HEPATOTOXICIDADE DO BISFENOL A EM RATOS PRÉ-PÚBERES E ADULTOS Gabriel Machado Longhini (PIBIC/Fundação Araucária), Letícia Barbosa Gaiotte 1, Philippe Rodrigues Benedetti 1, João Paulo Ferreira Schoffen 1, Glaura Scantamburlo Alves Fernandes 2, Fábio Rodrigues Ferreira Seiva 1, Fabiano Gonçalves Costa 1 (Orientador), e-mail: machado.longhini@gmail.com 1 Universidade Estadual do Norte do Paraná/Campus Luiz Meneghel. 2 Universidade Estadual de Londrina. Ciências Biológicas Bioquímica (Metabolismo e bioenergética) Palavras-chave: BPA; Antioxidantes; Fígado. Resumo: O bisfenol A (BPA) é utilizado na fabricação de plásticos, resinas e está relacionado com alterações metabólicas e histopatológicas no fígado. A exposição ao BPA gera espécies reativas de oxigênio que, em excesso, levam ao estresse oxidativo. O objetivo do trabalho foi investigar o estresse oxidativo causado pela exposição ao BPA em ratos pré-puberes e avaliar a histologia hepática em ratos adultos que receberam BPA. Foram utilizados 30 ratos Wistar em idade pré-puberal e 28 ratos adultos que além do BPA receberam extrato de pata de vaca afim de evitar os danos causados pelo bisfenol A. Além da histologia foram determinadas a atividade de enzimas antioxidantes no tecido hepático. Os resultados foram discutidos com p<0,05. O peso corpóreo final, ganho de peso e o peso do fígado foram maiores no grupo BPA200 em relação ao grupo C. A atividade da catalase foi maior no grupo BPA200 comparada ao grupo C. A atividade da enzima superóxido dismutase foi menor nos dois grupos tratados com BPA. Os grupos tratados com extrato de pata-de-vaca apresentaram um aumento no número de células de Kupffer. A oferta de bisfenol A nas duas doses testadas causou alterações no padrão de atividade enzimática hepática. O tratamento com pata-devaca alterou o número de células de Kupffer no fígado. Introdução O bisfenol A (BPA) é um composto utilizado na fabricação de plásticos e resinas que, devido a sua capacidade de se ligar a receptores estrogênicos, agindo tanto como um agonista quanto antagonista de hormônios naturais, é considerado um desregulador endócrino. A exposição ao BPA é causada pelo consumo indireto uma vez que o BPA é encontrado, por exemplo, em mamadeiras, recipientes de alimentos, enlatados e selantes dentários (Olea et al., 1996) e um dos efeitos associados à exposição ao BPA é a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) que, quando em desequilíbrio no organismo, causam efeitos prejudiciais tais como a peroxidação dos lipídios de membrana e agressão às proteínas dos tecidos e das membranas, às enzimas, carboidratos e DNA (Kabuto et al., 2003). Um dos métodos encontrados pelo organismo para combater tais efeitos é neutralizar a ação destas EROs, neutralizando sua reatividade, utilizando enzimas antioxidantes, tais como a superóxido-dismutase e catalase, ou antioxidantes adquiridos pela dieta. O órgão responsável pelo metabolismo do BPA é o fígado. Efeitos hepatotóxicos e histopatológicos relacionados à sua exposição e a geração de EROs são observados em diversos modelos experimentais e em diferentes doses (Talness et al., 2009; Wu et al., 2011).
