Reparo ósseo alveolar após implante de osso bovino misto: avaliação histológica em ratos

Reparo ósseo alveolar após implante de osso bovino misto: avaliação histológica em ratos Alveolar bone repair after implantation of mixed bovine bone: histological evaluation in rats Rodrigo Cardoso de OLIVEIRA 1, Mileni da Silva FERNANDES 2, Fabio Henrique Gelonese de OLIVEIRA 3, Tânia Mary CESTARI 4, Rumio TAGA 5, Eulázio Mikio TAGA 5, José Mauro GRANJEIRO 6 Resumo O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade osteocondutora do osso bovino misto (OBM) medular implantado em alvéolo dental de rato após a extração do incisivo. Foram utilizados 5 grupos com ratos Wistar (n = 50), os quais tiveram o incisivo superior direito extraído. Os animais foram eutanasiados 7, 14, 21, 28 e 42 dias após a extração e a região do alvéolo dental foi coletada para a análise microscópica (hematoxilina e eosina). Os resultados mostraram um processo de reparo ósseo normal no grupo controle com o decorrer dos perídos experimentais, apresentando inicialmente o coágulo sanguíneo (7 e 14 dias) e sua posterior substituição por tecido conjuntivo de granulação (14 e 21 dias) e tecido ósseo neoformado (28 e 42 dias). Em contrapartida o grupo teste (implante de OBM) mostrou atraso no processo de reparo ósseo, apresentando áreas de necrose nos períodos iniciais (7, 14 e 21 dias) e lenta formação de tecido conjuntivo de granulação (28 e 42 dias) e neoformação óssea em contato com as partículas de OBM implantadas (42 dias). Os resultados obtidos no presente estudo permitem concluir que o OBM demonstrou discreta capacidade osteocondutora, concorrendo para o atraso do reparo alveolar. Possivelmente a compactação do material dificultou a formação adequada do coágulo sanguíneo. Abstract The aim of this study was to evaluate the osteoconductive capacity of mixed medullary bovine bone (OBM) implanted on alveoli dental after extraction of the incisor of rats. We used five groups of Wistar rats (n = 50), which had the right upper incisor extracted. The animals were euthanized 7, 14, 21, 28 and 42 days after the extraction, and region of alveoli dental were collected for microscopic analysis (Hematoxylin and Eosin). The results showed a normal process of bone repair in the control group over the course of experimental periods, initially presenting the blood clot (7 and 14 days) and its subsequent replacement by granulation tissue (14 and 21 days) and new bone (28 and 42 days). In contrast, the test group (implantation of OBM) showed delayed bone healing process, with areas of necrosis in the initial periods (7, 14 and 21 days) and slow formation of granulation tissue (28 and 42 days) and bone formation in contact with particles of OBM implanted (42 days). The results obtained in this study demonstrate that the OBM presented discrete osteoconductive capacity, contributing to delay on alveolar repair. Possibly the compaction of the material hindered the proper blood clot formation. Key words: Bioprosthesis. Bone regeneration. Bone and bones Palavras-chave: Bioprótese. Regeneração óssea. Osso e ossos. Endereço para correspondência: Rodrigo Cardoso de Oliveira Faculdade de Odontologia de Bauru USP Depto. de Ciências Biológicas Al. Octávio Pinheiro Brisolla, 9-75 17012-101 Bauru São Paulo Brasil E-mail: rodrigocardoso@usp.br Recebido: 30/11/2011 Aceito: 13/03/2012 1. Professor Doutor do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil. 2 Doutoranda do Curso de Genética Evolutiva, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP, Brasil. 3 Cirugião-dentista, Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil. 4. Doutora em Biologia Oral, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil. 5. Professor Titular do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil. 6. Pesquisador Sênior, Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial, Duque de Caxias, RJ, Brasil. Professor Adjunto do Núcleo de Terapia Celular, Hospital Universitário Antônio Pedro, Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil. 14

