UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas Coordenação de Licenciatura em Química Efeito na germinação e crescimento em plântulas de alface (Lactuca sativa L.) e rabanete (Raphanus sativus L.) tratadas com extratos aquosos e alcoólico de pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) WALESKA ARCANJO ANÁPOLIS, GO- BRASIL JULHO 2012

WALESKA ARCANJO Efeito na germinação e crescimento em plântulas de alface (Lactuca sativa L.) e rabanete (Raphanus sativus L.) tratadas com extratos aquosos e alcoólico de pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) Monografia apresentada à Universidade Estadual de Goiás, Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas de Anápolis, como requisito parcial à obtenção do título de licenciatura em Química. Orientador: Prof.ª Drª. Claudia Cristina Garcia Martin-Didonet. ANÁPOLIS, GO- BRASIL JULHO 2012 2

Efeito na germinação e crescimento em plântulas de alface (Lactuca sativa L.) e rabanete (Raphanus sativus L.) tratadas com extratos aquosos e alcoólico de pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) Trabalho de conclusão de curso submetido à coordenação do curso de Química Licenciatura da Universidade Estadual de Goiás como parte dos requisitos para a obtenção do título de Licenciatura em Química. Aprovado em: - 07-2012 Profª. Drª. Claudia Cristina Garcia Martin-Didonet (Orientadora) Profª. Drª. Maísa Borges Costa (UnUCET/UEG -Membro) Profª. MsC. Luciana Machado Ramos (UnUCET/UEG -Membro) ANÁPOLIS, GO- BRASIL JULHO 2012 3

AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, autor da dádiva maior: a vida. A meus pais e família pela confiança, paciência e acalento ao longo dos meus desafios, principalmente durante este momento. A Profª. Drª. Claudia Cristina Garcia Martin-Didonet pelo o carinho, respeito e admiração, pelas oportunidades oferecidas, pelos conhecimentos adquiridos, amizade e, principalmente, pela a paciência, sobretudo quanto aos atos de humanidade e compreensão. Aos meus grandes amigos e companheiros de profundas reflexões Graziele, Paula Roberta, Ademir, Cintia, Larisse e Poliana pelo carinho no desalento, pelos pensamentos lúdicos e sinceros que suavizaram meu caminho. A professora Drª. Gesimária Ribeiro Costa Coelho pela colaboração na análise dos dados usados neste trabalho, pela amizade, oportunidade, incentivo e, principalmente pelos conhecimentos adquiridos. A professora Drª. Maísa Borges Costa pelas oportunidades, colaboração e orientação prestada na preparação do extrato alcoólico de pimenta-do-reino e, principalmente pelo carinho com que sempre fui recebida. A professora Msc. Luciana Machado Ramos pelas oportunidades e colaboração prestada na execução dos ensaios fitoquímicos para a averiguação de metabolitos secundários e, principalmente pelo carinho com que sempre fui recebida. A professora Msc. Maria Madalena de Alcântara pelas contribuições realizadas na execução deste trabalho, pela amizade e incentivo. Aos professores de graduação. Aos amigos do Laboratório de Bioquímica da UEG pelo companheirismo, receptividade, em especial a Rayane, Agenor, Celso, Marina, Minéa e Bruna, pela amizade, compreensão, solidariedade e colaboração para a realização deste trabalho. Aos funcionários da química, farmácia e biologia pelo apoio na realização desta pesquisa. Aos amigos que indiretamente compartilharam comigo este momento, contribuindo para meu otimismo, perseverança, paciência, perspicácia e sensatez. A Universidade Estadual de Goiás pela oportunidade oferecida. Meus sinceros e eternos agradecimentos 4

DEDICATÓRIA Dedico este trabalho à meus pais Lurdes Maria e João Gonçalves, irmãos Lidiane, Sarah e Arcanjo Gabriel, a minha madrinha e toda a minha família, amigos e colegas por acreditarem que sou capaz. Se eu vi mais longe, foi por estar de pé sobre ombros de gigantes Isaac Newton 5

Resumo da Monografia apresentada na UnUCET/UEG como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Licenciatura em Química. Efeito na germinação e crescimento em plântulas de alface (Lactuca sativa L.) e rabanete (Raphanus sativus L.) tratadas com extratos aquosos e alcoólico de pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) Orientadora: Profª. Drª. Claudia Cristina Garcia Martin-Didonet Curso: Licenciatura em Química Alelopatia se refere à capacidade que determinada planta tem de interferir no metabolismo de outra, por meio de compostos químicos liberados no meio. O objetivo deste trabalho foi determinar a influência alelopática dos extratos aquosos e alcoólicos de frutos de pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) na germinação e crescimento inicial de plântulas de alface (Lactuca sativa L.) e rabanete (Raphanus sativus L.). Os extratos preparados foram submetidos a dois tratamentos para extração aquosa: infusão (I) e decocção (D) e maceração para extração alcoólica, nas concentrações10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 e 10-6. Foi realizada a análise fitoquímica do fruto da pimenta-do-reino. Nos experimentos foram utilizadas três repetições de 15 sementes de alface e 5 de rabanete, distribuídas em placas de Petri com folhas de papel umedecida com 3 ml de extrato. Foi avaliada a porcentagem de germinação (PG) e o comprimento (raiz e folíolo) das plântulas de alface e rabanete. A análise fitoquímica dos frutos revelou a presença de alcalóides. Nas sementes de alface na concentração 10-1 do extrato aquoso de pimenta-do-reino, quando submetida ao tratamento de decocção, acarretou a inibição total no processo germinativo da plântula. Palavras-chaves: alelopatia, crescimento inicial, germinação, pimenta-do-reino. 6

Abstract Allelopathy refers to the ability of certain plant must interfere with the metabolism of other by means of chemical compounds released into the medium. The objective of this study was to determine the allelopathic influence of Aqueous and alcoholic extracts of fruits of black pepper (Piper nigrum L.) on germination and early growth of lettuce seedlings (Lactuca sativa L.) and radish (Raphanus sativus L..) The extracts prepared were subjected to two treatments for aqueous extraction: infusion (I) and decoction (D) to an alcohol extraction and maceration in concentrações 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 and 10-6. We performed the phytochemical analysis of the fruit of black pepper kingdom. In the experiments we used three replicates of 15 seeds of lettuce and radish 5, distributed in Petri dishes with sheets of paper moistened with 3 ml of extract. We evaluated the germination percentage (PG) and length (root and leaflets) of seedlings of lettuce and radish. The phytochemical analysis of fruits showed the presence of alkaloids. In lettuce seeds in the concentration of the aqueous extract of 10-1 black pepper kingdom, when subjected to the treatment of decoction, resulted in total inhibition of seedling germination process. Keywords: allelopathy, initial growth, germination, black pepper kingdom. 7

