III SIMPÓSIO SOBRE A BIODIVERSIDADE DA MATA ATLÂNTICA. 2014 439 Efeito do Óleo Essencial de Eugenia Caryophyllata em Células Meristemáticas de Lactuca Sativa T. A. Alves 1*, M. K. C. Henrique 1, A. V. Costa 1, A. Ferreira 1 & L. F. Andrade-Vieira 2 1 Universidade Federal do Espírito Santo Centro de Ciências Agrárias CCAUFES. 2 Universidade Federal de Lavras - UFLA *Email para correspondência: thammyresalves@gmail.com Introdução A família Myrtaceae inclui cerca de 140 gêneros e 3000 espécies, sendo dividida em duas subfamílias a Myrtoideae e Leptospermoideae, de maneira que no Brasil encontram-se apenas a subfamília Myrtoideae. Dentre as muitas espécies pertencentes a esta família temse a Eugenia caryophyllata, popularmente conhecida como Cravo-da-Índia (Mariath et al, 2006). Trata-se de uma planta de porte arbóreo, que se desenvolve em solos úmidos, nativa da Indonésia, continente Asiático e aclimatada na África e no Brasil (Filho & Rodrigues, 2012; Silvestre et al, 2010). O cravo-da-índia é muito utilizado na culinária devido ao seu paladar ardente e seu cheiro aromatizante, além disso por apresentar ação antibacteriana o mesmo é usado na conservação de alimentos durante sua armazenagem (Mazzafera, 2003; Silvestre et al, 2010). A E. caryophyllata é aplicada na medicina popular, seu uso empírico se dá de forma bem abrangente, sendo empregado no tratamento de diarreias, indigestão, náuseas, flatulências. Ainda como medicamento tem sido utilizada como anestésico e antisséptico bucal (Filho & Rodrigues, 2012; Mariath et al, 2006; Silvestre et al, 2010; Oliveira et al, 2008). A E. caryophyllata apresenta o eugenol e o Ácido oleanólico como os principais produtos do seu metabolismo secundário (Kelecom et al, 2002). O eugenol é um composto fenólico volátil que compõem de 70 a 90% da composição total do óleo essencial do cravo-da-índia (Kelecom et al, 2002; Vidal et al, 2008), sendo muito utilizado em perfumarias, como aromatizante na indústria alimentícia e em cigarros, anti-inflamatório, antioxidante, cicatrizante e também apresenta uso como analgésico (Kelecom et al, 2002, Silvestre et al, 2010). O ácido oleanólico por sua vez protege a pele dos efeitos da luz solar, atua como inibidor enzimático, antifúngico, antioxidante, antibiótico, anti-inflamatório, antagonista 439
440 ALVES ET. AL: EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL DE EUGENIA CARYOPHYLLATA. em choques anafiláticos, além de inibir o desenvolvimento tumoral e de micro-organismos que crescem na região oral (Kelecom et al, 2002). Os bioensaios vegetais podem ser utilizados como bioindicador, pois a partir de experimentos com esses organismos é possível determinar toxidade, efeitos genotóxicos, além de serem muito sensíveis aos mais diversos agentes mutagênicos (Leme & Marin- Morales, 2009). A vantagem da utilização de Lactuca sativa nos bioensaios vegetais é que essa espécie possui cromossomos grandes facilitando nas análises citogenéticas e são de baixo custo (Sousa et al, 2009). O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial genotóxico e mutagênico do óleo essencial de cravo em células meristemáticas de Lactuca sativa. Material e Métodos Para o desenvolvimento deste trabalho foram utilizadas sementes de Lactuca sativa como modelo vegetal. A germinação foi realizada em placas de petri de 9 cm de diâmetro, forradas com papel filtro fino e regadas com os tratamentos. Foram utilizadas cinco concentrações (0,25%; 0,5%; 1%; 2%; 4% m/v) de óleo essencial de Eugenia caryophyllata, dissolvidas através de homogeneização com solvente, como tratamentos no trabalho. Como controle negativo utilizou-se água de osmose reversa. O diclorometano (solvente utilizado no preparo dos tratamentos) também foi testado. As placas foram lacradas com papel filme e adicionadas à uma câmara de germinação (BOD) à 24 C, onde ficaram armazenadas durante o experimento. As raízes foram coletadas e fixadas em Álcool etílico:ácido Acético (3:1), após 48h de exposição e armazenadas a -4ºC por pelo menos 24 horas, foi realizada a análise citogenética, as lâminas foram preparadas pela técnica de esmagamento e coradas com Orceína acética 2% (Andrade-Vieira, 2014). Avaliou-se cerca de 10000 células meristemáticas por tratamento, sendo observadas e quantificadas as diferentes fases da divisão mitótica, possíveis alterações cromossômicas e nucleares. O índice mitótico (IM) foi obtido dividindo o número de células em divisão (prófase, metáfase, anáfase e telófase) pelo total de células avaliadas em cada tratamento. As frequências das alterações cromossômicas e nucleares foram obtidas dividindo o número de alteração (cromossômica e nuclear, respectivamente) pelo número total de células avaliadas (Andrade-Vieira, 2014). Os dados encontrados com a análise citogenética foram submetidos a análise de variância e as médias comparadas com teste de Dunnett a 5% de significância.
