TÍTULO: ENVOLVIMENTO DA AUTOFAGIA NA HIPERTROFIA DO MÚSCULO ESQUELÉTICO EM RATOS COM DIABETES MELLITUS TIPO 1

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1 TÍTULO: ENVOLVIMENTO DA AUTOFAGIA NA HIPERTROFIA DO MÚSCULO ESQUELÉTICO EM RATOS COM DIABETES MELLITUS TIPO 1 CATEGORIA: CONCLUÍDO ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: BIOMEDICINA INSTITUIÇÃO: CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS AUTOR(ES): MARIA VITORIA MARTINS SCERVINO ORIENTADOR(ES): MARCO AURÉLIO SALOMÃO FORTES, RUI CURI

2 1. RESUMO O processo autofágico é importante para a homeostase celular e manutenção da massa muscular esquelética. Há aumento da autofagia no músculo esquelético em estados catabólicos como diabetes e câncer. O estado diabético causa aumento da atividade proteolítica e redução da massa muscular, contudo, a resposta hipertrófica não é diminuída. No presente estudo, avaliou-se o envolvimento da autofagia após sete dias da indução de hipertrofia muscular por sobrecarga nos músculos extensor digital longo (EDL) e sóleo no início do estado diabético induzido por estreptozotocina em ratos. Neste período, a síntese de proteínas induzida por sobrecarga funcional alcança o pico de ativação. Proteínas marcadoras de etapas específicas da autofagia foram avaliadas por western blotting: p-ulk1, Beclin-1, Atg7, LC3 e p INTRODUÇÃO Cinco formas de autofagia estão descritas: macroautofagia, microautofagia, autofagia mediada por chaperonas, mitofagia e xenofagia. A macroautofagia (Figura 1) prevalece sobre as outras formas no músculo esquelético, sendo importante para a homeostase musculoesquelética. Esse tipo de autofagia consiste na captação de proteínas mal formadas/agregadas ou organelas danificadas por meio de membrana dupla que torna-se um autofagossomo e que se funde com o lisossomo formando o autolisossomo e promovendo a degradação do conteúdo captado por ação das enzimas lisossomais (hidrolases) (1, 2). Após o processo de degradação, permeases lisossomais exportam os aminoácidos e outros subprodutos para o citoplasma, onde podem ser reutilizados para a formação de macromoléculas ou serem metabolizados. Cada etapa do processo autofágico para ser finalizada de forma efetiva depende da interação entre proteínas sinalizadoras (3). Quando o complexo proteico mammalian target of rapamycin complex 1 (mtorc1) é ativado, ocorre aumento da tradução de proteínas miofibrilares e ganho de massa muscular (4). A AMP-activated protein kinase (AMPK) inibe o complexo mtorc1 e ao mesmo tempo ativa a proteína Unc-51-like kinase (ULK1) que fosforila os componentes do complexo dando início à autofagia (5). Em seguida, ocorre formação e extensão de uma membrana de isolamento por meio do complexo

3 phosphoinositide 3-kinase (PI3K) de classe III, do qual a proteína Beclin-1 faz parte (1, 2). A proteína Autophagy-related protein 7 (Atg7) promove interação entre Autophagy-related protein 5 (Atg5) e Autophagy-related protein 12 (Atg12), que formam o complexo Atg5-Atg12-Atg16L, responsável pelo transporte da membrana até a proteína malformada e/ou organela danificada, além de ser essencial para a conjugação da proteína Light chain 3 protein I (LC3-I) com a fosfatidiletalonamina para formar LC3-II. Nesse processo, a proteína Atg7 é responsável também pelo direcionamento da Autophagy-related protein 3 (Atg3) até a LC3-I, essencial para a finalização da conjugação (6). A LC3-II se associa à membrana de isolamento madura e ubiquitinas marcam o componente a ser englobado. Para que ocorra a ligação entre a membrana e o componente à ser digerido, é necessária a presença da proteína p62, também conhecida como sequestosome 1 (SQSTM1), que serve como molécula de adaptação e permite a ligação entre a LC3-II e as ubiquitinas e consequente formação do autofagossomo, que se desenvolve por fusão com o lisossomo e promove degradação do conteúdo autofagossomal. Após a degradação, aminoácidos e outros subprodutos retornam ao citoplasma e podem ser reutilizados (4, 7). Figura 1 Esquema representando as etapas da macroautofagia. A descrição dos mecanismos mostrados está no texto. Abreviaturas: RSL Retículo Sarcoplasmático Liso; RSR Retículo