SUMÁRIO Lista de Figuras...9 Lista de Tabelas...10 Introdução...11 1.1 Pimenta-do-reino...13 1.2 Piper nigrum L...15 1.3 Metabólitos da pimenta-do-reino...17 1.4 Alcalóide: piperina...18 1.5 Interação planta-planta- Alelopatia...19 2. Material e Métodos...21 2.1 Material vegetal...21 2.2 Preparo dos extratos...22 2.3 Prospecção fitoquímica do extrato...22 2.4 Bioensaios...22 2.5 Análises estatísticas...23 3. Resultados e Discussão...24 4. Conclusão...33 Referências Bibliográficas...34 8

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Área de cultivo da pimenta do reino para fins comerciais...13 Figura 2 - Frutos secos da planta de pimenta-do-reino: verde, preta, vermelha e branca...15 Figura 3 - Mostra em detalhe o fruto da plântula Piper nigrum L. em detalhes...16 Figura 4 - Fórmula estrutural da piperina...18 Figura 5 - Resultado do efeito inibidor na germinação em semente de alface, submetidos ao método decocção (D) na concentração 10-1 de extrato aquoso de pimenta-do-reino...24 9

LISTA DE TABELAS Tabela 1 Percentagem de germinação (%) em semente de alface, submetidos ao método de infusão (I) e decocção (D) em diferentes concentrações de extrato aquoso de pimenta-do-reino, Anápolis-Go...25 Tabela 2 Percentagem de germinação (%) em semente de rabanete, submetidos ao método de infusão (I) e decocção (D) em diferentes concentrações de extrato aquoso de pimenta-do-reino, Anápolis-Go...26 Tabela 3 Comprimento da radícula e do folículo de plântulas de alface, submetidas ao tratamento com extrato aquoso de pimenta-do-reino (infusão I e decocção D) em diferentes concentrações, Anápolis-Go...27 Tabela 4 Comprimento da radícula e do folículo de plântulas de rabanete, submetidas ao tratamento com extrato aquoso de pimenta-do-reino (infusão I e decocção D) em diferentes concentrações, Anápolis-Go...28 Tabela 5 Percentagem média de germinação (%) em semente de alface e rabanete, em diferentes concentrações de extrato alcoólico de pimenta-do-reino, com diluição seriada em água, Anápolis-Go...29 Tabela 6 Crescimento da radícula e do folículo de plântulas de alface e rabanete, submetidas a diferentes concentrações extrato alcoólico de pimenta-do-reino, com diluição seriada em água, crescidas durante 5 dias para a semente de rabanete e 7 dias para a semente de alface, Anápolis-Go...30 Tabela 7 - Resultado do teste fitoquímico, realizado nos extratos aquosos e alcoólicos de pimenta-do-reino...32 10

1. INTRODUÇÃO Nas últimas décadas, houve a ampliação da agricultura, esse novo padrão agrícola foi difundido num processo conhecido como Revolução Verde, onde são almejadas altas produtividades, havendo grande demanda pelo uso de agroquímicos, como fertilizantes, corretivos e, principalmente, os defensivos agrícolas: herbicidas, fungicidas, inseticidas, nematicidas e outros (PARACAMPO, et. al, 2009, PESSANHA, et. al, 2010). A partir da utilização dos agroquímicos em maior quantidade, há tendências da degradação e a diminuição da qualidade do meio ambiente, o que tem elevado o número de pesquisas em busca de tecnologias alternativas mais racionais de exploração agrícola, ou seja, à adoção de uma agricultura sustentável (PESSANHA, et. al, 2010). Visando reduzir o uso de defensivos agrícolas nas lavouras, novas técnicas alternativas menos poluentes estão sendo desenvolvida. Entre elas a alelopatia, tem sido proposta para diminuir o uso de herbicidas (SILVA & CARVALHO, 2009). Alelopatia é qualquer efeito direto ou indireto inibidor ou favorável que uma planta exerce sobre outra pela produção de compostos químicos liberados no ambiente, podendo influenciar a germinação e o crescimento inicial de sementes e de plantas (RICE, 1984). Na agricultura, a alelopatia é utilizada como um mecanismo ecológico que influencia na sucessão vegetal primária e secundária, podendo afetar a biodiversidade local, contra a ação de microrganismos, insetos e outros patógenos ou predadores, seja inibindo ou estimulando o crescimento e desenvolvimento das plantas (ALMEIDA et. al, 2008; SILVA & CARVALHO, 2009). A alelopatia tem despertado o interesse dos pesquisadores no campo de ecossistemas naturais como alternativa de manejo, pois a incorporação de substâncias com atividade alelopática na agricultura pode reduzir o uso de agrotóxicos causando assim a diminuição de danos ao meio ambiente (MARASCHIN & ALVES-ÁQUILA, 2005). Pesquisas têm revelado que algumas espécies do gênero Piper, como a pimenta-do-reino, contêm compostos fitotóxicos, solúveis em água que são liberados dentro do ambiente do solo por meio de folhas frescas, caules e tecidos da coroa, 11

bem como de material seco, raízes em decomposição e sementes (CARDOSO et. al, 2005). A pimenta-do-reino é estudada no ponto de vista fitoquímico e farmacológico (SILVA; MACHADO, 1999) pela presença de alguns compostos secundários como alcalóides e óleos, podendo conter até 12 classes de metabólitos secundários (PAMAR et. al,1997), entre eles o mais conhecido e com o maior potencial de estudo está o alcaloide: piperina. A piperina é um alcalóide amídico, componente majoritário da pimenta-do-reino, tal alcalóide pode influenciar o desenvolvimento das plantas principalmente a germinação, tendo efeitos alelopáticos (MOLISH,1937). Levando em consideração os efeitos alelopáticos na germinação, o bioensaio que tem como objetivo analisar o potencial alelopático de extratos alcoólicos e extratos aquosos em plantas de alface (Lactuca sativa) e rabanete (Raphanus sativus L.) tem sido apontado como um método bastante eficiente por vários autores devido às importantes alterações fisiológicas verificadas em diferentes espécies de plantas (PAWLOWSKI & SOARES, 2007) como em folhas de assoviadeira (S. polygamus (Cav.) Cabr.) e aroeira vermelha (S. terebenthifolius Raddi), (PERIOTTO et al., 2004) em folhas de mata-barata ou amargoso (Andira humilis Mart. ex Benth), (BORELLA & PASTORINI, 2009) em folhas de umbu (Phytolacca dioica L). Há ainda poucos estudos abordando o efeito de extratos aquosos e alcoólico dos frutos da pimenta-do-reino, utilizando as sementes de alface e rabanete para testar os efeitos deste no crescimento e desenvolvimento destas plântulas. Tendo em vista a ocorrência de efeitos alelopáticos, o objetivo com esta pesquisa é a análise desses efeitos por parte dos extratos aquosos e alcoólico do fruto da pimenta-do-reino e suas devidas inferências na germinação e no crescimento in vitro de plântulas de alface (Lactuca sativa L.) e rabanete (Raphanus sativus L.), consideradas plantas-testes nesse tipo de estudo. 12