III SIMPÓSIO SOBRE A BIODIVERSIDADE DA MATA ATLÂNTICA. 2014 441 Resultados e Discussão De acordo com teste Dunnett (p< 0.05), não houve diferença significativa entre os controles para as variáveis analisadas, portanto os efeitos observados nos tratamentos com óleo são inerentes aos compostos químicos presentes nos mesmos. Como demonstrado na Tabela 1, para a variável índice mitótico (IM) foi observada diferença significativa em relação aos controles para o tratamento contendo 4% de óleo essencial. Não houve diferença significativa, quando comparado os cinco tratamentos e os dois controles, no caso das alterações cromossômicas (AC), demonstrado na Tabela 2. Tabela 1. Avaliação do ciclo celular das células meristemáticas de raízes de Lactuca sativa tratadas com diferentes concentrações do óleo essencial de Eugenia caryophyllata. A média seguidas por (*) é significativamente diferente dos controles (p < 0.05), de acordo com o teste de Dunnett com 5% de significância. Tratamento Total de células Índice mitótico Controle (água) 10000 3,28 Controle (DCM) 0,25% 10000 10000 2,96 3,10 0,5% 10000 3,50 1% 10000 3,32 2% 10000 3,07 4% 10000 2,36* Tabela 2. Alterações cromossômicas analisadas em células meristemáticas de raízes de alface tratadas com diferentes concentrações do óleo essencial de cravo. Não houve diferença significativa de acordo com o teste Dunnett com 5% de significância. Tratamento Alterações cromossômicas Controle (água) 0,17 Controle (DCM) 0,25% 0,21 0,08 0,5% 0,28 1% 0,28 2% 0,22 4% 0,43 Mazzafera 2003 pesquisou a capacidade inibitória do eugenol, a partir de extratos de cravo-da-índia, sobre a germinação de plântulas de tomate, beijo, rabanete, crotalaria, alface e trigo e percebeu-se com os resultados que os extratos nas concentrações de 31 a 62 mg.ml -1 provocaram a inibição da germinação de todos os modelos vegetais utilizados, 441
442 ALVES ET. AL: EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL DE EUGENIA CARYOPHYLLATA. sendo que o modelo mais sensível ao extrato foi o tomate que já apresentou diminuição da germinação no tratamento com extrato de 7,75 mg.ml -1. Rodrigues et al (2011), estudaram em seu trabalho o efeito de diferentes concentrações do óleo essencial de cravo em Colletotrichum gloeosporioides, o mesmo é o agente causador da antracnose da manga no período pós-colheita, e observaram através dos resultados obtidos na pesquisa que para essa espécie em estudo o óleo apresentou efeito fungicida a partir da concentração de 0,5% apesar de não ter demonstrado efeito genotóxico em células de Lactuca sativa na mesma concentração. O trabalho de Silvestre et al 2010, que apresenta por objetivo estudar o efeito antimicrobiano e antioxidante do óleo essencial de cravo, apontou esse efeito positivamente a partir da concentração de 0,5 mg.ml -1 para bactérias Gram negativas e de 0,2 mg.ml -1 para bactérias Gram positivas. Oliveira et al 2008, pesquisaram a atividade inibitória do óleo de cravo para as bactérias Streptococcus mutans e Lactobacillus casei cultivadas in vitro. Sendo observada positivamente essa atividade do óleo em concentração de 5%, tanto para as bactérias puras, quanto para quando as mesma foram incorporadas ao gel dentifrício a base de cravo. Esse resultado corrobora com os desta pesquisa que apresenta diminuição do índice mitótico em 50,43% na concentração de 4%. Kelecom et al 2002, avaliaram o