1.0 Objetivos e alcance Este método visa detectar e quantificar resíduo de cobre (Cu) em amostras de cachaça empregando espectrometria de absorção atômica por chama. O presente método trabalha na faixa de quantificação de 0,20 a 5,80 mg/l para cobre. 2.0 Fundamentos O método fundamenta-se na leitura direta de amostras de cachaça no espectrômetro de absorção atômica por chama, com auxilio de uma curva de calibração processada em meio de álcool etílico 40% v/v. 3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumos 3.1 Reagentes - Etanol absoluto P.A. - Água ultra pura (purificada em sistema Milli-Q Element); 3.2 Padrões - Solução estoque de padrão de cobre (Cu) para absorção atômica, ou superior, na concentração de 1000 mg/l 3.3 Materiais - Béqueres de 50 ml e 100 ml; - Balões volumétricos de 25 ml, 500 ml e 1000 ml; - Provetas de 250 ml e 500 ml; - Tubos graduados de 15 ml; - Amostra branca de cachaça para Cu. Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 1/9
3.4 Insumos - Gás acetileno para absorção atômica; - Ar comprimido filtrado; 4.0 Equipamentos - Espectrômetro de absorção atômica Perkin Elmer AAnalyst 100; - Lâmpada de catodo oco de Cu - Impressora acoplada ao espectrômetro; - Câmara de exaustão ou capela; - Micropipeta de volume variável de 200 µl a 5000 µl; - Micropipeta de volume variável de 20 µl a 200 µl; - Purificador de água, para produção de água ultrapura. 5.0 Precauções analíticas - Os balões utilizados no preparo de todas as soluções padrões devem ser calibrados; - A água utilizada deve ser ultra pura com resistividade maior que 18,2 MΩ.cm; 6.0 Procedimentos Durante a análise, preencher o formulário FOR/LEI/PL/068 Dados Brutos de Análise para Cobre em Cachaça, com todas as informações pertinentes, permitindo a rastreabilidade dos dados da análise como datas, identificação das amostras, reagentes, padrões, equipamentos, condições de leitura e analistas. 6.1 Preparo de soluções reagentes As soluções reagentes devem ser preparadas, identificadas, armazenadas e registradas conforme descrito no POP/LEI/PL/006. Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 2/9
As soluções reagentes tem validade de 6 meses a partir da data de seu preparo. As soluções podem ser preparadas em quantidades diferentes das descritas a seguir, em função do volume de análises, mantendo-se as devidas concentrações. 6.1.1 Preparo da solução de etanol 40% v/v Medir em uma proveta graduada 200 ml de etanol absoluto P.A. e transferir para balão volumétrico de 500 ml. Completar o volume com água ultrapura (R >18,2 MΩ.cm). 6.2. Preparo de soluções padrão As soluções padrão devem ser preparadas, identificadas, armazenadas e registradas conforme descrito no POP/LEI/PL/004. 6.2.1. Solução padrão de adição de cobre 100 mg/l Pipetar 1,0 ml da solução padrão estoque de Cu (1000 mg/l), transferir para balão volumétrico calibrado de 10,00 ml e completar o volume com água ultra pura. 6.2.2. Soluções padrões de uso para a curva de calibração de cobre Preparar 5 soluções padrões nas concentrações de 0,2 mg/l, 1,6 mg/l, 3,0 mg/l, 4,4 mg/l e 5,8 mg/l, pipetando 50 μl, 400 μl, 750 μl, 1100 μl e 1450 μl da solução padrão de adição de cobre (100 mg/l) e transferir para balões volumétricos calibrados de 25 ml. Completar o volume com solução de etanol 40% v/v. Reservar uma alíquota de etanol 40%v/v que será o branco da curva analítica. 6.3 Preparo das amostras 6.3.1 Transferir uma alíquota de aproximadamente 15 ml da amostra para tubo falcon. A amostra será lida diretamente sem preparo adicional. Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 3/9
6.3.2 Transferir cerca de 15 ml de uma amostra branca da matriz em análise previamente selecionada pelo setor conforme POP/LEI/PL/005 para um tubo falcon. A amostra será lida diretamente sem preparo adicional. 6.3.3 Transferir cerca de 15 ml da amostra branca para um balão calibrado de 25,00 ml, esta será utilizada como amostra fortificada para estimar a recuperação. A recuperação deverá ser estimada em um dos três níveis conforme descrito no POP/LEI/PL/009. Verificar na PLN/LEI/PL/017 o nível estudado na batelada anterior e adotar um nível diferente para a análise em curso. As alíquotas devem ser adicionadas em acordo com o Quadro 01. As alíquotas devem ser pipetadas Solução padrão de adição de cobre 100 mg/l (item 6.2.1). Quadro 01: Valores das alíquotas para adição na recuperação para os diferentes níveis Nível Inferior Nível Intermediário Nível Superior Matriz Analito Concentração Alíquota Concentração Alíquota Concentração Alíquota (µl) (µl) (µl) Cachaça Cu 1,00 250 2,50 625 5,00 1250 Completar o volume do balão com a alíquota de recuperação com a amostra branca que estiver sendo utilizada. 