1.1 PIMENTA-DO-REINO A pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) pertence à família Piperaceae do gênero Piper, sendo conhecida tradicionalmente no Brasil como pimenta-do-reino, pimenta preta, pimenta ordinária; schwarzer pfeffer, na Alemanha; pimienta negra, na Espanha; poivre noir, na França, black pepper, na Inglaterra e pepe na Itália (PIRES et. al, 2003). A pimenteira apresenta inflorescência em forma de espiga, chamada amentilho, e é composta de pequenas flores desprovidas de pétalas e sépalas. Os frutos são globosos, pequenos e não se abrem quando maduros. Apresentam também coloração verde-escura (quando imaturos) e vermelha (quando maduros), são plantas trepadeiras perenes com caule liso, redondo, nodoso e ramificado, sendo que sua propagação vegetativa (Figura 1) é realizada a partir de estacas para obter um bom desenvolvimento (GARCIA et al., 2000). A frutificação da pimenteira inicia-se a partir de 18 meses de plantio e a colheita é feita 2 a 4 vezes por ano apresentando uma produção média de 2 a 4 kg de pimenta seca; na fase adulta, as pimenteiras chegam a atingir mais de 3 m de comprimento (GARCIA et al., 2000). Figura 1: Área de cultivo da pimenta do reino para fins comerciais. (Fonte: BRASIL, 2010). A pimenta-do-reino tem seu uso bastante difundido na medicina popular da Ásia, principalmente na Índia (país do qual é originária) sendo que no Brasil, o seu 13

principal uso faz-se presente como um dos principais condimentos na culinária, devido seu sabor e aroma incomparáveis (EMBRAPA, 2005). Por ser uma planta tropical, o cultivo da pimenteira foi introduzido no Brasil pelos colonos portugueses no séc. XVII, que rotularam esta especiaria como pimenta-doreino, termo como é conhecido atualmente, nos países de Língua Portuguesa (EMBRAPA, 2005). No século XVII, o cultivo das pimenteiras ficou restrito somente aos estados litorâneos brasileiros. Já na década de 40, a produção de pimenta-do-reino no Brasil era realizada em pequena escala, sendo que fazia-se necessário importar parte do produto para atender ao consumo dos outros estados. Entretanto, no ano de 1950, o país tornou-se autossuficiente, apesar da planta ainda ser considerada uma figura exótica (EMBRAPA, 2005). O Brasil pode ser considerado atualmente um dos grandes produtores mundiais de pimenta do reino, oscilando entre a segunda e terceira posição no mercado. A pimenta-do-reino vem sendo cultivada nos estados do Pará, Espírito Santo, Maranhão, Ceará, Paraíba, Bahia, Minas Gerais e Amapá (FERREIRA, 2006; FILGUEIRAS, et al., 2001). Em 2004 o Brasil alcançou uma produção de 30.000 toneladas por hectare/ano, vindo daí sua importância econômica e social (FERREIRA, 2006; FILGUEIRAS, et al., 2001; EMBRAPA, 2005). Os maiores importadores da pimenta brasileira são os Estados Unidos, Holanda, Argentina, Alemanha, Espanha, México e França. Enquanto a Índia, maior produtor mundial de pimenta-do-reino consome 50% do total produzido, o Brasil consome apenas 10% (EMBRAPA, 2005). Vale ressaltar que nenhum outro produto agrícola influenciou ou desempenhou tanto um papel importante em eventos históricos como a pimenta-do-reino, havendo somente um paralelo com o petróleo nos tempos modernos (EMBRAPA, 2005). No Brasil são produzidas quatro tipos de pimenta-do-reino (Figura 2), sendo elas: pimenta preta, pimenta branca, pimenta vermelha e pimenta verde, podendo ser comercializadas em grãos inteiros, grãos moídos ou em conserva. Dentre os quatro tipos de pimenta-do-reino, a pimenta tipo preta é a mais comum (PISSINATE, 2006). Dos grãos são extraídos subprodutos, destacando-se o óleo essências, sendo um componente importante para a indústria de carnes (salame, salsicha, mortadela, 14

presunto), para consumo alimentar como condimento e para a indústria de perfumaria (EMBRAPA, 2005; PISSINATE, 2006). Figura 2: Frutos secos da planta de pimenta-do-reino: verde, preta, vermelha e branca (Fonte: prazer gastronômico). 1.2 PIPER NIGRUM L. O gênero Piper possui uma grande diversidade de metabólitos especiais, em torno de 667 compostos diferentes, identificados através de investigações fitoquímicas de apenas 112 espécies estudadas, ou seja, correspondem aproximadamente 10% do total de espécies conhecidas. Estes metabólitos especiais se distribuem nas seguintes classes de substâncias: 190 alcalóides/amidas, 49 lignanas, 70 neolignanas, 97 terpenos, 39 propenilfenóis, 15 esteróides, 18 kavapironas, 17 chalconas/dihidrochalconas, 16 flavonas, 6 flavanonas, 4 piperolídeos e 146 miscelâneas de compostos não muito comuns dentro do grupo majoritário dos metabólitos especiais (DYER et al., 2004). A Piper nigrum L. é utilizada como ornamentação e também no círculo medicinal em forma de chás, infusão, banhos aromáticos tanto das raízes quanto do caule e dos frutos, estes últimos podendo ser consumido nas formas seca ou moída (PISSINATE, 2006). De acordo Uni-Graz (2012) a pimenta preta, contém cerca de 3% de óleo essencial, cujo aroma é dominado (max. 80%) por hidrocarbonetos monoterpenos: 15

linoneno, β-pineno entre outros. O composto alcalóide/amida é responsável pelo o sabor picante da pimenta. O fruto (Figura 3) principalmente, ao longo das últimas décadas tem sido objeto de estudo do ponto de vista fitoquímico e farmacológico; tal estudo revelou uma ampla variedade de metabólitos especiais presentes nesta espécie, dentre eles destacam-se: alcalóides/amidas, propenilfenóis, lignanas, neolignanas, terpenos, esteróides, cavapironas, piperolidas, chalconas, diidrochalconas, flavonas, flavononas e outros compostos, os quais são encontrados somente nesta espécie (PAMAR et al.,1997). Figura 3: Detalhes dos frutos verdes da planta Piper nigrum L. (Fonte: Andréa Postsch, 2009). Pesquisas realizadas recentemente averiguaram que os frutos desta espécie resultaram no isolamento de novos metabólitos, atingindo um total de 35 amidas (PISSINATE, 2006). 16