artigos ORIGINAIS Oliveira RC de, Fernandes M da S, Oliveira FHG de, Cestari TM, Taga R, Taga EM, Granjeiro JM INTRODUÇÃO A regeneração ou reposição de tecidos/órgãos que tenham sido perdidos é um obstáculo para diversos profissionais da área da saúde (médicos, cirurgiões-dentistas, veterinários entre outros), além do próprio paciente 10. Dentre os diversos tecidos que compõe os vertebrados, o tecido ósseo é o que possui uma destacada capacidade de regeneração 14,18. No entanto, em casos de lesões ósseas extensas (traumas, remoção de tecido por causa de tumor etc.) 14 ou fraturas instáveis que não ocorre a regeneração e patologias como a pseudoartrose podem advir. Ao longo de toda a história humana, mas particularmente nas últimas décadas, biomateriais vêm sendo desenvolvidos no sentido de auxiliar o processo de regeneração do tecido ósseo 10,18,23. Para essa função, os biomateriais devem apresentar, entre outras características, biocompatibilidade, previsibilidade, fácil manuseio e segurança 8,18. No contexto atual da medicina regenerativa devem, ainda, serem absorvíveis e capazes de funcionar como carreadores de células para a engenharia de tecidos 8,15. Entre os diversos biomateriais estudados, os de origem xenogénica (bovina) vem sendo largamente empregados como enxertos ósseos 7,11,30. Entre eles estão o colágeno do tipo I, hidroxiapatita, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) 15, osso cortical e osso medular, todos de origem bovina 7,25. Dentre as vantagens dos xenoenxertos destacam-se a fonte abundante, baixo custo e semelhança estrutural/bioquímica com o tecido hospedeiro 5,25,29. Trabalhos da literatura tem mostrado o uso do osso bovino como biomaterial para regeneração óssea há mais de 60 anos 24. Estudos in vitro 27 e in vivo 23, anteriores, mostram que o osso bovino desmineralizado ou desproteinizado é biocompatível 2,25 e apresenta capacidade osteocondutora 23,30. Uma possível rota de processamento do osso bovino, visando a preservação da porção inorgânica de hidroxiapatita e a porção orgânica de colágeno, denominada osso bovino misto (OBM), permitiria a obtenção de um biomaterial alternativo com composição mais próxima do osso natural, maior resistência mecânica que o colágeno isolado e biodegradabilidade, diversamente dos biomateriais cerâmicos naturais ou sintéticos. De fato, estudo prévios em sítios subcutâneos 7,11 e intraósseos 30 confirmaram a biocompatibilidade, a capacidade osteocondutora e a bioabsorção 30. Entretanto, até o presente momento, não foi determinada a sua eficiência em promover o reparo ósseo em condições específicas para a odontologia (implantodontia e periodontia), como é o caso de defeitos ósseos na região do osso alveolar. Nesse sentido o objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade osteocondutora do osso bovino misto (OBM) medular implantado em alvéolo dental de rato após a extração do incisivo. MATERIAL E MÉTODOS MATERIAL OBM Ossos bovinos foram obtidos de um frigorífico, em seguida esses foram submetidos à limpeza mecânica e tratamento químico com peróxidos e agentes caotrópicos, neutralizado em tampão fosfato e liofilizado 27. O osso bovino misto (OBM) medular em partículas foi processado e esterilizado previamente por radiação gama (25 KGy) como descrito previamente 27. ANIMAIS UTILIZADOS Foram utilizados 50 ratos machos (Rattus norvegicus) da espécie Wistar com 300 g cada, procedentes do Biotério Central da Faculdade de Odontologia de Bauru FOB-USP. Os animais foram divididos em 5 grupos experimentais de acordo com os períodos de 7, 14, 21, 28 e 42 dias após a cirurgia, (10 animais/período). Por todo o tempo experimental os animais foram mantidos em gaiolas com boas condições de alimentação, ração e água ad libitum. A pesquisa foi realizada segundo as normas recomendadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), após a aprovação pelo Conselho Comitê de Ética em pesquisa animal da Faculdade de Odontologia de Bauru Universidade de São Paulo. PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS Realizou-se a exodontia do incisivo superior direito com os animais sob anestesia geral obtida por meio da administração de Dopalen (cloridato de quetamina; Agribrands do Brasil Ltda, Paulínia SP) e Anasedan (cloridato de xilazina; Agribrands do Brasil Ltda, Paulínia SP) na proporção de 0,14 ml/100g de peso do animal, por via intramuscular 17. Após a exodontia, o alvéolo foi preenchido com coágulo sanguíneo do próprio animal (grupo controle) ou com OBM (partículas de 200-400 µm) misturado em solução salina estéril 0,9%, que foi introduzido com o auxílio de porta-amálgama modificado/adaptado e condensado com um condensador para amálgama de Ward nº1. Inseriu-se aproximadamente 12 mg do material. Assim os animais foram divididos em dois grupos: Grupo I (controle): Preenchimento do alvéolo com coágulo sanguíneo. Grupo II (material teste): Preenchimento do alvéolo com OBM misturado em solução salina estéril 0,9%. COLETA DAS PEÇAS Decorrido os períodos experimentais (7, 14, 21, 28 e 42 dias) os animais foram eutanasiados de acordo com as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). As maxilas foram removidas e fixadas, por uma semana, em formol 10% tamponado. PROCESSAMENTO HISTOTÉCNICO As peças foram imersas em solução de EDTA (0,5 M em ph 7,4), que foi renovada semanalmente até a sua desmineralização. Em seguida, as peças foram lavadas em água destilada por 24 horas, receberam processamento histotécnico padrão para cortes semi-seriados no sentido longitudinal de 5µm de espessura e foram coradas com hematoxilina e eosina padrão 18. ANÁLISE HISTOLÓGICA Em seguida, os cortes histológicos foram analisados ao microscópio óptico para determinação da resposta tecidual e descrição dos eventos presentes nos grupos controle e teste nos diferentes períodos experimentais. Foi feita a avaliação da presença de: coágulo sanguíneo, tecido de granulação, tecido ósseo neoformado, tecido fibrótico e material implantado. 15

Reparo ósseo alveolar após implante de osso bovino misto: avaliação histológica em ratos RESULTADOS ANÁLISE HISTOLÓGICA Período de 7 dias: No grupo controle observou-se uma intensa migração e proliferação de células semelhantes à fibroblastos. O alveólo era preenchido ora por coágulo sanguíneo ora por tecido conjuntivo de granulação (Figura 1A), sugerindo a regressão do coágulo e substituição pelo tecido conjuntivo. No grupo preenchido com OBM notaram-se áreas necróticas próximas ao material implantado, além de neoformação óssea entre as paredes do alveólo e o material implantado (Figura 1B). Também foi registrado, em alguns animais do grupo teste, regiões de reabsorção das paredes ósseas do alveólo. Período de 14 dias: Na região apical do alvéolo, no grupo controle, notou-se intensa neoformação óssea a partir da borda óssea e resquicíos do coágulo sanguíneo (Figura 1C). Em algumas áreas, especialmente na região cervical, havia tecido conjuntivo presente, no grupo controle. Notaram-se, no grupo teste, as partículas de OBM circundandas por tecido conjuntivo de granulação, enquanto havia neoformação óssea próxima às paredes do alveólo dental (Figura 1D). Áreas necróticas próximas às partículas foram observadas nesse período. Período de 21 dias: Neste período houve intensa neoformação óssea e reabsoção do coágulo sanguíeno no grupo controle (Figura 2A). Enquanto o grupo teste apresentava as partículas do material em praticamente toda a extensão do alveólo. Áreas necróticas próximas às partículas de OBM, em algumas regiões, eram visíveis neste período (Figura 2B). As regiões de neoformação óssea eram restritas as áreas adjacentes ao osso da parede alveolar. Período de 28 dias: As características histológicas nesse período não diferiram do período anterior (21 dias) para ambos os grupos avaliados. Em um dos animais do grupo teste registrou-se partículas do material no interior das fossas nasais. Período de 42 dias: O alveólo dentário foi preenchido por tecido ósseo no grupo contole (Figura 2C), indicando o reparo completo dessa região. O quadro histológico exibido no grupo teste era de reparo alveolar incompleto, com formação de tecido ósseo ao redor das partículas de OBM e presença de tecido conjuntivo fibroso sem presença de células inflamatórias (Figura 2D).. Figura 1 - Fotomicrografia dos períodos de 7 (A e B) e 14 (C e D) dias: A) Grupo controle. Pode se notar a formação de tecido conjuntivo de granulação próximo a parede óssea do alveólo e presença do coágulo sanguíneo. B) Grupo teste. Observa-se a formação de tecido ósseo entre o osso alveolar e as partículas de OBM. Conteúdo necrótico pode ser visto. C) Grupo controle. Neoformação óssea avançada pode ser notada, além de pequenas áreas com coágulo sanguíneo. D) Grupo teste. Observa-se a formação de tecido ósseo entre o osso alveolar e as partículas de OBM e presença de conteúdo necrótico. Coloração H&E. Magnificação de 10x. Siglas: CO-coágulo sanguíneo; NE-conteúdo necrótico; OBM-osso bovino misto; ON-osso neoformado; OS-osso; TC-tecido conjuntivo. 16

artigos ORIGINAIS Oliveira RC de, Fernandes M da S, Oliveira FHG de, Cestari TM, Taga R, Taga EM, Granjeiro JM da área do alveólo pode ser notada, além de pequenas áreas com coágulo sanguíneo B) Grupo teste. Área de necrose próxima ao OBM C) Grupo teste. Observa-se a formação de tecido ósseo próximo ao osso alveolar. Também são visíveis as partículas de OBM e conteúdo necrótico na região mais interna do alveólo. D) Grupo controle. Osso neoformado ocupando a região do alveólo. O coágulo sanguíneo não foi registrado nesse grupo. E) Grupo teste. Observa-se a formação de tecido ósseo circundando as partículas de OBM, além de presença de tecido conjuntivo. Coloração H&E. Magnificação de 10x (A, B e C) e 40x (D e E). Siglas: CO-coágulo sanguíneo; NE-conteúdo necrótico; OBMosso bovino misto; ON-osso neoformado; OS-osso. DISCUSSÃO Figura 2 - Fotomicrografia dos períodos de 21 (A, B e C) e 42 (D e E) dias. A) Grupo controle. Neoformação óssea ocupando grande parte Estudos histológicos têm mostrado que o processo de reparo alveolar em ratos é similar aos humanos, porém mais rápido 1,17. Em adição, alguns trabalhos demonstram que a utilização de alguns biomateriais atrasa o processo de reparo ósseo, uma vez que necessitam de um tempo maior para ser reabsorvido 4,21. Esses relatos foram confirmados pelos resultados apresentados neste estudo, onde o OBM promoveu o atraso do processo de reparo quando comparado ao alvéolo preenchido apenas pelo coágulo sanguíneo. Trabalhos anteriores 20,21 que estudaram a resposta celular frente à implantação de hidroxiapatita em alvéolos de ratos e humanos indicam que o reparo alveolar é prejudicado pela presença de materiais, ainda que reconhecidamente biocompatíveis, como a hidroxiapatita (HA). No presente trabalho, no grupo teste, além do atraso no processo de reparo alveolar notou-se persistência de focos de necrose até 28 dias, sendo que tais eventos podem ter decorrido pelo excesso de material implantado e compactado. Tal condição dificultou a formação e organização do coágulo sanguíneo no interior da massa de material implantada, impedindo, assim, que neutrófilos e macrófagos, células responsáveis pelo início da reação inflamatória que precede o reparo, chegassem até o centro da lesão e ao material. Posto que a formação e organização do coágulo sanguíneo são fundamentais para assegurar/ordenar o reparo do alvéolo e a angiogênese 1, sua ausência, além de atraso no reparo, pode ter favorecido a necrose pela ausência de nutrientes e da capacidade homeostásica do sangue. É sabido também que a HA tem a capacidade de adsorver proteínas 22. A despeito do coágulo não ter atingido toda a região enxertada, proteínas solúveis no líquido intersticial podem ter se adsorvido ao material implantado. Isto, aliado a um excesso de OBM compactado, poderia acentuar o edema local, o que concorreria para a exacerbação da resposta inflamatória. Destaque-se que a formação óssea ocorreu somente após a reabsorção do tecido necrótico e a partir da região apical, onde o existe menor volume de material e menor condensação, lentamente avançando para a área central do defeito. Aos 42 dias as células inflamatórias eram ausentes e notava-se partículas de OBM ora envoltas por tecido conjuntivo, ora por tecido ósseo neoformado. Não se pode descartar, contudo, que o material tenha induzido diretamente a diminuição significativa do número de células, das funções mitocondrial e a lisossomal, provavelmente pela presença de resíduos do processamento do material como demonstrado anteriormente 26. Uma vertente adicional, abordada por alguns estudos 9,28, relatam sobre a possibilidade da remoção e/ou desnaturação das chamadas proteínas morfogenéticas ósseas (BMP s) presentes nos enxertos ósseos 17