6.4 Detecção e quantificação 6.4.1 Otimizar o espectrômetro de absorção atômica conforme IT/LEI/PL/005 Operação e Otimização do Espectrômetro de Absorção Atômica Aanalyst 100. 6.4.2 Programar o equipamento para leitura de cobre utilizando chama de ar acetileno, considerando: Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 4/9
- Lâmpada de cobre. - Comprimento de onda = 324,8 nm e Fenda = 0,7 nm. - Tempo de integração = 0,5 segundos. - Sinal absorbância. - Leitura absorbância. - Registro de leitura eletrônico. 6.4.3 Fazer a leitura de absorbância do branco da curva, dos padrões, das amostras, do branco de amostra e da amostra para estimar a recuperação. Se necessário, efetuar diluições nas amostras que apresentarem leituras de absorbância acima da leitura de absorbância do padrão de maior concentração fazendo os registros no FOR/LEI/PL/068. Os padrões da curva de calibração devem ser lidos três vezes separadamente (no início das leituras, após leitura da metade das amostras e no final da leitura das amostras). A média das leituras deve ser usada para o cálculo da concentração final. As leituras de absorbância da curva de calibração e das amostras deverão ser impressas, conforme IT/LEI/PL/005 - Operação do Espectrômetro de Absorção Atômica Aanalyst 100. 6.5 Pontos críticos 6.5.1 Preparação de soluções padrões, utilizando micropipetas calibradas, balões volumétricos calibrados e padrões certificados. 6.5.2 Preparação da amostra branca fortificada para estimativa da recuperação 6.5.3 Calcular exatamente o fator de diluição para a amostra caso essa precise ser diluída 7.0 Resultados 7.1 Critérios de aceitabilidade dos resultados 7.1.1 Coeficiente de correlação linear (R 2 ) da curva de calibração: 0,995. 7.1.2 Recuperação é de 80 a 110%, conforme POP/LEIPL/011 - Requisitos para validação de métodos de ensaio de elementos inorgânicos. Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 5/9
7.1.3 Resíduos dos pontos da curva de calibração não devem diferir em 10% do valor medido. 7.2 Cálculo dos resultados Transcrever os dados de absorbância e concentração das soluções padrão de uso e das amostras na planilha PLN/LEI/PL/017 - Cálculo de concentrações Cu em cachaça em ppm conforme a IS/LEI/PL/021 Preenchimento da PLN/LEI/PL/017 - Cálculo de concentrações Cu em cachaça em ppm. Avaliar o resultado do coeficiente de correlação (R 2 ) da curva de calibração e o teste de resíduos. Caso não esteja dentro do aceitável (R 2 >0,995) ou os resíduos diferirem de 10% do valor medido, repetir a leitura da curva de calibração utilizando os mesmos padrões e, se ainda assim o problema persistir preparar novos padrões para construção de uma nova curva de calibração. Repetir as leituras das amostras com a nova curva. Se estiver adequado, terminar o preenchimento da planilha. A planilha ajusta os dados pelo Método dos Mínimos Quadrados Ordinários (MMQO) ou Ponderado (MMQP) conforme os dados sejam homocedásticos ou heterocedásticos, calcula o fator de recuperação do dia (caso o resultado de recuperação não esteja dentro do aceitável 80 a 110%, deve-se repetir a análise, observando criteriosamente o método e os pontos críticos) e corrige os cálculos de acordo com a recuperação; para resultados menores que o limite de quantificação emite-se o resultado NQ (não quantificado). Além destes parâmetros a planilha calcula o valor de incerteza expandida (k=2) associado ao resultado da análise através da abordagem top-down e botton-up e o valor de incerteza máximo de acordo com o POP/LEI/PL/011. Os resultados são calculados, mediante correção de diluições e da recuperação através da planilha PLN/LEI/PL/017, registrados no FOR/LEI/PL/069 e emitidos através do MD/LEI/PL/001 Certificado de Análise. Os parâmetros de desempenho do método constantes no REL/LEI/PL/014 - Desenvolvimento e validação de método de análise de Cu em cachaça por Espectrometria de Absorção Atômica por Chama- FAAS, estão resumidos no Quadro 2 e os valores de incertezas no Quadro 3. Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 6/9