1.3 METABÓLITOS DA PIMENTA-DO-REINO As plantas liberam no ambiente uma grande diversidade de metabólitos a partir de folhas, raízes e serrapilheira em decomposição, e os seus produtos são importantes em todos os agroecossistemas (GOLDFARB, PIMENTEL & PIMENTEL, 2009). Todas as plantas produzem metabólitos primários e algumas desenvolvem mecanismos de defesa baseados na síntese de determinados metabólitos secundários (SOARES & VIEIRA, 2000). Metabólitos primários são moléculas essenciais para o crescimento e desenvolvimento da planta e utilizados universamente, onde são encontrados em todas as células vegetais. Exemplos de metabólitos primários são os açúcares simples, os aminoácidos, as proteínas e ácidos nucléicos. Já os metabólitos secundários, ao contrário, possuem sua distribuição restrita, tanto dentro da planta quanto em diferentes espécies de plantas. Sendo que as suas concentrações na planta variam freqüentemente durante um período de 24 horas (RAVEN, 2001). A quantidade do metabólito secundário produzido pode ser influenciado pelo local de ocorrência da planta e atuar sobre o comportamento de organismos associados, como em outras plantas, microrganismos, vírus, insetos e podendo interferir até em animais superiores, incluindo o homem (FERREIRA & AQUILA, 2000; SOARES & VIEIRA, 2000). De acordo com Rice (1984) os metabólitos secundários podem afetar negativamente no crescimento das plantas e para a identificação de espécies de plantas que podem ter efeito alelopáticos. Os estudos realizados sobre os efeitos desses compostos em plantas próximas constituem o campo de estudo da alelopatia. A resistência ou tolerância aos metabólitos secundários é mais ou menos específica, existindo espécies mais sensíveis a substâncias fitotóxicas que outras, como por exemplo, Lactuca sativa (alface) e Raphanus sativus L. (rabanete), sendo que estas são utilizadas em bioensaios para a comprovação da existência de substâncias alelopáticas. Por isso são utilizados em bioensaios em laboratório e são consideradas plantas indicadoras de atividade alelopática (ALVES, 2004). 17

1.4 ALCALÓIDE: PIPERINA A piperina (piperidinil do ácido 5-(3,4-metilenodioxifenil)-2E-4E-pentadienóico- Figura 4) é um alcalóide ativo, foi à primeira amida isolada do gênero Piper, sendo o principal metabólico secundário da pimenta-do-reino, encontrado principalmente em seus frutos (SCHAAB, 2008). Figura 4: Fórmula estrutural da piperina. A piperina possui fórmula molecular: C 17 H 19 NO 3, tendo a massa molar 285.34 g/mol, com densidade de 0.861 g, variando o ponto de entre 128 ºC - 132 ºC e composição percentual em massa: C=71% O=17% H=6% N=5%. A piperina possui diversas atividades biológicas, tais como ação inseticida, antipirética, analgésica, anti-inflamatória, contraceptiva e antiespermatogênica, prolonga a ação de certas drogas no organismo, por inibição do metabolismo das mesmas a nível hepático e tem ação antiparasitária (CARDOSO et al., 2005). Na medicina alternativa a piperina vem sendo utilizada em várias regiões do mundo, para tratamento de asma, bronquite, diarréia, insônia, gonorréia, cólica menstrual, tuberculose e artrite (CARDOSO et al., 2005). A piperina pode ser facilmente extraída, sendo realiza através da preparação do extrato aquoso ou alcoólico a partir dos frutos secos de P. nigrum, fornecendo o produto em sua forma pura, em rendimentos de 3% até 7% (RIBEIRO et al., 2004; UNI-GRAZ, 2012 ). Na extração do extrato aquoso podem ser utilizados dois tratamentos, por infusão (I) e decocção (D). De acordo com a resolução da diretoria colegiada nº 83, de 13 de dezembro de 2004 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) estabelece a necessidade de constante aperfeiçoamento das ações de controle sanitário na área de alimentos, visando a proteção à saúde da população. A resolução que dispõe sobre o art. 1º... Regulamento técnico para produtos para o 18

preparo de infusão e decocção..., definindo os métodos de extração infusão e decocção. O extrato definido infusão (I) é o método de preparação no qual a água, em temperatura acima de 90ºC, é vertida sobre o produto que deve permanecer em repouso e decocção (D) é o método de preparação no qual o produto é fervido em água (BRASIL, 2004; SOUZA, 2005). Na extração do extrato alcoólico pode ser utilizado o método de maceração a frio. De acordo com a ANVISA na resolução - RDC nº 10, de 9 de março de 2010, a extração pelo o método de maceração designa a operação na qual a extração da matéria-prima vegetal é realizada em recipiente fechado, em temperatura ambiente, durante um período prolongado (horas ou dias), sob agitação ocasional e sem renovação do líquido extrator (BRASIL, 2010). Levando em consideração que o Brasil é um dos grandes produtores mundiais de pimenta do reino, a piperina pode ser vista como uma matéria-prima potencial para a síntese de outras moléculas de interesse (RIBEIRO et al., 2004; UNI-GRAZ, 2012 ). São empregadas diversas formas de caracterização da piperina, no fruto da pimenta-do-reino. Dentre as técnicas existentes a mais utilizada são espectroscópicas, como a espectroscopia de absorção molecular na região do infravermelho (IV). A técnica de IV é intensamente aplicada na identificação, investigação ou elucidação de estruturas orgânicas, sendo uma técnica simples e barata quando comparada á outras técnicas de espectroscopia utilizadas, e vem sendo amplamente utilizada nas áreas de química de produtos naturais (LOPES & FASCIO, 2004). A espectroscopia na região do infravermelho se baseia na análise de grupos funcionais de estrutura orgânica, através das ligações químicas do composto que possui freqüência de vibração especifica, ou seja, à interação das moléculas ou átomos com a radiação eletromagnética. Portanto é possível realizar a caracterização da piperina por meio de análise e interpretação de espectros de infravermelho (bandas). 1.5 INTERAÇÃO PLANTA-PLANTA ALELOPATIA O termo alelopatia vem de origina-se do grego allelon = de um para outro, pathós = sofrer. A alelopatia pode ser definida como a influência de um indivíduo 19

