada).

2 81 Obs (1): Colostro, leite de úbere infeccionado (mastite) e leite com fermentação enzimática também coagulam na prova do álcool, mesmo apresentando acidez normal. Obs (2): Álcool a 68%, coagula o leite ácido, não coagulando o normal. Interpretação dos resultados: Constatação Interpretação Partículas finas Acidez acima de 21º D Partículas maiores Acidez superior a 21º D Coagulado Acidez acima de 22º D Coagulação fina Acidez de 19 a 22º D Sem coagulação Acidez normal (16 a 18º D) c) Método Dornic Descrição: Preparo da solução Dornic O objetivo a determinação da acidez de forma exata o processo é realizado em laboratório por meio do processo de Dornic. Este consiste em saber até que ponto a lactose foi transformada em ácido lático. - Transferir, com auxílio da pipeta, 10 ml de leite previamente homogeneizado para um erlenmyer; - Adicionar 4 a 5 gotas de fenolftaleína; - Titular com a solução Dornic, até atingir a coloração rósea; e - Verificar o quanto foi gasto da solução Dornic e proceder ao cálculo da acidez considerando que cada 0,1 ml gasto corresponde à acidez de 1 o D. Exemplo, se foram gastos 2,3 ml da solução Dornic corresponde afirmar que a acidez do leite é de 23 graus Dornic (23 o D). O preparo da solução Dornic ( NaOH 0,1N) consiste na diluição de 4,44 g de hidróxido de sódio em 1 litro de água. Material necessário: Pipeta de 10 ml; Erlenmeyer de 100 ml e Acidímetro de Dornic ou suporte para bureta comum Reagentes: solução Dornic e fenolftaleína. 2. DETERMINAÇÃO DE CONSERVANTES E SUBSTÂNCIAS ESTRANNHAS AO LEITE Detecção de substâncias que aumentam a densidade do leite a) Amiláseo (AMIDO) - Ferver lentamente 10 ml de leite; - Deixar esfriar; - Adicionar 20 ml de água destilada e 3 gotas de água iodada a 1%. Interpretação do resultado: Positivo Coloração Azul que desaparece por aquecimento Presença de amido

3 b) Urina ml de leite; - 5 ml de ácido clorídrico; - 5 ml de álcool absoluto; - 8 a 9 gotas de ácido nítrico puro. Interpretação do resultado: Positiva Coloração rósea violácea. c) Bicarbonato de sódio - 10 ml de leite, misturado a 10 ml de álcool absoluto; - Adicionar 0,5 ml de ácido rosólico a 1%; - Homogeneizar. Interpretação do resultado: Positivo Coloração cereja (rosa avermelhado) d) Formol - 10 ml de leite - 5 ml de ácido sulfúrico com gotas de perclorato de ferro. Interpretação do resultado: Positivo anel rósea violeta e) Ácido Bórico - Mergulhar uma tira de papel curcuna na amostra de leite; - Adicionar 7% de ácido clorídrico; - Deixar o papel secar espontaneamente Interpretação do resultado: Positivo Coloração Vermelha que passa a azul-verde escura com hidróxido de amônia. f) Ácido salicílico - Colocar 100 ml de leite em um erlenmeyer e 250 ml; - Adicionar 2 ml de ácido acético a 25%; - Adaptar um refrigerante ao erlenmeyer; - Aquecer durante 20 minutos em banho Maria a 70ºC; - Resfriar e filtrar; - Misturar 10 ml do soro e 10 ml de água destilada; - Adicionar 2 a 3 gotas de perclotato de ferro. Interpretação do resultado: Positivo Coloração roxa. g) Nitrato - 2ml de leite; - 2 ml de H 2 SO 4; - Gotas de formol Interpretação do resultado: Positivo Formação de anéis azuis.