4 Sarcoplasmático Rugoso; mtorc1 - mammal target of rapamycin complex 1; AMPK - AMP-activated protein kinase; ULK1 Unc-51-like kinase 1; Atg Autophagy-related protein; LC3 Light chain 3 protein; p62 Proteína SQSTM1 (sequestosome 1); PE Fosfatidiletanolamina. Artigos que subsidiaram a criação da figura: 2, 7, 8. A hipertrofia do músculo esquelético é uma resposta adaptativa ao exercício físico contra uma resistência, o que leva ao aumento na síntese e/ou diminuição na degradação de proteínas miofibrilares (9) e consequentemente aumento da massa muscular, permitindo geração de força (10). A autofagia é importante na homeostase celular e manutenção da massa muscular esquelética, o que indica sua importância no processo hipertrófico do músculo. No envelhecimento ocorre a diminuição do processo autofágico, levando à perda de atividade da célula (senescência) (11). Quando ocorre deficiência na produção de insulina, como no diabetes tipo I, a degradação proteica se torna mais elevada, acarretando em perda de massa muscular (12). Animais induzidos ao diabetes por estreptozotocina apresentam aumento da atividade proteolítica no músculo esquelético em curto prazo (até 3 dias) (13). Contudo, quando submetidos à sobrecarga, esses animais apresentam hipertrofia dos músculos na mesma magnitude que os animais normoglicêmicos (14). 3. OBJETIVO Investigar a participação da autofagia na hipertrofia dos músculos EDL e sóleo induzida por sobrecarga funcional em ratos no início do estado de diabetes mellitus tipo MÉTODOS Massa corporal, glicemia e consumo alimentar e hídrico dos ratos utilizados no estudo foram avaliados. Os animais foram induzidos ao diabetes mellitus tipo 1 por administração de estreptozotocina. O estímulo hipertrófico foi realizado por meio de cirurgia de ablação sinergista do músculo tibial anterior (hipertrofia do EDL) e tenotomia do músculo gastrocnêmio (hipertrofia do sóleo). Após a coleta dos músculos, foi realizada análise de western blot das proteínas relacionadas à autofagia. Os músculos EDL e sóleo tiveram a massa úmida e a seca determinadas.

5 5. DESENVOLVIMENTO Ratos Wistar (4 semanas, 200±50 gramas) foram induzidos ao estado diabético (DM) por injeção endovenosa (veia peniana) de estreptozotocina (65 mg/kg de massa corporal i.v.) e os animais controles (CTRL) foram injetados com volume equivalente de tampão citrato (ph 4,2) pela mesma via. Um grupo de animais (n=20, 10 CTRL e 10 DM) foi submetido à cirurgia de ablação sinergista do músculo tibial anterior para hipertrofia do músculo EDL (Extensor Digital Longo) e outro grupo (n=20, 10 CTRL e 10 DM) à tenotomia do músculo gastrocnêmio, induzindo hipertrofia no músculo sóleo. Os músculos foram mantidos em sobrecarga durante 7 dias. As cirurgias foram realizadas apenas nas patas esquerdas dos animais (H), enquanto na direita foi realizada simulação para se obter os valores de controle das patas contralaterais (CL). Massa corporal, glicemia e consumo alimentar e hídrico dos animais foram avaliados. As proteínas da via autofágica p-ulk1, Beclin-1, Atg7, LC3 e p62 foram avaliadas por western blot. Os músculos retirados tiveram a massa úmida e seca determinada em balança de precisão. Os resultados estão apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) e foram analisados pelo teste t de Student (para comparação entre dois grupos) ou por análise de variância de duas vias (Two-way ANOVA) seguida pelo pós-teste de Bonferroni. As diferenças entre os resultados foram consideradas significativas para valores de p < 0, RESULTADOS A massa corporal do grupo CTRL aumentou enquanto que no grupo DM teve redução de 16% no mesmo período. No grupo DM, a glicemia aumentou e se manteve elevada ao longo de todo o período experimental (443 mg/dl em média), comparado ao grupo CTRL (113 mg/dl em média). Os animais diabéticos apresentaram ingestão hídrica e consumo alimentar elevados (112 ml e 11 gramas a mais que os controles por dia, respectivamente). As massas úmida e seca de ambos os músculos aumentaram significativamente na mesma magnitude nos grupos diabético e controle (± 8 e 10% no EDL dos grupos CTRL e DM, respectivamente; e ± 20 e 23% no sóleo dos grupos CTRL e DM, respectivamente) em função da hipertrofia. Comparando os músculos contralaterais dos grupos diabético e controle, em sete dias de sobrecarga, o estado