sobre o outro, ou seja, prejudicando ou favorecendo o segundo, e que a capacidade de produção de substâncias aleloquímicas pode ser pelo efeito de biomoléculas (FERREIRA & AQUILA, 2000; MOLISH, 1937). Rice (1984) define alelopatia como: qualquer efeito direto ou indireto danoso ou benéfico que uma planta (incluindo microrganismos) exerce sobre outra pela produção de compostos químicos liberados no ambiente. Podendo existir mais de 300 compostos secundários vegetais e microbiológicos com propriedades alelopáticas. Algumas características de alelopatia podem ser observadas nas plantas de origem tais como (ALMEIDA et al., 2008): (a) um inibidor químico efetivo deve estar sendo produzido e deve ocorrer na planta numa concentração potencialmente eficaz; (b) a inibição causada pelo composto não afete diretamente a competição da planta por luz, água e nutrientes. Os efeitos alelopáticos são mediados por meio de substâncias químicas (aleloquímicas) pertencentes a distintas categorias de compostos. Essas substâncias químicas são encontradas em diferentes órgãos, incluindo folhas, flores, frutos e gemas de diversas espécies vegetais (PERIOTTO et al., 2004). Há diversas estruturas químicas aleloquímicas, dentre elas há vários tipos de compostos orgânicos identificados, produzidos por microrganismos ou plantas superiores (RICE,1984), podendo ser relacionados como principais os seguintes: Ácidos orgânicos solúveis em água, álcoois de cadeia reta, aldeídos alifáticos e cetonas; ácidos cítricos, málico, acético e butírico; metanol, etanol e acetaldeído; Lactonas insaturadas simples: patulina e ácido parasórbico; Ácidos graxos de cadeia longa e poliacetilenos: oléico, esteárico, mirís-tico e agropireno; Naftoquinonas, antraquinonas e quinonas complexas: julglona, tetraci-clina e aureomicina; Fenóis simples, ácido benzóico e derivados: ácido gálico, vanílico e hidroquinona; Ácido cinâmico e derivados: ácido clorogênico e ferúlico; Cumarinas: escopoletina e umbeliforona; Flavonóides: quercitina, florizina e catequina; 20

Taninos condensados e hidrolisáveis: ácidos elágico e digálico; Terpenóides e esteróides: cineole, cânfora e limoneno; Aminoácidos e polipeptídeos: marasmina e victorina; Alcalóides e cianoidrinas: estriquinina, atropina, codeína, cocaína e amidalina; Sulfetos e glicosídeos: sirigrina e alilisotiocianato; Purinas e nucleosídeos: cordicepina, teofilina e paraxantina. O efeito causado pelas substâncias inibidoras é mais pronunciado em solos arenosos, do que naqueles ricos em matéria orgânica, pois a inativação e destruição das toxinas são mais lentas em solos pobres (REZENDE et al., 2003). Portanto o estudo da alelopatia é de grande importância para a agricultura, pois o efeito alelopático pode afetar a germinação, acelerar ou inibir o desenvolvimento das plantas e/ou sementes próximas afetando o desenvolvimento, podendo até induzir o aparecimento de certas anomalias (SANTIAGO, 2004). 2. MATERIAL E MÉTODOS O presente estudo foi realizado na Universidade Estadual de Goiás- UEG, no Laboratório de Bioquímica, entre a estação de inverno de 2008 a estação de verão de 2010, no município de Anápolis, Goiás, na latitude sul 16 19 36 e longitude oeste 48 57 10 com altitude de 1.017 metros acima do nível do mar. 2.1 Material vegetal Foram utilizados os frutos secos da pimenta do reino (Piper nigrum L.) para o preparo dos extratos aquosos e alcoólico. Para os biotestes do efeito dos extratos aquosos e alcoólico da pimenta do reino (Piper nigrum L.) foram utilizadas as sementes de alface (Lactuca sativa L.) e rabanete (Raphanus sativus L.) obtidas no comércio local, sendo utilizados os produtos da empresa Feltrin- Importadora de Sementes Ltda (linha econômica). As sementes de rabanete utilizadas foram da variedade Crimson Gigante, de embalagem de peso líquido: 1,40g, lote a 1010507 e 1010810, com germinação nas taxas de 95% e 97%, e pureza: 99,9%. A variedade das sementes de alface utilizadas foi Crespa Cinderela, em embalagem com peso líquido: 1,20g, lotes 773060102 e 07730704, com germinação nas taxas de 80% a 97%, e pureza de 99,9%. 21

2.2 Preparo dos extratos Foram utilizados frutos secos pulverizados e macerados até pó fino e depois submetidos a dois tratamentos para extração aquosa: infusão (I) e decocção (D), segundo ANISA. Para o procedimento de infusão, foram utilizados 10 gramas de amostra adicionados a 100 ml de água destilada quente. Para o procedimento de decocção, foram utilizados aproximadamente, 10 gramas de amostra adicionados a 100 ml de água destilada e, em seguida, aquecida. Para ambas as técnicas, após 15 minutos, foram realizadas a filtração por gravidade, obtendo aproximadamente cerca 100 ml de extrato aquoso concentrado. Também foram realizada a extração continua com solvente alcoólico a frio, sendo 10g de pó de pimenta-do-reino para 100mL de álcool etílico (1:10). Este preparo foi submetido a maceração por sete dias, sendo que esta solução constitui o extrato bruto etanólico. Este foi concentrado em evaporador rotativo e foi diluído em água (1:10), em cinco concentrações entre10-2 a 10-6 (v/v), consistindo nos tratamentos para serem avaliado o efeito na germinação. 2.3 Prospecção fitoquímica do extrato Os testes fitoquímicos foram realizados para identificar qualitativamente algumas classes de metabolitos secundários como: saponina, ácidos orgânicos, açúcares redutores, alcalóides, purinas e flavonóides seguindo a metodologia descrita por Barbosa (2004), que é baseado na mudança de cor ou formação de precipitados após a adição de reagentes específicos. 2.4 Bioensaios Os bioensaios foram conduzidos no laboratório de Bioquímica em capela de fluxo laminar vertical, utilizando placa de petri de plástico estéril, com um disco de papel filtro estéril como suporte para as sementes utilizadas no bioensaio (BRASIL, 2009). Para os bioensaios da geminação das sementes de alface e rabanete foram utilizadas as seguintes observações para a determinação da percentagem da germinação, corresponderam à proporção do número de sementes que foi capaz de produzir plântulas classificadas como normais segundo Brasil (2009). 22

Utilizou-se 5 sementes de rabanete e 15 sementes de alface em cada placa de petri com 3 repetições para cada tratamento. Como controle, foi utilizado somente água. As sementes foram germinadas em placas de petri contendo papel de filtro umedecido com 3,0 ml dos extratos de pimenta-do-reino a serem testados e para o controle foi utilizado com água destilada estéril. Para os bioensaios de germinação e crescimento utilizaram-se a solução de pimenta-do-reino com extração por infusão (I), decocção (D) e etanólico. As soluções utilizadas foram preparadas nas concentrações 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 e 10-6 por diluição seriada em água para todos os tratamentos. Já para o extrato etanólico as diluições foram 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 e 10-6 por diluição seriada em água. As placas assim preparadas foram vedada com o filme plástico (PVC) e mantidas sob luz (branca e fria) constante a temperatura ambiente (cerca de 27 C), segundo recomendações de Brasil (1992), a fim de favorecer a germinação das sementes. As avaliações da germinação foram realizadas após 5 dias para sementes de rabanete e 7 dias para sementes de alface, nas condições acima citadas sendo avaliadas a percentagem de germinação e o comprimento da radícula e do folíolo com régua milimetrada. Estas avaliações foram realizadas em todas as triplicatas e os dados submetidos à análise estatística de média de Tukey para todos os tratamentos. 2.5 Análises estáticas As variáveis analisadas foram: germinação, medição do folíolo e radícula da planta. Para normalizar a distribuição dos dados de radícula e folíolo para análise estatística, os dados foram transformados em x+1, onde x= dados do comprimento (cm). A análise estatística dos dados consistiu de análise da variância e de decomposição da variação dos fatores através de regressão polinomial, para o fator concentração. Na regressão polinomial, os critérios utilizados para a adoção do modelo a análise estatística de 95% de confiança pelo teste de variação da média de Tukey. As análises estatísticas foram executadas pelo programa SISVAR Sistema de Análise de Variância- da Universidade Federal de Lavras (Ferreira, 2000). 23

