Controlo Controlo da Qualidade Qualidade e Segurança e Segurança Química Alimentar dos Alimentos II Espectrofotometria Molecular UV-VIS 1
Controlo Controlo da Qualidade Qualidade e Segurança e Segurança Química Alimentar dos Alimentos II O espectro electromagnético é então dividido de acordo com o - quanto maior o menor a Energia associada a essa onda 2
-A interacção da radiação com a matéria poderá originar a reorientação da radiação e/ou transições entre níveis energéticos dos atómos e moléculas. Assim, se qualquer radiação incidir sobre um determinado corpo, ela poderá ser: Absorção Absorvida Refractada Dispersa Reflectida - Quando átomos ou moleculas absorvem radiação, ocorre uma excitação para um nível mais elevado de energia. Controlo Controlo da Qualidade Qualidade e Segurança e Segurança Química Alimentar dos Alimentos II - O tipo de excitação depende da Energia/comprimento de onda da radiação: UV e visível provocam movimentação de electrões da camada externa de átomos ou moléculas Absorção atómica Espectrofotometria de visível e ultravioleta 3
Espectrofotometria de Absorção UV-VIS I 0 Solução com analito que absorve radiação a λ definido na zona UV-VIS I L I 0 > I absorção de radiação a um λ definido 4
Espectrofotometria de Absorção UV-VIS - perdas 5
Lei de Beer-Lambert Espectrofotometria de Absorção UV-VIS I / I 0 = 10 εcl I 0 intensidade da radiação incidente I intensidade da radiação transmitida pela amostra c- concentração da amostra (mol dm -3 ) L percurso óptico (cm -1 ) ε coeficiente de absorção molar ou absortividade moalr do composto (a um dado c.d.o.) (mol -1 dm 3 cm -1 ) I / I 0 - Transmitância (T) de uma amostra 6
Espectrofotometria de Absorção UV-VIS Lei de Beer-Lambert Forma logarítmica : log 10 (I 0 / I) = - log 10 T = εcl Absorvância (Abs) de uma solução: Abs = - log 10 T = εcl Absorvância e transmitância grandezas adimensionais Absorvância depende do c.d.o. a que se realizou a medição indicar sempre o valor de λ (nm) 7
Espectrofotometria de Absorção UV-VIS Lei de Beer-Lambert aplicável quando radiação incidente é monocromática ε depende de : natureza do analito temperatura solvente índice de refracção comprimento de onda radiação monocromática Lei de Beer-Lambert linearidade entre Abs e concentração de uma amostra não linearidade desvios à lei de B.-L. factores químicos e instrumentais que limitam lei de B.- L. Ex. concentrações muito elevadas interacções electrostáticas variação de ε - dispersão radiação - desvios no equilíbrio químico em função da concentração - presença de radiação parasita - radiação não monocromática - emissão de fluorescência ou fosforescência 8
Espectrofotómetro de feixe simples Amostra de concentração c Hidrogenio ou deutério-uv Tunsgtenio-vis. 9
Espectrofotometria de Absorção UV-VIS: Cuvettes Diferentes percursos ópticos Diferentes materiais Quartzo Sílica fundida Vidro Plástico (descartáveis) λ (UV) quartzo ou sílica fundida λ (VIS) qualquer material 10
Espectrofotómetro de feixe duplo OU Prisma 11
Exercício Espectrofotometria de Absorção UV-VIS 1. A partir de uma solução concentrada de um composto incolor prepararam-se soluções aquosas por diluições sucessivas. A absorvância de cada uma destas diluições foi medida num espectrofotómetro UV-VIS a 245 nm, utilizando uma célula com um percurso óptico de 1.00 cm. Os valores obtidos são apresentados na seguinte tabela: Concentração (mol/dm 3 ) Absorvância 10.30 10-4 2.353 5.15 10-4 1.231 2.57 10-4 0.588 1.29 10-4 0.288 (a) Assumindo como válida a lei de Beer- Lambert neste intervalo de concentrações, determine a equação correspondente à recta de calibração elaborada com os valores da tabela. Determine o valor do coeficiente de absortividade molar ( ) a partir desta equação. (b) Qual a concentração de uma solução aquosa do mesmo composto que apresenta uma transmitância igual a 15%, sendo a medição realizada nas mesmas condições. (c) Justifique a existência de desvios (negativos e positivos) à linearidade na lei de Beer-Lambert para valores elevados de concentração. 12
Espectrofotometria de Absorção UV-VIS Exercício 1. Que lâmpada de emissão de radiação, que comprimento de onda e tipo(s) de cuvette são apropriados para realizar a quantificação de SOD por espectrofotometria de absorção? Justifique. Espectro de absorção UV-VIS característico da enzima superóxido dismutase (SOD) 2. Considerando que a absorvância a 595nm de um extracto de SOD no método de Bradford é 0,758 determine: a. a concentração de SOD no extracto. b. a absorvância se o extracto fosse diluído 1:10. 3. Tendo por base a lei de Lambert-Beer comente a validade de utilização da curva de calibração (tabela 1) para determinar a concentração de SOD num extracto cujo valor de absorvância é igual a 3,0. Absorvância (595 nm) [BSA] (mg / ml) 0,532 0,0625 0,613 0,125 0,653 0,250 0,885 1,0 1,05 1,5 1,175 2,0 13
Análise Quantitativa - calibração Método da Curva de calibração (ou padrão externo) representação gráfica do sinal de detecção em função da concentração de soluções padrão Traçado da melhor curva (ex. regressão linear) Determinação da concentração de analito por extrapolação Método da adição de padrão Leituras do sinal de detecção em várias soluções, todas as soluções contendo amostra e concentrações diferentes do padrão adicionado Representação do sinal detectado em função da concentração de padrão adicionado A abcissa na origem corresponde à concentração do elemento na amostra Método do padrão interno Adição de um padrão de referência a todas as amostras e outras soluções padrão. Permite correlacionar razão dos sinais detectado com as razões das concentrações