Material e métodos Grupos e delineamento experimental de ratos pré-púberes 30 ratos machos, Wistar, com idade inicial de 30 dias, provenientes do Biotério Central da Universidade Estadual de Londrina (UEL), foram distribuídos casualmente em três grupos experimentais (n=10 animais/grupo). Dois grupos de animais foram tratados com Bisfenol A nas doses de 20µg/Kg ou 200µg/Kg de peso corpóreo, via gavage, diariamente. O outro grupo (grupo controle) recebeu apenas o veículo (óleo de milho) em igual volume. O período de tratamento foi durante o período peripuberal - DPN 36 ao 66. Todos os animais tiveram seus pesos determinados a cada três dias e receberam água e ração ad libidum. Grupos e delineamento experimental de ratos adultos 28 ratos, Wistar, pesando em média 290 gramas, obtidos no Biotério Central da Universidade Estadual de Londrina (BC/UEL) foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos experimentais (n = 07 animais/grupo). Grupo I (Controle): recebeu solução salina (9%) na mesma dose de BPA; Grupo II (BPA): recebeu BPA, via gavage, na dose de 50 mg/kg peso/dia, intercalando com solução salina (9%), totalizando 30 dias, sendo 15 dias de BPA; Grupo III (Controle + Bauhinia forficata): Extrato de B. forficata (0,1ml/10g peso animal/dia) intercalado com solução salina (9%), totalizando 30 dias, sendo 15 dias de extrato de B. forficata; Grupo IV (BPA + B. forficata): BPA (50 mg/kg peso dia) mais extrato de B. forficata (0,1ml/10g peso animal/dia) em dias intercalados. O tratamento com B. forficata foi realizado durante 15 dias, igualmente o de BPA, totalizando 30 dias de período experimental. O extrato de B. forficata foi manipulado e obtido em farmácia especializada de manipulação de produtos naturais. O volume ofertado via gavage foi de 0,1ml/10g de peso/dia. Obtenção das amostras Após os períodos experimentais os ratos foram anestesiados com a associação de xilazina e ketamina, o seu fígado foi retirado e porções de ~200mg foram separadas e conservadas em nitrogênio líquido e, depois, armazenadas em -80ºC para as determinações bioquímicas teciduais. Determinações bioquímicas As amostras de tecido foram homogeneizadas com 2 ml de tampão fosfato de sódio 10mM, ph 7,4 por duas vezes, com um minuto de intervalo entre as sessões. Estes homogeneizados foram centrifugados a 8000 rpm por 10 minutos, em centrífuga refrigerada a 4 C e o sobrenadante utilizado para determinação de proteínas totais e análise da atividade de enzimas antioxidantes hepáticas. A atividade da superóxido dismutase (SOD, E.C. 1.15.1.1) foi determinada através da redução de azul de nitrotetrazólio (NBT) e a atividade enzimática da catalase (E.C. 1.11.1.6) foi determinada em tampão fosfato de potássio (50 mmol/l) e peróxido de hidrogênio (10 mmol/l). As análises foram realizadas no laboratório de histologia e genética da UENP-Campus Luiz Meneghel. Determinações histológicas Porções de aproximadamente 200mg do lobo esquerdo do fígado foram dissecadas e fixadas em Methacarn e, posteriormente, armazenadas em álcool absoluto. Os órgãos foram desidratados em série alcoólica de concentração crescente, diafanizados em xilol e incluídos em parafina. Os blocos foram cortados em micrótomo rotativo, com espessura de 7 μm. Os cortes foram coletados em lâminas, corados com Hematoxilina-Eosina (H.E.) e analisados em microscópio de luz Motic BA 410 acoplado a câmera digital (Moticam, 3.0 megapixels). O tecido hepático foi avaliado a partir de imagens capturadas de cada lâmina em objetiva de 20x, para a determinação das áreas dos vasos portais (em 25 imagens) e da veia central lobular (em 10 imagens), e objetiva de 40x para a determinação da área nuclear de 150 hepatócitos e contagem