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Comparando as diferentes concentrações dos extratos I e D de pimenta-doreino, foi observada uma interferência significativa na porcentagem de germinação e crescimento inicial (raiz e folíolo) nas plântulas de alface (Lactuca sativa L.) e rabanete (Raphanus sativus L.). Na tabela 1, foi observado que na concentração 10-1 do extrato D ocorreu inibição total na germinação e perda de viabilidade da semente de alface (Figura 9). Este resultado obtido pode ser comparado ao resultado obtido por Mairesse (2005), onde vários extratos aquosos de pata-de-vaca (Bauhinia forticata), hortelã (Mentha piperita) sálvia-da-gripe (Lippia Alba) tiveram efeitos drásticos sobre a germinação de alface. Figura 5 - Resultado do efeito inibidor na germinação em semente de alface, submetidos ao método decocção (D) na concentração 10-1 de extrato aquoso de pimenta-do-reino. Na germinação de alface, foi observado um aumento na germinação da plântula de alface, com exceção as concentrações 10-1 do extrato de pimenta-do-reino, pelo o método de infusão. O efeito inibitório de 45,2% na concentração 10-1 e houve um efeito de indução da germinação de 41,0% na concentração 10-5 quando estas foram comparadas ao controle (Tabela 1), apesar de não ter sido significativo. 24

Tabela 1. Percentagem média de germinação (%) em semente de alface, submetidos ao método de infusão (I) e decocção (D) em diferentes concentrações de extrato aquoso de pimenta-do-reino, Anápolis-Go. Concentrações Alface (I) Alface (D) Controle 7,3 a 7,3 ab -1 4,0 b 0,0 b -2 6,0 a 5,3 ab -3 6,3 a 11,3 a -4 6,7 a 9,3 a -5 10,3 a 7,3 a -6 7,3 a 9,0 a Cv (%) 27,92 32,2 Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si estatisticamente, pelo o teste de Tukey ao nível de significância de 5%.Tratamento pelo o método de infusão (I), tratamento pelo o método de decocção (D). Quando as sementes de alface foram tratadas com o método (D), houve uma diminuição da germinação em média 100% e 27,4%, nas concentrações 10-1 e 10-2 respectivamente, quando comparadas com o controle. Na concentração 10-3, ocorreu um aumento significativo de 54,7% na taxa de germinação de sementes de alface. Nas demais concentrações, não foram observadas variações significativas dos tratamentos quanto comparadas com controle (Tabela 1). Na tabela 2, foi observado um efeito inibitório em média de 66% na germinação da plântula de rabanete, na concentração 10-1, quando tratada com extrato aquoso (I) quando comparada ao controle. Nas demais concentrações do extrato (I), não foram observadas alterações significativas quando comparados com o controle. No extrato aquoso (D) de pimenta-do-reino, não foram observadas variações significativas quando estas foram comparadas ao controle. Souza et al. (2005), também verificou a inibição da germinabilidade sobre as sementes de alface tratadas com o extrato aquoso de chá-de-sálvia (Lippia Alba). 25

Tabela 2. Percentagem média de germinação (%) em semente de rabanete, submetidos ao método de infusão (I) e decocção (D) em diferentes concentrações de extrato aquoso de pimenta-do-reino, Anápolis-Go. Concentrações Rabanete (I) Rabanete (D) Controle 5,0 a 5,0 a -1 1,7 b 3,7 a -2 5,0 a 5,0 a -3 4,7 a 4,7 a -4 5,0 a 5,0 a -5 5,0 a 5,0 a -6 5,0 a 4,3 a Cv (%) 6,89 16,2 Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si estatisticamente, pelo o teste de Tukey ao nível de significância de 5%.Tratamento pelo o método de infusão (I), tratamento pelo o método de decocção (D). Foram observado efeito de concentração (doses) dos extratos, tanto para o extrato aquoso de pimenta-do-reino tratadas com método de (I) e (D), na germinação das sementes de alface. Nas maiores doses estes efeitos assemelham a ação de fitohomôrnios (MAIRESSE, 2005). Houve uma diminuição em média de 33,3% no comprimento da radícula de plântula de alface, quando estas foram tratadas com a concentração 10-1 e 10-4 do extrato de pimenta-do-reino, submetidas ao método de decocção (Tabela 3). Observou também uma diminuição em média de 26,6% o comprimento da radícula de plântula de alface, quando estas foram tratadas com a diluição 10-5 e 10-6 (Tabela 3), observando um efeito de dose. Já no folíolo, foi observada uma diminuição em média de 33,3%, quando tratadas com o extrato (D) na concentração 10-1, sendo que não foram observadas variações significativas quando as demais concentrações foram comparadas ao controle. (Tabela 3). 26

Tabela 3. Comprimento da radícula e do folículo de plântulas de alface, submetida ao tratamento com extrato aquoso de pimenta-do-reino (infusão I e decocção D) em diferentes concentrações, Anápolis- Go. Concentrações Alface (D) Alface (I) Radícula (cm) Folíolo (cm) Radícula (cm) Folíolo (cm) Controle 1,5 a 1,5 a 1,5 ab 1,5 a -1 1,0 b 1,0 c 1,4 b 1,4 a -2 1,5 a 1,6 a 1,4 b 1,5 a -3 1,3 ab 1,4 ab 1,7 a 1,5 a -4 1,0 b 1,3 b 1,5 ab 1,5 a -5 1,1 ab 1,5 a 1,6 ab 1,4 a -6 1,1 ab 1,3 b 1,4 b 1,6 a Cv (%) 24,6 13,37 18,27 14,96 Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si estatisticamente, pelo o teste de Tukey ao nível de significância de 5%.Tratamento pelo o método de infusão (I), tratamento pelo o método de decocção (D). Observou-se um aumento em média de 11,8% e 6,2% no comprimento da radícula de plântula de alface, quando estas foram tratadas com a concentração 10-3 e 10-5 do extrato de pimenta-do-reino, respectivamente, submetidas ao método de infusão. Já no folíolo das plântulas de alface não foram observadas variações significativas das demais concentrações quando estas foram comparadas ao controle (Tabela 3). O mesmo resultado foi observado por Carvalho & Silva (2009), onde não ocorreram alterações na parte aérea da planta de girassol (Helianthus annuus L.) quando tratada com extrato aquoso de carqueja (Baccharis trimera). Foram observados efeitos significativos na inibição no comprimento das radículas e dos folíolos de plântulas de rabanete, quando tratadas com o extrato aquoso de pimenta-do-reino, pelo o método de infusão e decocção nas sementes de rabanete, principalmente na concentração 10-1. Pelos os resultados foi possível também observar que o extrato (D) promoveu alterações mais pronunciadas no desenvolvimento das plântulas de rabanete do que o extrato (I) (Tabela 4). 27