4 h)sacarose 83-5 ml de leite; - 0,5 ml de Hcl e agitar; - Colocar em banho Maria fervendo por 3 minutos. Interpretação do resultado: Positivo Avermelhado i)água oxigenada - 5 ml de leite - 2 ml de HCL Puro - 1 gota de formol a 10% - Aquecer Interpretação do resultado Positiva Violácea 3. DETERMINAÇAO DA DENSIDADE DO LEITE A densidade é uma propriedade física que é definida pela relação entre a massa e o volume. A densidade medida do leite é relativa, ou seja, é o quociente da divisão da massa de um volume de leite por um igual de água, isto para uma dada temperatura. A medição da densidade é determinada para detectar fraude no leite, no que se refere à desnatação prévia, ou a adição de água ou ainda de outras substâncias. O valor da densidade de leite pode ser expresso em g/cm 3 ou GL (graus do lactodensímetro). O valor médio do leite normal é 1,031g/cm 3 (31 o GL), podendo variar de 1,027 (27 o GL) a 1,034 g/cm 3 (34 o GL). Normalmente na rotina de análise de leite a densidade é determinada quando se encontra leite com porcentagem de gordura abaixo de 3,1%. Objetivo: Detectar e controlar fraudes no leite, como: desnatação, adição de água, etc. A densidade é determinada com o uso do aerômetro graduados para leite. Observações: (1) Com a adição de água ocorrerá a redução do valor da densidade, pois a densidade da água é menor que a do leite. (2) Com a remoção da gordura (desnatação) ocorre o aumento da densidade do leite, pois a gordura é o componente com menor densidade encontrado no leite. (3) A fraude dupla ocorre quando é adicionada água e removida a fração de gordura, ou então, é adicionado um reconstituinte da densidade como: amido, urina, sal de cozinha, (e etc). A rotina laboratorial para a determinação da densidade consiste em: 1. Colocar o produto em uma proveta de 500 ml, tomando o cuidado de agitar o produto antes; 2. Colocar o lactodensímetro e proceder à leitura.

5 84 Os lactodensímetro são calibrados para realização de leituras a15 o C, caso a determinação seja feita à temperatura superior deve ser acrescentado ao valor da densidade 0,2 o GL. Exemplo: Temperatura = 10 o C Densidade = 1,0325 = 32,5GL Amostra I Densidade corrigida = 32,5 5x0,2 = 31,5 GL = 1,0315 g/cm 3 Amostra II Temperatura = 25 o C Densidade = 1,0270 = 27GL Densidade corrigida = x0,2 = 29 GL = 1,0290g/cm 3 Material Necessário: termolactodensímetro ou lactodensímetro (expresso em g/cm 3 ou graus lactodensímetro); termômetro (se não tiver o termolactodensímetro) e proveta de 500 ml. 4. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE GORDURA DO LEITE Objetivos: Verificar fraudes, além de ser essencial na padronização de produtos e na bonificação de produtor. A gordura, também denominada graxa butírica, é emprega na fabricação de cremes e manteiga, sendo, portanto considerada como um dos componentes do leite com maior valor econômico. No leite a gordura é encontrada emulsificada em forma de pequenos glóbulos que possuem diâmetros entre a 0,1 a 14 micra, sendo que 80% deles dentro do intervalo de 2 a 5 micra. Uma gota de leite pode conter até 100 milhões de glóbulos. A determinação do teor de gordura pode ser determinada pelos seguintes métodos: Roese- Gottlieb, Babcoke Gerber. O Método de Geber é o mais utilizado no Brasil. Procedimentos Método Volumétrico Gerber: O procedimento para a determinação de gordura consiste em: 1. Colocar 10 ml de ácido sulfúrico no butirômetro; 2. Adicionar lentamente 11 ml de leite, 3. Adicionar 1 ml de álcool isoamílico; 4. Colocar os butirômetros em uma centrífuga de 3 a 5 minutos a 1000 ou 1200 rpm; 5. Colocar os butirômetros em banho de água a 60 o C; 6. Proceder à leitura. Obs. Com estes procedimentos ocorre à separação da gordura por centrifugação após a digestão do material protéico com ácido sulfúrico. Material necessário: butirômetro para leite; pipetas automáticas de 1 ml; pipetas automáticas de 10 ml; pipetas volumétricas de 11 ml; e centrífuga para butirômetro.