Quadro 2 Parâmetros de desempenho para análise de Cu em cachaça Nível investigado Analito (LMR) 0,2 LMR 1,0 LMR HORRAT r * 0,23 0,30 Limite de detecção Limite de Quantificação Cu (5 mg/l) HORRAT R * 0,29 0,42 Recuperação (n=12, %) 104,9 ± 4,2 101,2 ± 4,6 0,04 0,136 * HORRAT r : indicador de repetitividade; HORRAT r : indicador de precisão intermediária. Ambos valores de HORRAT foram calculados com número de amostras n=12. De acordo com a legislação, valores de HORRAT são aceitos até um valor de 2. Quanto mais próximo de zero, maior é a precisão do método. Quadro 3 Valores de incerteza calculados para a calibração e para reprodutibilidade intra-laboratorial para método de análise de Cu em cachaça Matriz Analito LMR Calibração Reprodutibilidade intralaboratorial No LMR Cachaça Cu 5 0,085 0,262 0,553 8.0 Responsabilidades Cabe ao responsável pelo Laboratório de Elementos Inorgânicos LANAGRO/MG assegurar: - O devido treinamento para execução do referido MET - A responsabilidade por autorizar desvios no método cabe ao responsável ou seu substituto Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 7/9
- A execução deste MET é de responsabilidade do analista, qualquer alteração ocorrida durante a análise, deve ser registrada afim de garantir a rastreabilidade. - A responsabilidade pela assinatura dos certificados oficiais de análise é do analista que realizou a análise e do Responsável ou seu substituto. 9.0 Referências AZEVEDO, F.A.; CHASIN, A.A.M. METAIS Gerenciamento da Toxicidade. Editora Atheneu e Inter Tox, p. 554, 2003. BRASIL. Instrução Normativa n 13, de 29 de junho de 2005. Anexo único Regulamento técnico da fixação dos padrões de identidade e qualidade para aguardente de cana e cachaça. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasíia, DF, Seção 1, Página 3, 30 jun.2005. Decisão 2002/657/CE da Comissão, de 12 de agosto de 2002, que dá execução ao disposto da Directiva 96/223/CE do Conselho relativamente ao desempenho de métodos analíticos e à interpretação de resultados (JO L 221 de 17-08-2002). ESPINOZA, L. S.J.,Tecnologia de Produção da Cachaça: Princípios do Processo de Produção de Cachaça de Qualidade. 2006. EURACHEM. The fitness for purpose of analytical methods, a laboratory guide to method validation and related topics. Teddington: LGC, 1998. LIMA A. J. B.,CARDOSO M. G.,GUIMARÃES L. G. D. L.,LIMA J. M. E NELSON D. L. Efeito de Substâncias Empregadas para Remoção de Cobre sobre o Teor de Compostos Secundários da Cachaça, Quimica Nova, vol. 32, n. 4, p. 845-848, 02 2009. SOUZA, A. M. Desenvolvimento e validação de um método analítico para determinação de cobre em cachaça usando FAAS e aplicação no estudo de remoção de cobre em amostras de bebida utilizando bagaço de cana- de- açúcar. 2012. 10.0 Documentos referenciados IS/LEI/PL/021-Prenchimento da PLN/LEI/PL/017 - Cálculo da concentração de cobre em cachaça em mg/l IT/LEI/PL/005-Operação e otimização do espectrômetro de absorção atômica AAnalyst 100 POP/LEI/PL/004-Controle de padrões e soluções padrão POP/LEI/PL/005-Controle de amostras brancas e amostras naturalmente contaminadas POP/LEI/PL/006-Controle de reagentes e soluções reagentes POP/LEI/PL/009-Garantia da qualidade de resultados de análise POP/LEI/PL/011-Requisitos para validação de métodos de ensaio de elementos inorgânicos Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 8/9
11.0 Anexos referenciados FOR/LEI/PL/068-Dados Brutos de Análise para Cobre em Cachaça FOR/LEI/PL/069-Registro de Amostras e Resultados de Análises de cobre em cachaça MD/LEI/PL/001-Certificado de Análise PLN/LEI/PL/017-Cálculo da concentração de cobre em cachaça em mg/l 12.0 Informações de registro Certificado de análise (MD/LEI/PL/001) Cálculo de concentrações de cobre em cachaça em mg/l (PLN/LEI/PL/017) Dados Brutos de Análise para Cobre em Cachaça (FOR/LEI/PL/068) Registros de Amostras e Resultados de Análises de cobre em cachaça (FOR/LEI/PL/069) 13.0 Arquivos anexados Não aplicável 14.0 Controle de alterações Não aplicável Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 9/9