6 diabético por si só não altera os conteúdos das proteínas avaliadas nos músculos EDL e sóleo. No músculo EDL, os conteúdos das proteínas avaliadas não se alteraram devido apenas ao estado diabético. Na hipertrofia, houve aumento no conteúdo das seguintes proteínas: p-ulk1 do grupo controle: 62%, Beclin-1: 83% no grupo controle e 53% no grupo diabético, Atg7: 91% no grupo controle e 75% no diabético, LC3-I do grupo controle: 96% e LC3-II: 46% no grupo controle e 28% no diabético. Quando comparados os músculos EDL submetidos à sobrecarga, o conteúdo de LC3-I sendo 36% maior no grupo controle em relação ao diabético. No músculo sóleo, do mesmo modo, não houve alteração nos conteúdos das proteínas avaliadas no estado hiperglicêmico. Em resposta ao estímulo hipertrófico, houve aumento no conteúdo das seguintes proteínas: p-ulk1 do grupo controle: 2,2 vezes, Beclin-1: 2,1 vezes no grupo controle e 96% no diabético, Atg7: 2,3 vezes no grupo controle e 83% no diabético, LC3-I: 2 vezes nos grupos diabético e controle, LC3-II: 70% no grupo controle e 2,1 vezes no diabético e p62: 47% no grupo controle e 37% no diabético. Nos músculos sóleo submetidos à hipertrofia, o conteúdo de Atg7 foi 32% maior no grupo controle em relação ao diabético. 7. DISCUSSÃO O diabetes mellitus tipo 1 está associado à muitas complicações ocorrendo perda de massa muscular após somente quatro semanas do diagnóstico em pacientes (15). No presente estudo, os animais diabéticos apresentaram redução de 16% na massa corporal e de 24% na massa seca dos músculos EDL e sóleo, corroborando observações anteriores (16). O estímulo hipertrófico elevou a massa seca do músculo sóleo nos ratos diabéticos em 23%, enquanto que no músculo EDL foi de 10%. O músculo sóleo dos animais diabéticos sofreu menos impacto do estado diabético do que o EDL frente ao estímulo hipertrófico. Esse resultado corrobora achados anteriores de que fibras oxidativas são mais resistentes à perda de função do que as glicolíticas no estado diabético (14, 17). Fortes e colaboradores (2015) demonstraram que, apesar do efeito do diabetes mellitus tipo 1 na perda de músculo esquelético ser pronunciado, os

7 músculos EDL e sóleo de ratos hiperglicêmicos sofrem hipertrofia de mesma magnitude que em ratos controles quando submetidos à sobrecarga por 30 dias. A hipertrofia foi acompanhada de melhora na função e aumento na produção de força (14). Resposta semelhante foi encontrada no presente estudo que consistiu em 7 dias de sobrecarga aplicada de forma concomitante com o estabelecimento do estado diabético. É importante considerar que nos músculos EDL e sóleo, os conteúdos das proteínas avaliadas não se alteraram mediante hiperglicemia somente, sem sobrecarga funcional, indicando que a autofagia não é alterada pelo diabetes no período estudado. Fortes e colaboradores (2015) também constataram que a sobrecarga dos músculos EDL e sóleo aumenta a fosforilação da proteína Akt nos grupos controles e diabéticos (14). A ativação de Akt é um dos mais potentes inibidores da autofagia. Assim, esperava-se que o conteúdo de p-ulk1 permanecesse em valor semelhante ao controle na vigência de estímulo hipertrófico. Contudo, observou-se que, nessa condição, os músculos EDL e sóleo do grupo controle sofreram aumento no conteúdo da proteína p-ulk1. O conteúdo dessa proteína no grupo diabético permaneceu inalterado, indicando que nesse estado a ativação da autofagia por essa via não responde como esperado e o grupo controle, apesar de apresentar aumento na fosforilação de Akt, teve elevação no conteúdo de p-ulk1 quando submetido à sobrecarga. É possível que, com o aumento na síntese de proteínas devido ao estímulo hipertrófico, a produção de proteínas mal formadas e agregadas se torna mais elevada. Assim, a autofagia desempenha função importante na remoção de proteínas mal formadas que interferem na função das células, mantendo a sua integridade (18). Há redução da eficiência da atividade muscular nos camundongos com autofagia deficiente (19). Masiero e colaboradores (2009) observaram que animais knockout para Atg7 apresentam miopatia, com desalinhamento de banda A e linha Z, assim como número mais elevado de mitocôndrias com estruturas membranosas junto à formação de agregados proteicos. Além disso, a ausência de Atg7 causa redução de 20 a 40% na área da secção transversa do músculo (20). O aumento da proteína Atg7, nos músculos EDL e sóleo submetidos à sobrecarga, indica função