do número de hepatócitos e células de Kupffer em 40 imagens de tecido hepático localizado ao redor da tríade portal. As análises foram realizadas no software Image Pro Plus 4.5 (Media Cybernetics, Inc). Avaliação e análise estatística dos resultados Os resultados encontrados são expressos como média ± desvio padrão. As comparações entre os grupos experimentais dos animais jovens e adultos foram feitas, respectivamente, por análise de variância (ANOVA) para um e dois fatores, complementada com o teste de Tuckey post hoc. O p adotado foi <0,05. Resultados e Discussão Durante o período de tratamento com o bisfenol A nenhum animal veio a óbito. Na tabela 1 são apresentados os dados referentes ao peso corpóreo, ganho de peso e peso do fígado dos animais pré-púberes. A figura 1 apresenta os dados referentes à concentração de proteínas totais no fígado, atividade enzimática da SOD e catalase. Nos três grupos o PF foi maior que PI, indicando que o BPA não causou perda de peso, inclusive, o BPA200 teve PF maior que o do grupo C. Corroborando com o peso final aumentado do grupo BPA200 está o ganho de peso, indicando que estes animais possivelmente tiveram maior consumo de ração. A dose de 200µg/kg, mas não a de 20µg/kg, causou também aumento do peso do fígado, o que pode indicar dano hepático causado diretamente pela exposição ao BPA ou por alguma alteração metabólica, secundária, que possa ter alcançado o fígado. Nosso estudo demonstrou que o tratamento com o bisfenol A foi capaz de diminuir significativamente a atividade enzimática da SOD. Em concordância com este achado, Wu et al. (2011) mostraram decréscimo significante nos níveis de SOD nos grupos tratados com o BPA. Estes achados foram considerados indicativos de dano tecidual. Os dados obtidos neste trabalho mostram aumento na atividade enzimática da catalase. Este aumento pode ter sido causado pelo aumento de seu substrato (H 2 O 2 ), resultado da ação de outras enzimas produtoras de peróxido de hidrogênio, tais como xantina, urato e monoaminas oxidases. Outra possível explicação é que o BPA diminuiu a atividade catalítica da glutationa peroxidase (GSH-Px), enzima que também é responsável pela conversão do H 2 O 2. Com essa diminuição, a catalase supriu essa demanda aumentando sua atividade. Hassam et al. (2012) mostraram decréscimo na atividade enzimática da GSHPx em ratos tratados com doses altas (50mg/kg) e relacionou essa diminuição como dano hepático causado pela perturbação do balanço da produção de EROs do organismo. A contagem de hepatócitos em ratos adultos (tabela 2) mostrou diferença significativa apontando um decréscimo no grupo PV+Pl se comparado ao grupo Controle. Os dois grupos que receberam pata de vaca apresentaram aumento significante no número de células de Kupffer em comparação com os grupos controle (Tabela 2). O tratamento com bisfenol A diminuiu significativamente a área de veias centro-lobulares de animais do grupo placebo (figura 2). Helal et al.(2013) utilizando doses mais baixas de BPA (10 e 30mg/kg), encontraram dilatação da veia centro-lobular. Outros achados histológicos já foram descritos em animais tratados com outras doses de BPA tais como dilatação de sinusóides, acompanhada de infiltração linfocitária e proliferação de células de Kupffer bem como congestão de veias centrais (HELAL et al., 2013). Nosso resultado pode ter sido causado pela dose mais baixa utilizada. O tratamento com pata de vaca aumentou o número de células de Kupffer, o que pode indicar um aumento no sistema de defesa do órgão, e esse aumento foi causado pelo tratamento com o extrato, visto que também houve aumento no grupo B+PV (Tabela 2).