efeito dos dois principais metabolitos secundários do Cravo o eugenol e o ácido oleanólico no barbeiro vetor da doença de chagas, o Rhodnius prolixus. O estudo apontou que o ácido oleanólico nas concentrações de 1, 10 e 100 mg/ml e o eugenol nas concentrações de 10 e 100 mg/ml causaram a inibição da muda do inseto, além disso o eugenol nessas doses citadas resultou em uma forte fagorrepelência, ou seja, retirada do apetite de insetos hematófagos, nesse caso o barbeiro. Já na concentração de 1 mg/ml o ácido oleanólico apresentou baixa inibição de muda e o eugenol não apresentou nenhuma atividade. Conclusão Os resultados obtidos nesta pesquisa apontam que as raízes regadas com o óleo essencial de cravo em concentração de 4%, apresentaram uma diminuição do seu índice mitótico, ou seja, nesta concentração houve uma diminuição na proliferação das células meristemáticas o que indica um menor crescimento radicular. Já as concentrações menores não diferiram dos controles, logo não exerceram influência na proliferação das células estudadas.
III SIMPÓSIO SOBRE A BIODIVERSIDADE DA MATA ATLÂNTICA. 2014 443 Agradecimentos Gostaria de agradecer a Deus, aos meus pais e irmãos, ao meu namorado, a Universidade Federal do Espírito Santo que me deu os subsídios necessários para o desenvolvimento do presente trabalho e principalmente a minha orientadora que está sempre disposta a me ajudar, me incentivar e mostrar como se trabalha com pesquisas científicas. Literatura Citada Andrade-Vieira, L. F.; Botelho, C.M.; Palmieri, M. J.; Laviola, B G; Praça-Fontes, M. M. Effects of Jatropha curcas oil in Lactuca sativa root tip bioassays. Anais da Academia Brasileira de Ciências (Impresso), v. 86, p. 373-382, 2014. Filho, J. E. S.; Rodrigues, S. S. F. B. Prospecção tecnológica do uso do óleo essencial de cravo-da-índia (Eugenia caryophyllata) e do eugenol na formulação de produtos para higiene pessoal, alimentos e medicamentos. Cadernos de Prospecção, vol.5, n.3, p.152-158, 2012. Kelecom, A.; Rocha, M. A.; Majdalani, E. C.; Gonzalez, M. S.; Mello, C. B. Novas atividades biológicas em antigos metabólitos: ácido oleanólico e eugenol de Eugenia caryophyllata. Rev. bras. Farmacognosia, vol.12, supl.1. Maringá, 2002. Mariath, I. R.; Lima, I. O.; Lima, E. O. & Batista, L. M. Atividade antifúngica do óleo essencial de Eugenia aromatica B. contra fungos dematiáceos. Rev. Bras. Farm., 87(3), 2006. Mazzafera, P. Efeito alelopático do extrato alcoólico do Cravo-da-índia e eugenol. Rev. bras. Bot., vol.26, no.2. São Paulo, 2003. Oliveira, S. M. M.; Lorscheider, J. A.; Nogueira, M. A. Avaliação da ação in vitro de gel dentifrício contendo óleos essenciais sobre bactérias cariogênicas. Latin American Journal of Pharmacy, 27 (2): 266-9, 2008. Rodrigues, M. S.; Jardinetti, V. A.; Schwan-Estrada, K. R. F.; Cruz, M. E. S. Efeito do óleo essencial e do hidrolato de Eugenia caryophyllata thunb no controle de Colletotrichum gloeosporioides em manga. VII EPCC Encontro Internacional de Produção Científica Cesumar CESUMAR Centro Universitário de Maringá. ed. CESUMAR. Maringá, Paraná, 2011. Silvestri, J. D. F.; Paroul, N.; Czyewski, E.; Lerin, L.; Rotava, I.; Cansian, R. L.; Mossi, A.; Toniazzo, G.; Oliveira, D.; Treichel, H. Perfil da composição química e atividades antibacteriana e antioxidante do óleo essencial do cravo-da-índia 443
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