Tabela 4. Comprimento da radícula e do folículo de plântulas de rabanete, submetida ao tratamento com extrato aquoso de pimenta-do-reino (infusão I e decocção D) em diferentes concentrações, Anápolis-Go. Concentrações Rabanete (D) Rabanete (I) Radícula (cm) Folíolo (cm) Radícula (cm) Folíolo (cm) Controle 2,6 a 2,2 a 2,6 a 2,2 ab -1 1,0 c 1,2 b 1,2 c 1,5 b -2 1,9 ab 2,3 a 1,5 bc 2,0 ab -3 2,1 ab 2,3 a 1,9 abc 2,2 ab -4 2,0 ab 2,1 a 2,3 a 2,2 ab -5 2,2 ab 2,2 a 2,1 ab 2,4 a -6 1,8 b 2,2a 2,1 a 2,1 ab Cv (%) 25,3 12,21 27,28 25,99 Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si estatisticamente, pelo o teste de Tukey ao nível de significância de 5%.Tratamento pelo o método de infusão (I), tratamento pelo o método de decocção (D). Na Tabela 4, observou uma diminuição em média de 61,5% e 15,4% no comprimento da radícula de plântula de rabanete, quando estas foram tratadas nas concentrações 10-1 e 10-6 do extrato de pimenta-do-reino, submetido ao método de decocção. Da mesma forma, os extratos aquosos de folhas e frutos de eucalipto (Eucalyptus saligna Smith) aplicados nas concentrações de 5%, 10% e 15% sobre as plantas daninhas: picão (Bidens pilosa L.) e picão-branco (Galinsoga parviflora Cav.) reduziram o comprimento da radícula das plântulas (COMITTO, 2006). No comprimento do folíolo da plântula de rabanete, observou-se apenas uma diminuição de 45,4% quando esta foi tratada com a concentração 10-1 do extrato aquoso de pimenta-do-reino submetida ao método de decocção. Não foram observadas nas demais concentrações variações significativas dos tratamentos quanto comparadas com controle (Tabela 4). Houve uma diminuição média de 53,8% e de19,2% no comprimento da radícula de plântula de rabanete, quando estas foram tratadas com a concentração 10-1 e 10-6 respectivamente, do extrato de pimenta-do-reino, submetido ao método de infusão (Tabela 4). 28

Estes resultados são semelhantes aos obtidos por Rosado et al. (2009), com o extrato aquoso de manjericão (Ocimum basilicum L), a dose de 1% provocou um efeito de inibição no comprimento das raízes de sementes melissa. Foi observada na tabela 4, uma diminuição em média de 31,8% no comprimento do folíolo de plântula de rabanete, tratadas com a concentração 10-1 do extrato de pimenta-do-reino, submetido ao método de infusão. Houve um aumento em média de 8,3% no comprimento do folíolo de plântula de rabanete, quando esta foi tratada com a concentração 10-5 do extrato de (I) de pimenta-do-reino. Na germinação das sementes de alface e rabanete, quando tratadas com extrato alcoólico de pimenta-do-reino, não observado efeito inibitório drásticos sobre a germinação de sementes de alface e rabanete (Tabela 5). Observou-se uma diminuição média entre 29,8% e 21,3% na germinação de sementes de rabanete quando estas foram tratadas entre as concentrações 10-2 e 10-6 do extrato alcoólico de pimenta-do-reino, respectivamente. Nas demais concentrações, não foram observadas variações significativas dos demais tratamentos quanto comparadas com controle (Tabela 5). Tabela 5. Percentagem média de germinação (%) em semente de alface e rabanete, em diferentes concentrações de extrato alcoólico de pimenta-do-reino, com diluição seriada em água, Anápolis-Go. Concentrações Rabanete Alface Controle 4,7 a 14,3 a -2 3,3 a 14,7 a -3 4,3 a 15,0 a -4 4,7 a 15,0 a -5 3,7 a 15,0 a -6 3,3 a 15,0 a CV (%) 9,47 2,25 Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si estatisticamente, pelo o teste de Tukey ao nível de significância de 5%. Extrato alcoólico de pimenta-do-reino. Este resultado está semelhante ao obtido por Mazzafera (2003), que observou o efeito dos extratos alcoólicos de cravo-da- ínidia nas concentrações 31 e 62 mg.ml -1 causando inibição da germinação de sementes de tomate. 29

Houve um aumento significativo no comprimento do folíolo de rabanete em todas as concentrações para o controle, quando submetidas ao extrato alcoólico de pimenta-do-reino (Tabela 6). Tabela 6. Crescimento da radícula e do folículo de plântulas de alface e rabanete, submetidas a diferentes concentrações extrato alcoólico de pimenta-do-reino, com diluição seriada em água, crescidas durante 5 dias para a semente de rabanete e 7 dias para a semente de alface, Anápolis- Go. Concentrações Rabanete Alface Radícula (cm) Folíolo (cm) Radícula (cm) Folíolo (cm) Controle 2,8 bc 2,0 c 4,4 a 1,7 bc -2 1,5 c 2,7abc 1,3 c 1,1 d -3 3,9 abc 3,5 ab 1,4 c 1,8 bc -4 2,2 c 2,5 bc 2,4 b 2,2 a -5 6,0 a 4,3 a 2,7 b 1,6 c -6 4,9 ab 3,8 ab 4,6 a 1,9 b Cv (%) 26,82 17,45 12,78 8,43 Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si estatisticamente, pelo o teste de Tukey ao nível de significância de 5%.Extrato alcoólico de pimenta-do-reino, com tratamento aquoso. Na tabela 6, observou-se uma diminuição em média de 46,4% e 21,4% no comprimento da radícula da plântula de rabanete, quando estas foram tratadas com a concentração 10-2 e 10-4 respectivamente, do extrato alcoólico de pimenta-do-reino. Houve um aumento significativo de 39,3% para a concentração 10-3, 14,0% para a concentração 10-5 e 75,0% para a concentração 10-6 no comprimento da radícula da plântula de rabanete, tratadas com extrato alcoólico de pimenta-do-reino. Foi observado um efeito alelopático de indução no comprimento do folíolo da plântula de rabanete, tratadas com a concentração 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 e 10-6 do extrato alcoólico de pimenta-do-reino (Tabela 6). No comprimento da radícula da plântula de alface, observou-se uma diminuição significativa em média de 70,4% e 68,2%, quando estas foram tratadas com a concentração 10-2 e 10-3 respectivamente, do extrato alcoólico de pimenta-do-reino (Tabela 6). Os resultados obtidos foram são semelhantes aos Pawlowski e Soares (2007), no qual o extrato alcoólico de folhas de assobiadeira (S. polygamus) e aroeira (S. 30