Tabela 1 - Peso inicial (PI), peso final (PF), ganho de peso (GP) e peso do fígado (PFi) dos animais que receberam óleo de milho (C), bisfenol A 20µg/Kg (BP20) e bisfenol A 200µg/Kg (BP200). C BPA 20 BPA 200 PI (g) 84,71±6,3 83,18±8,5 91,66±11,0 PF (g) 225,28±23,3* 222,55±20,9* 251,99±15,0 a * GP (g) 140,56±23,6 139,36±16,9 160,32±9,4 ab PFi (g) 8,52±1,2 8,88±1,2 10,30±0,9 ab Dados expressos com média ± desvio padrão; p<0,05. Letras: a- difere significativamente do grupo C; b- difere significativamente do grupo BPA20. Símbolos: *- difere significativamente de PI. Tabela 2 - Área ramo veia portal (AV), área ramo artéria hepática (AA), área ramo ducto biliar (AD), área nuclear (AN), área veia centro-lobular (AVC), número de hepatócitos (NH) e número de células de Kupffer (NK) dos animais que receberam solução salina 9% (C+PL), bisfenol A 50mg/Kg (B+PL), 0,1ml/10g de extrato hidro alcoólico de pata-de-vaca e solução salina 9% (PV+PL) e bisfenol A 50mg/Kg e 0,1ml/10g de extrato hidro alcoólico de pata-de-vaca (B+PV). C+PL B+PL PV+PL B+PV AV (µm²) 6842.7±703.2 7302.7±319.1 7974.1±787.7 8018.3± 777.9 AA (µm²) 292.6±48.3 287.2±61.8 385.5±161.6 306.7±148.6 AD (µm²) 290.6±74.6 338.1±50.5 485.2±197.7 380.4±168.3 AN (µm²) 35.4±2.8 33.8±0.9 35.0±1.3 36.5±4.8 AVC (µm²) 3353±460.8 1905.8±490.2 a 2718.3±499.9 2044.5±439.9 NH 173.6±9.6 165.8±12.9 140.7±28.9 a 143.1±17.9 NK 4.0±0.6 3.7±0.5 5.2±0.5 a 5.5±0.6 b Dados expressos com média ± desvio padrão; p<0,05. Letras: a- difere significativamente do grupo C; b- difere significativamente do grupo B. NH e NK determinados a partir da contagem de células em área de aproximadamente 74 mm. A B C Figura 1 - Concentração de proteínas totais (A), atividade da enzima catalase (B) e atividade da enzima SOD no fígado de ratos tratados com óleo de milho (controle), com a dose de 20µg/kg de bisfenol A (BPA 20) e com a dose de 200µg/kg (BPA 200). Dados expressos como média±dp. p<0,05. Letra a: difere estatisticamente do grupo controle; Letra b: difere estatisticamente do grupo BPA-20.
Figura 2 - Fotomicrografias do tecido hepático mostrando a veia centro-lobular de ratos tratados com solução salina 9% (C+PL), bisfenol A 50mg/Kg (B+PL), 0,1ml/10g de extrato hidro alcoólico de pata-de-vaca e solução salina 9% (PV+PL) e bisfenol A 50mg/Kg e 0,1ml/10g de extrato hidro alcoólico de pata-de-vaca (B+PV). Letras: vc veia central. (H&E,x200). Conclusões Conclui-se, portanto, que em animais pré-púberes o tratamento com baixas doses de BPA alterou o perfil antioxidante enzimático hepático. Já em animais adultos, o BPA diminui o calibre de veias centrais no fígado e que o tratamento com B. forficata aumentou o número de células de Kupffer. Agradecimentos À Fundação Araucária pelo apoio financeiro e concessão de bolsa de Iniciação Científica e à Universidade Estadual do Norte do Paraná pela estrutura e conhecimento fornecidos. Referências HASSAN, Z. K.; ELOBEID, M. A.; VIRK, P.; OMER, S. A.; ELAMIN, M.; DAGHESTANI, M. H.; ALOLAYAN, E. M. Bisphenol A Induces Hepatotoxicity through Oxidative Stress in Rat Model. Hindawi Publishing Corporation. Oxid Med Cell Longev., 2012. HELAL, E. G. E.; BADAWI, M. M. M.; SOLIMAN, M. G.; ABDEL-KAWI, N. A.; FADEL, H. A. E.; ABOZAID, N. M. G. Physiological and Histopathological studies on Bisphenol-A compound as xenoestrogen in male albino rats. The Egyptian Journal of Hospital Medicine., v. 50, p. 127-136, 2013. KABUTO, H.; HASUIKE, S.; MINAGAWA, N.; SHISHIBORI, T. Effects of bisphenol A on the active oxygen species in mouse tissues. Environ. Res. v. 93, p. 31 35, 2003. OLEA, N.; PULGAR, R.; PÉREZ, P.; OLEA-SERRANO, F.; RIVAS, A.; NOVILLO-FERTRELL, A.; PEDRAZA, V.; SOTO, A. M.; SONNENSCHEIN, C. Estrogenicity of resin-based composites and sealants used in dentistry. Environ Health Perspect., v. 104, n. 3, p. 298-305, 1996. TALNESS, C. E.; ANDRADE, A. J. M.; KURIYAMA, S. N.; TAYLOR, J. A.; VOMSAAL, F. S. Components of plastic: experimental studies in animals and relevance for human health. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci., v. 364, p. 2079 2096, 2009. WU, M.; XU, H.; SHEN, Y.; QIU, W.; YANG, M. Oxidative stress in zebrafish embryos induced by short-term exposure to bisphenol A, nonylphenol, and their mixture. Environmental Toxicology and Chemistry. v. 30, p. 2335 2341, 2011.