Avanços na edição genética (CRISPR-Cas9 e outros) Martín Bonamino, FIOCRUZ/INCA
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- Geraldo Leal Gorjão
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1 Avanços na edição genética (CRISPR-Cas9 e outros) Martín Bonamino, FIOCRUZ/INCA
2 Perspectiva histórica Como chegamos aqui? Da genética mendeliana.. à edição genética de genomas
3 Engenharia Genética Qualquer mudança no conteúdo genético de organismos que resulte de manipulação direta do DNA
4 1953 James Watson e Francis Crick propuseram a estrutura em dupla hélice do DNA (Nobel de Fisiologia ou Medicina, 1962) 1860 Friedrish Micescher - identificação do DNA Phoebus Levene e Erwin Chargaff DNA é formado de nucleotídeos e nucleotídeos por fosfato, açúcar e base nitrogenada Cristalografia e difração de raio X por Rosalind Franklin and Maurice Wilkins Final dos anos 1960 Stewart Linn & Werner Arber descobriram enzimas de restrição em E. coli (Nobel de Fisiologia ou Medicina, 1978) Abriu portas para o inicio da manipulação física do DNA 1977 Frederick Sanger desenvolveu o primeiro método de sequenciamento do DNA Permitiu conhecer as sequencias para manipulá-las 1983 Kary Mullis, um bioquímico inventou a "reação em cadeia da polimerase o PCR (Nobel de Fisiologia ou Medicina, 1993) Permite copiar e amplificar pedaços do DNA, o q é crítico para detecção e manipulação do mesmo 2003 genoma humano sequenciado Conhecimento de toda a sequencia de DNA, comparações evolutivas e a possibilidade de manipulação de qualquer sequência
5 A tecnologia atual permite modificações altamente específicas do genoma com eficiência e especificidade Chaves para estas técnicas são: Mecanismos de reparo do DNA celular Proteínas ou ácidos nucleicos que reconhecem sequencias específicas do DNA Enzimas que cortam o DNA