8 importante da autofagia na manutenção da massa muscular durante a hipertrofia, sendo crucial inclusive para a execução do processo de conjugação da LC3 e no direcionamento até a estrutura a ser fagocitada. O animal controle apresentou maior conteúdo de Atg7 no músculo sóleo hipertrofiado quando comparado ao músculo do diabético. A presença das proteínas LC3-I e II e sua razão refletem o fluxo autofágico no músculo esquelético (21) que está relacionado com a ativação da proteína AMPK e inibição das proteínas mtor e Akt. Lira e colaboradores observaram fluxo autofágico basal aumentado nas fibras oxidativas mas não nas glicolíticas (4, 21). O aumento nos conteúdos de LC3-I e II mediante hipertrofia nos grupos controles foi mais pronunciado no músculo sóleo. No músculo EDL hipertrofiado, houve aumento de LC3-II nos animais diabéticos e controles, mas o conteúdo de LC3-I aumentou apenas no controle submetido à hipertrofia, mantendo-se em níveis basais no diabético. No músculo sóleo do grupo diabético, o conteúdo de ambas proteínas se mostrou mais elevado na hipertrofia. A razão LC3-II/LC3-I não foi diferente nos músculos dos grupos estudados, indicando que a autofagia se mantém constante durante o processo de hipertrofia em condições normo- e hiperglicêmicas. A regulação de LC3 no músculo esquelético não é importante na indução de autofagia e sim na sua progressão e manutenção (22). No músculo EDL hipertrofiado, não houve alteração nos conteúdos da proteína p62 nos dois grupos. No músculo sóleo hipertrofiado, nos dois grupos, houve aumento no conteúdo de p62. A elevação dessa proteína indica inibição do processo autofágico. Quando o conteúdo de p62 permanece constante no tecido, a autofagia é mais elevada (19, 22, 23). Na atrofia muscular ocorre aumento do mrna de p62 (24). A atividade autofágica não se altera porque a p62 é degradada durante o processo autofágico (25). O aumento no conteúdo de p62 no músculo sóleo hipertrofiado não reduz o processo autofágico. Levando em conta que há elevação acentuada das proteínas p-ulk1, Beclin-1, Atg7, LC3 I e II e p62 no músculo sóleo comparado ao EDL, a elevação de p62 seria um mecanismo de compensação. O aumento dos conteúdos das proteínas da via autofágica e do processo autofágico deve-se ao fato de que quando há estresse no músculo esquelético causado pela sobrecarga, a síntese e degradação de proteínas aumentam,

9 resultando em elevação de proteínas danificadas, que devem ser removidas de forma eficiente para evitar o estresse celular, a citotoxicidade e a formação de agregados (26). 8. CONSIDERAÇÕES FINAIS O estado diabético por si só não afeta a autofagia nos músculos EDL e sóleo. Na vigência de hipertrofia, houve aumento das proteínas p-ulk1, Beclin-1, Atg7, LC3 e p62, sendo este mais pronunciado no músculo sóleo que se mostrou mais resistente à perda de função que o EDL. 9. FONTES CONSULTADAS 1. Glick D, Barth S, Macleod KF (2010) Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol 221(1): Mizushima N, Yoshimori T, Ohsumi Y (2011) The Role of Atg Proteins in Autophagosome Formation. Annu Rev Cell Dev Biol 27(1): Béchet D, Tassa A, Combaret L, Taillandier D, Attaix D (2005) Regulation of skeletal muscle proteolysis by amino acids. J Ren Nutr 15(1): Sandri M (2010) Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett 584(7): Wong PM, Puente C, Ganley IG, Jiang X (2013) The ULK1 complex sensing nutrient signals for autophagy activation. Autophagy 9(2): Tanida I, Tanida-Miyake E, Ueno T, Kominami E (2001) The human homolog of Saccharomyces cerevisiae Apg7p is a protein-activating enzyme for multiple substrates including human Apg12p, GATE-16, GABARAP, and MAP-LC3. J Biol Chem 276(3): Lamb CA, Yoshimori T, Tooze SA (2013) The autophagosome: origins unknown, biogenesis complex. Nat Rev Mol Cell Biol 14(12): Levine B, Mizushima N, Virgin HW (2011) Autophagy in immunity and inflammation. Nature 469(7330):

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