6 85 Obs.: A centrífuga deve ser apropriada para conter os butirômetros, podendo ou não, ser equipada com sistema de aquecimento para manter a temperatura acima de 60ºC. Reagentes necessários: - Ácido Sulfúrico Comercial, com densidade ajustada a 1,82 1,83 g/cm 3 a 15ºC ( se for mais concentrado deve ser diluído em água destilada, geralmente 30 a 40 ml de água é suficiente). Para abaixar a densidade. - Álcool isoamílico com densidade 0,88 g/cm 3 15ºC. 5. TESTE DA ENZIMA FOSFATASE E PEROXIDASE Objetivo: Estes testes têm por finalidade a verificação da eficiência da pasteurização do leite no que se refere à aplicação correta do binômio tempo x temperatura. a) Teste da fosfatasse A enzima fosfomonoesterase é um constituinte do leite normal cru. Esta é completamente destruída no processo de pasteurização quando realizada de forma correta. Na pasteurização do leite a enzima (fosfomonoesterase) é hidrolisada liberando fenol, o qual pode ser determinado qualitativamente e quantativamente. Basta que a temperatura de pasteurização seja ligeiramente inferior ao mínimo requerido, ou que o tempo de retenção seja menor, ocorrendo assim quantidade de leite cru que o teste da positiva. 1. Preparar o substrato tamponado que é feito pela diluição de um tablete de Phosphax (branco) em água utilizando um erlenmeyer graduado para 50 ml. A solução preparada permite a realização de até 10 testes. 2. Preparar a solução CQB, o que é feito pela diluição de uma pastilha de Indo-phax (verde) em 5 ml de álcool metílico. A solução preparada dá para a realização de 25 a 30 testes 3. Colocar 5 ml da solução de Phosphax em um tubo de ensaio; 4. Adicionar 0,5 ml da amostra de leite e agitar a mistura; 5. Deixar o tubo em banho-maria por 30 minutos a temperatura de 37 o C; 6. Remover o tudo do banho-maria, adicionar 6 gotas de CQB e agitar bem. 7. Deixar a mistura descansar por 5 a 10 minutos para o desenvolvimento da cor, que poderá ser: - Azul intenso indicativo da presença de leite cru; - Cor acinzentada indicativo de leite pasteurizado corretamente. - Observação qualquer grau de coloração indica deficiência da pasteurização.

7 86 b) Teste Peroxidase A peroxidase não deve ser destruída na pasteurização. Caso ocorra é porque a temperatura da pasteurização ou o tempo de retenção foram superiores aos recomendados. O método de determinação consiste em: 1. Colocar em um tudo de ensaio 10 ml de leite pré-aquecido a 40 o C; 2. Adicionar de 10 a 15 gotas de uma solução de guaiacol a 2%; 3. Adicionar de 3 a 4 gotas de água oxigenada 4. Resultado se a amostra de leite permanecer branca é porque a pasteurização foi bem feita, se surgir um anel marrom pouco abaixo da amostra é indicativo de falha na pasteurização. Interpretação dos testes de Fosfatase e Peroxidase: Enzimas Leite Cru os Leite Pasteurizado Leite Superaquecido Pasteurizado Inadequadamente PEROXIDASE FOSFATASE TESTE DA ENZIMA REDUTASE Objetivos: avaliar controle microbiológico do leite. O fundamento deste teste está no fato que com o desenvolvimento de bactérias ocorre o consumo do oxigênio livre ou o fracamente combinado presente no leite. Em virtude disto às condições do leite de levemente oxidante passa para levemente redutoras Para detectar esta redução usa-se uma solução de azul-de-metileno (na forma oxidada Azul e na forma reduzida - Incolor) O teste da redutase é adequado para a classificação de suprimentos de leite cru, e é também utilizada na bonificação dos produtores. Reparação do azul de metileno Dissolver um tablete de tiocianato de azul-de-metileno em 200mL de água destilada esterilizada ou fervida recentemente. O volume deve ser completado até 200 ml, à temperatura ambiente. A solução deve ser protegida da exposição à luz, caso contrário ocorrera deterioração da mesma. A solução preparada deve ser utilizada no mesmo dia. Material Necessário: tubos de cultura de 15 ml com tampões; pipetas de 10 ml para coletar amostras de leite; bureta graduada ou pipeta de 1 ml para medir a solução do corante; suporte para tubos; Incubador em banho d`água ou estufa (os tubos devem ser protegidos da luz durante a incubação; termômetro, frasco para o preparo da solução de azul de metileno ou de resazurina; e proveta graduada de 250 ml Reagentes: tabletes de azul-de-metilno (tiocianato de azul-de-metileno ou resazurina) e água destilada.