6 Natureza do DNA permite o uso da fita íntegra como molde
7 Natureza do DNA permite o uso da fita íntegra como molde
8 Recombinação Homóloga
9 Reparo da quebra de dupla fita: presença ou ausência de molde
10 Edição Genética visão e aplicações Uma nova forma de interferir geneticamente nos organismos
11 Edição Genética Requisitos - Reconhecimento de sequencias específicas no DNA - Enzimas capazes de cortar o DNA
12 Nuclease Enzima capaz de quebrar ligação fosfodiéster entre as subunidades de nucleotídeos no ácido nucléico
13 Reconhecimento de sequencias de DNA Fatores de transcrição Domínios dedo de zinco
14 Diferentes domínios dedo-de-zinco reconhecem Sequências de DNA diferentes
15 Clivagem específica da nuclease pode ser alterada fusionando-se domínios de ligação ao DNA
16 Zinc Finger Nucleases clivagem sítio dirigida
17 TALENS clivagem sítio dirigida
18 Modulos de TALE ligam a sequências específicas de DNA RVDs
19 TALEN X ZFN
20 Para que serve cortar o DNA em sítios específicos?
21 O sistema CRISPR/Cas9
22 Tipos de CRISPR
23 CRISPR: de sistema de defesa a ferramenta biotecnológica
24 O sistema CRISPR/Cas9
25 O sistema CRISPR/Cas9 CRISPR em ação
26 CRISP/CAS9 Vetor Plasmid used for Genome Editing Insert Target Seq
27 Riscos Edição Genômica efeitos off target Há possibilidade de reconhecimento de sítios off target
28 Não só de editar o genoma vive a ferramenta CRISPR
29 Não só de editar o genoma vive a ferramenta CRISPR
30 Nova ferramenta para descoberta de genes associados a determinado fenótipo Expansão do toolbox Cas9
31 Não só de editar o genoma vive a ferramenta CRISPR Implicações para circuitos de biologia sintética
32 Não só de editar o genoma vive a ferramenta CRISPR
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34 Outros CRISPRs
35 Não só de editar o genoma vive a ferramenta CRISPR Fig. 1. SHERLOCK is capable of single-molecule nucleic acid detection. (A) Schematic of SHERLOCK. dsdna, double-stranded DNA; RT-RPA, reverse transcriptase RPA. (B) Schematic of ssrna target detected with the Cas13a collateral detection.the target site is highlighted in blue. (C) Cas13a detection of RNAwith RPA amplification (SHERLOCK) can detect ssrnatarget at concentrations down to ~2 am, moresensitive than Cas13aalone. n = 4 technical replicates; bars represent mean ± SEM. (D) SHERLOCK is also capable of single-molecule DNA detection. n = 4 technical replicates; bars represent mean ± SEM. Gootenberg et al., Science 356, (2017) 28 April of 5
36 A explosão da utilização do sistema CRISPR
37 Aplicações da edição genética Ferramenta de ampla utilização em - Pesquisa - Biotecnologia Riscos e benefícios - Terapia
38 Aplicações da edição genética genética de populações
39 Aplicações da edição genética biotecnologia vegetal
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43 Aplicações da edição genética Medicina regenerativa
44 Aplicações da edição genética medicina regenerativa Edição genética de células tronco (ES, ips)
45 Aplicações da edição genética medicina regenerativa Edição genética de células tronco (ES, ips)
46 Aplicações da edição genética medicina regenerativa
47 Primeiro registro do uso dessa técnica em embriões humanos β-globin gene (HBB) = codifica uma subunidade da hemoglobina (mutado na Thalasemia) Embriões triplonucleares (não viáveis)
48 Aplicações da edição genética medicina regenerativa Edição genética para exon skipping dyst Cas9 bar Aste from Fig edi and (a) sec dys the Sta rec in a exp sho res trea red fibe view pow imp forc as con trea also res rep con Ove AN sign sha First release: 31 December (Page number
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50 Aplicações da edição genética medicina regenerativa
51 Terapia Gênica Passado e presente
52 Aplicações clínicas terapia gênica 2.0 Imunodeficiencias AIDS Leucemia
53 Imunodeficiencias
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58 Modificações genéticas sem controle da inserção Risco de tumorigênese alteração sítio dirigida
59 Aplicações da edição genética (ZFN) doenças infecciosas
60 Aplicações da edição genética (ZFN) doenças infecciosas
61 Aplicações da edição genética doenças infecciosas AIDS
62 CCR5 grna CRISPR no grna CRISPR Longitudinal landscape of gene editing under selective pressure Day 1 Day 14 Day 14 + BAL (5 last days) In collaboration with Amilcar Tanuri UFRJ unpublished data
63 Edição genética na terapia do câncer
64 Redirecionando a especificidade de linfócitos para a terapia do câncer
65 Immuno-gene therapy
66 Clinical trials - 2nd generation CAR CLL-B CAR 19-BBz 10e7 cells Kalos M, et al. Sci Transl Med 2011 Porter DL, et al. N Engl J Med 2011
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68 1 paciente = 1 terapia 1 paciente = 1 terapia (terapia celular/serviço)
69 1 paciente = 1 terapia? 1 doador = diversos pacientes (Biofármaco/Produto)
70 Linfócitos para Imunoterapia 1 doador para todos os pacientes - Biofármaco TCR HLA PD1 Algumas características dos linfócitos que os tornam específicos
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72 Linfócitos para Imunoterapia Engenharia Celular HLA PD1 Algumas características dos linfócitos que os tornam específicos
73 Linfócitos para Imunoterapia Engenharia Celular PD1 Algumas características dos linfócitos que os tornam específicos
74 Gene editing for immunotherapy primary human T cells PD1 Human PBMC PD1 grna + CRISPR CRISPR 10(100%) 7(100% ) 8 (80%) 2 (20%) 7(100% )
75 Linfócitos para Imunoterapia Engenharia Celular CAR Algumas características dos linfócitos que os tornam específicos
76 World first use of gene-edited immune cells to treat incurable leukaemia
77 Linfócitos para Imunoterapia Engenharia Celular 1ª aplicação clínica do CRISPR Edição de PD-1 em linfócitos antitumorais nos EUA e China
78 Pioneirismo chinês na aplicação clínica de CRISPR Mais de 60 pacientes tratados
79 Edição genética de agora em diante Riscos off target editing, efeitos não previstos Desafios éticos Regulamentação Restrição em tecidos germinativos, ex vivo vs in vivo
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