Reparo ósseo alveolar após implante de osso bovino misto: avaliação histológica em ratos preparados por meio do tratamento com uréia ou guanidina 28. Ainda em relação ao processamento do osso bovino, diversos trabalhos tem demonstrado que a esterelização do material por irradiação gama (25 KGy) pode promover alterações importantes nas propriedades mecânicas e biológicas destes. Entre elas a mudança na estrutura de colágeno presente no material e, secundariamente, na atividade biológica das BMPs, além de redução na atividade de osteoclastos 16. Como o OBM também foi tratado com uréia e esterelizado por radiação gama (25KGy) não se pode descartar a contribuição potencial destes fatores na morte celular e atraso no reparo observados. Em contrapartida, um estudo prévio em calvária de coelhos com Kiehl bone 12, biomaterial similar ao OBM, relatou-se a ossificação direta sobre a superfície do material. Resultado este confirmados posteriormente para o mesmo material usado no presente estudo 30. Destaque-se, ainda, que a bioaboserção do OBM anteriormente relatadas não foi confirmada no presente trabalho, e a osteocondução foi observada discretamente apenas no período de 42 dias. Esta discrepância pode ser devido aos diferentes sítios de implantação, pois no estudo anterior 30 o OBM foi colocado na tíbia de rato, um sítio com turnover ósseo menor que o alvéolo dentário; ainda, o biomaterial estava na forma de um pino, apresentando uma área de superfície muito menor que a existente nos grânulos do material utilizado no presente estudo. A maior área de superfície promove uma interação mais intensa com o tecido, podendo ter ocasionado a necrose observada. Alguns autores tem considerado o tempo de reparo alveolar e reabsorção do mateial mais lento como certa vantagem em aplicações específicas 4,13. Primeiramente, os biomateriais implantados em alvéolos onde foram extraídos dentes podem permitir um arcabouço para o crescimento tecidual ósseo e impedir a invasão de tecidos competidores (tecido conjuntivo gengival e epitélio) com o tecido ósseo 19. A capacidade do biomaterial em proporcionar um reparo tecidual ósseo ordenado é chamado de regeneração óssea guiada (RGO) 6. Além disso, alguns estudos defendem a ideia de ganho/manutenção do rebordo alveolar a longo prazo 2,4, como também a elevação de seio maxilar 13,25. Foi implantada HA natural bovina em sítios de extração dental em humanos promovendo significativa manutenção do rebordo 9 meses após as extrações 4. O mesmo grupo 3, avaliou o uso de osso bovino para aumento/reconstrução de cristal do rebordo alveolar e posterior suporte de implantes endosseos, confirmando o sucesso do protocolo pela avaliação clínico-histológica 9 meses após a cirurgia. CONCLUSÃO Os resultados obtidos no presente estudo permitem concluir que o OBM demonstrou discreta capacidade osteocondutora, concorrendo para o atraso do reparo alveolar. Possivelmente a compactação do material dificultou a formação adequada do coágulo sanguíneo. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem os servidores da FOB-USP, Thelma L. Silva, Luiz C. da Silva, Erasmo G. da Silva e Danielle S. Ceolin, pelo auxílio técnico prestado. Este trabalho foi financiado pela FAPESP: Proc. 02/13867-8. REFERÊNCIAS 1. Accorsi-Mendonça T, Paiva KB, Zambuzzi WF, Cestari TM, Lara VS, Sogayar MC, et al. Expression of matrix metalloproteinases-2 and -9 and RECK during alveolar bone regeneration in rat. J Mol Histol. 2008;39(2):201-8. 2. Aldredge WA, Nejat R. Delayed implant procedure using deproteinized bovine bone mineral: A report of 109 consecutive cases. Compend Contin Educ Dent. 2011;32(4):66-71. 3. Artzi Z, Dayan D, Alpern Y, Nemcovsky CE. 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