Terebenthifolius), inibiram o comprimento das plântulas de alface, sendo essa diminuição superior a 95% em ambas as espécies utilizadas Foram também observadas diminuições de 35,3% no comprimento do folíolo de plântula de alface, quando estas foram tratadas com a concentração 10-2 do extrato alcoólico de pimenta-do-reino. Houve um aumento de 29,4% e 11,8% no comprimento do folíolo de plântula de alface, quando estas foram tratadas com a concentração 10-4 e 10-6 do extrato alcoólico de pimenta-do-reino. Nas demais concentrações não foram observadas variações significativas dos tratamentos quanto comparadas com controle (Tabela 6). Este resultado foi semelhante ao obtido por Tatibana e colaboradores (2003), testando o extrato alcoólico de viuvinha (Chomelia obtusa) no crescimento do folíolo das plântulas de alface. Neste trabalho foi observado um efeito indutivo nas amostras tratadas com o extrato de viuvinha, sendo os maiores valores obtidos nos tratamentos de 500 e 2000µg ml -1 os mais efetivos. As diluições mais concentradas dos extratos aquosos (I e D) de pimenta-do-reino afetaram negativamente a germinação tanto para as sementes de alface quanto de rabanete. Já no extrato alcoólico de pimenta-do-reino não foram observado alterações significativas quando comparado com os extratos aquosos. Os resultados obtidos foram semelhantes aos de Souza e colaboradores (2005), onde o aumento da concentração do extrato aquoso de guaco (Mikania glomerata), marcela (Achyrocline satureioides) e chá-de-bugre (Casearia. Sylvestris) levaram a um decréscimo nos valores da germinação de sementes de alface, até concentrações próximas a 30 mg/ml. Os resultados são semelhantes aos obtidos por Gorla e Perez (1997), no qual extratos de maiores concentrações de Miconia albicans Triana, e Lantana camara L. diminuíram as taxas de germinação de sementes de tomate. Foi verificado o efeito alelopático do extrato aquoso (I e D) de pimenta-do-reino (Piper nigrum), pois o aumento das concentrações promoveu uma diminuição da percentagem de germinação de sementes de alface e rabanete. Gatti e colaboradores (2004), em estudos sobre o efeito alelopático do extrato obtido das folhas de papo-de-peru (Aristolochia esperanzae O. Kuntze) sobre a germinação de sementes de alface e de rabanete, observou que o extrato aquoso obtido das folhas 31

inibiu a germinação das sementes nos bioensaios, com o aumento das concentrações analisadas. Foi observado efeito de concentração (doses), tanto para o extrato aquoso (I e D) quanto para o extrato alcoólico de pimenta-do-reino, podendo acarretar efeitos alelopáticos. Esses resultados estão de acordo com os encontrados por Reigosa e colaboradores (1999), onde relatam que os efeitos dos aleloquímicos nos diferentes processos fisiológicos de uma planta são dependentes das concentrações, ou ao menos, se espera que sejam. Umas observações a ser analisada foram o aumento significativo médio do comprimento do folíolo e radícula do rabanete, quando submetidas ao extrato aquoso (I e D) e alcoólico de pimenta-do-reino, observando um efeito semelhante aos alcalóides com a ação de fitohormônios (MAIRESSE, 2005). De acordo Periotto e colaboradores (2004) utilizando extratos de caules e de folhas de Andira humilis, na concentração 16% (p/v), foram observadas efeitos inibitórios significativos na porcentagem de germinação de sementes de alface e rabanete. Para sementes de rabanete, apenas extratos de caule a 16% provocaram efeitos inibitórios, sendo que as demais concentrações não provocaram alterações inibitórias nas sementes de alface e rabanete quando comparados com o controle. De acordo com os testes fitoquímicos realizados, houve o resultado positivo para a presença de alcalóides nos dois tipos de extratos testados. Como o principal alcalóide presentes na pimenta-do-reino é a piperina, este pode justificar as inibições ocorridas nas maiores concentrações testadas, sendo que foi observado um efeito de dose (Tabela 7). Tabela 7- Resultado do teste fitoquímico, realizado nos extratos aquosos e alcoólicos de pimenta-doreino. TESTE RESULTADO Saponina Ácidos orgânicos Açúcares redutores Alcalóides Purinas Flavonóides Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo 32

Dentre as classes de alcalóides, existe a auxina (ácido indol- 3 acético), ela é sintetizada principalmente do triptofano. A auxina é um fitohormônio, ou seja, são substâncias orgânicas que desempenham uma função principal na regulação fisiológica da planta, podendo ser um estimulante do desenvolvimento da planta dependendo da concentração (RAVEN, 2001). A elevada concentração de auxina pode acarretar a diminuição plântula e em concentrações mais baixas à auxina pode induzir o crescimento da plântula. Sendo que a radícula e folíolo de uma mesma planta reagem diferentemente ao mesmo hormônio. A dose ótima para o crescimento da radícula é diferente à dose ótima para o crescimento do folíolo (RAVEN, 2001). Um aspecto da alelopatia é o efeito de sinergia, que nos leva a acreditar que haja uma sinergia entre os compostos dos extratos, como proposto por Dyer e colaboradores (2004). Os dados apresentados não estabelecem a natureza dos compostos responsáveis pela a ação alelopática de inibição e/ou indução da germinação e crescimento de plântulas de alface e rabanete, porém estudos realizados com a pimenta-do-reino demonstram que a mesma é rica em compostos alcalóides e óleos essenciais, substâncias que podem ser responsáveis pela a ação verificada. Mas somente estudos de caracterização química dos extratos poderão provar esta suposição. 4. CONCLUSÃO Os sobre o efeito na germinação e crescimento em plântulas de alface (Lactuca sativa L.) e rabanete (Raphanus sativus L.) tratadas com extratos aquosos e alcoólicos de pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) possibilitaram a discutir e concluir que: Há um efeito alelopático de inibição na germinação de sementes de alface e rabanete, tratadas com extrato aquoso (D e I), sendo que as maiores concentrações exibiram grande redução na germinação em ambas as espécies. Pelos resultados obtidos para plântula de alface, houve uma resposta diferencial promovidos pelo extrato aquoso (D) de pimenta-do-reino, tanto 33