8 87 - Esterilize os tubos e as pipetas - Colete amostras de 10 ml a serem colocadas nos tubos; - Adicione a cada tubo, 1 ml de solução corante de azul-de-metileno ou de resazutina; - Agite os tubos até uniformizar a mistura; - Tampe os tubos; e - Coloque os tubos na incubadora previamente aquecida à temperatura de 37 o C. Obs.: (1) Amostras para teste podem ser conservadas em geladeira por até 24 horas. Para a realização do teste estas amostras devem ser aquecidas a 37 o C por 10 minutos antes da incubação. Leitura do Teste Ao ser utilizado o azul-de-metileno, as amostras devem ser verificadas ao fim de meia hora e depois a cada 1 hora. A cada observação os tubos devem ser agitados.quando o conteúdo de 4/5 dos tubos de leite apresentar redução, o teste pode ser encerrado. Ao ser utilizado resazurina, a cor deve ser observada após 1 hora de incubação. Interpretação dos Resultados Tempo aproximado de redução com azul-de-metileno Menos que 1 hora 1h à 3 h 30 mim 3h 30 mim à 5h 30 mim 5h 30 mim à 8h 30 mim Maior que 8 h e 30 min Cor com resazurina após 1 hora Branca Rosa Violeta Azulado Violeta róseo Azul Acidentado Qualidade do Leite PÉSSIMA RUIM REGULAR BOA ÓTIMO Qualidade do Leite PÉSSIMA RUIM REGULAR BOA ÓTIMO 7. PROVA DA LACTOFERMENTAÇÃO Objetivo: avaliar controle microbiológico do leite. Pela prova de lactofermentação é verificado o tipo de coagulo formado em uma determinada amostra de leite devidamente incubada e colocada em um tudo de ensaio. A depender da microbiota presente no leite o desdobramento da lactose em ácido lático, como também a fermentação da fração gordura, poderá ocorrer: a produção ou não de gases; a geração ou não de subprodutos; e as aliterações ou não das frações de caseína e de gordura. Lactose Transforma-se em ácido lático Fermentação lática Gordura Fermentação butírica e propiônica. Procedimento:

9 88 - Esterilize os tubos de ensaios de mais ou menos 40 cm 3 ; - Coloque as amostras de leite nos tubos usando pipetas; - Coloque tampões de algodão nos tubos; - Incube as amostras estufas ou banho Maria a 38ºC por12 horas. Interpretação dos Resultados: Tipos de Coágulos Gelatinoso: uniforme, sem separação do soro e sem produção de gás Gelatinoso-Caseoso, Caseoso: os coágulos são mais ou menos contraído, em bastonetes ininterruptos, com liberação de soro esverdeado e pequenas bolhas de gás. Caseoso-Esponjoso, Esponjoso: os coágulos apresentam em grãos ou flocos. O soro apresenta leitoso, amarelo e maior formação de gases. Esponjoso-gasosos, Gasosos: ocorre grande formação de gases. Sem coagulação: Interpretação A lactose foi transformada em ácido lático com coagulação ácida da caseína. Os microorganismos responsáveis são os homofermentativos, principalmente os dos gêneros Streptococcus e Lactobacillus. Além da presença dos dos gêneros Streptococcus e Lactobacillus, atuaram também Escherichia coli e Streptococcus citrovorus. Os microrganismos atuantes são os heterofermentátivos e termodúricos. Os microrganismos presentes são os termodúricos e termófilos. Têm-se neste grupo os chamados coliaerogenes (Escherichia coli e Entrobacter aerogenes). É indicativo que foi adicionado conservantes no leite Referência: COELHO, D. T., ROCHA, J. A. A. Práticas de processamento de produtos de origem animal. Caderno Didático n o 49. Universidade Federal de Viçosa. 1999