CRISPR/Cas9: passo-a-passo do desenho do grna

Transcrição

1 LABORATÓRIO DE EMBRIOLOGIA MOLECULAR DE VERTEBRADOS Dept Biologia Celular e do Desenvolvimeneto ICB USP CRISPR/Cas9: passo-a-passo do desenho do grna Irene Yan [email protected]

2 Vou desenhar meus próprios grnas! Benchling Quero usar mas não faço Biomol Reagentes prêt-à-porter Afinal, o que é CRISPR? Para ler papers

3 1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona 2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações 3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9 Deleção Recombinação 4.Desenho experimental

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5 CRISPR significa Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats e originalmente foi identificado como parte do sistema de defesa bacteriano Genscript

6 É um sistema simples que permite a identificação e edição de alvos genômicos através de um grna (guide RNA) Non-homologous End Joining Homology Directed Repair

7 O SISTEMA CRISPR/Cas9 NECESSITA DE: Nuclease Cas9 crrnade 20nt-complementar ao sítio a ser clivado e determinado pelo usuário trcrna- RNA estrutural que encaixa o crrna na nuclease grna grna Tamanho do genoma humano: bp Probabilidade de uma sequência de 20bp: 1 em

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9 Existem outras nucleases que podem alterar o genoma em alvosespecíficos, mas CRISPR é o mais popular.

10 Boettcher, M. and McManus, M. T. (2015). Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol. Cell 58, sirna ou CRISPR? Depende do seu objetivo

11 sirna ou CRISPR? Depende do seu objetivo Targets different splice forms Transfection is easier Doesn t Transfection is harder Front. Genet., 24 September

12 1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona 2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações 3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9

13 As diversas aplicações do sistema Cas9/CRISPR são variações da utilização da capacidade achar.

14 As diversas aplicações do sistema Cas9/CRISPR são variações da utilização da capacidade achar.

15 As diversas aplicações que surgem do Cas9 e seus variantes: Indel Inserção ou substituição Deleção ou rearranjo Ativação gênica Modificação Epigenômica Microscopia Nat Biotechnol April ; 32(4):

16 SCIENCE SCIENCE

17 1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona 2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações 3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9 Deleção Recombinação 4.Desenho experimental

18 É um sistema simples que permite a identificação e edição de alvos genômicos através de um grna (guide RNA)

19 Cada evento de edição gera produtos distintos que variam de deleções a substutições. Development : dev160333

20 O SISTEMA CRISPR/Cas9 NECESSITA DE: Nuclease Cas9 crrnade 20nt-complementar ao sítio a ser clivado e determinado pelo usuário trcrna- RNA estrutural que encaixa o crrna na nuclease grna grna Tamanho do genoma humano: bp Probabilidade de uma sequência de 20bp: 1 em

21 Condições para elaboração do crrna de 20nt: 1. Estar próximo de um sítio PAM (Protospacer Adjacent Motif): NGG 2. Ter um baixa probabilidade de reconhecimento off-target* Tamanho do genoma humano: bp Probabilidade de uma sequência de 20bp: 1 em

22 CONHECENDO SEU PLASMÍDEO

23 Produz: 1mRNA que codifica: Cas9-(peptídeo 2A)-GFP 1gRNA

24 GFP

25 Produz: 1) grna 2) Cas9-(peptídeo 2A)-GFP

26 E este? Tem tudo?

27 PROBLEMA : Não há sequência PAM perto da região que quero editar.

28 E, caso não haja um PAM tradicional, existem variantes de Cas9 que usam PAM alternativos

29 1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona 2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações 3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9 Deleção Recombinação 4.Desenho experimental

30 Recombinação homóloga Pode ser usada para: Adicionar epítopos (FLAG, HA) Mutação pontual

31 Para adição de dominios/proteínas ao genoma, a RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA deve ocorrer depois da ação de Cas9 Eficiente >50% Ineficiente1%-10% (maior na fase S)

32 O HDR pode ser usado para mutações pontuais ou fusão de epítopos

33 Precisa do: grna Inserto* (e.g. troca de bases, FLAG, GFP) Braços de homologia pb do sítio da quebra Comprimento de pb (depende do tamanho do inserto a se incorporado

34 2. Recombinação Transfecção Cotransfecção de: Plasmídeo de corte (Cas9 + grna) Plasmídeo de recombinação (braços de homologia e elemento a ser inserido) 1. Corte Verificar transfecção GFP RFP Seleção da recombinação Puromicina

35 O uso da Cas9 nickase (Cas9 D10A) Mais eficaz quando usa 2 grna Edição de tamanho controlado Mais específico (menos off-targets) Melhor para recombinações Schaeffer, S.M., & Nakata, P.A. (2015). Plant science : an international journal of experimental plant biology, 240,

36 O uso da Cas9D10A em conjunto com diversas grnas aumenta a eficácia e espeficidade da HDR Ran, F. A.et al. (2013)Cell 154,

37 Cas9 para ativação e inativação de transcrição Neste caso, o grna reconhece a região promotora

38 1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona 2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações 3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9 Deleção Recombinação 4.Desenho experimental

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40 Transfecçãoe Seleção Clones únicos Genotipagem qpcr para marcadores

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42 Estratégia de remoção de SCRATCH2 do genoma de célulastronco: Edição dupla CRISPR com corte duplo/ double nickase No sítio genômico do Scrt2 a b

43 QUE REGIÃO PROTEICA EDITAR? Alinhamento de proteínas A REGIÃO GENÔMICA É EXCLUSIVA? BLAST de exons Desenho do grna Desenho dos primers para validação Tatiane Kanno

44 O plasmídeo px330-egfp contém : FLAG-Cas9/CRISPR, GFP e sítio de clonagem do grna Resistência a Puromicina

45 O desenho dos grnas foram feitos pelo crispr.mit.edu

46 As sugestões de grnas são classificadas de acordo com o índice de off-target (fora-de-alvo)

47 Estratégia de remoção de SCRATCH2 do genoma de célulastronco: edição dupla No sítio genômico do Scrt2 a b a b

48 Foram transfectados 2 plasmídeos, cada um contendo um grna distinto (a e b)

49 O plasmídeo px330-egfp contém o Cas9/CRISPR, GFPe sítio de clonagem do grna FLAG-Cas9 GFP Thiago M. Sanches

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51 A deleção de SCRATCH2 (150pb) foi confirmada por PCR genômico Pool Tatianne Kano

52 e qpcr Tatianne Kano

53 O Cas9 nesta situação é usado para gerar uma quebra na região em que a recombinação deve ocorrer. Sequência genômica SCRATCH EXON 2 HOMOLOGY ARM Sequência doadora no pfetch EXON 2 HOMOLOGY ARM Genoma modificado SCRATCH EXON 2 HOMOLOGY ARM SCRATCH- Neomycin Resistance

54 QUAL O CUSTO DO PROCEDIMENTO? Financeiro: Para um laboratório que já faz Biologia Molecular e transfecçãocelular: BbsI: USD 172 grna(dois oligos) : R$300 Plasmídeo pex330: USD 65 Midiprep Enzimas de restrição Método de delivery (transfecção) Tempo: Clonagem (1-2 semana) PCR de colônia (primers U6 e grna)e Sequenciamento (1 semana) Transfecção e seleção de clones (2-3 semanas) Ampliação das colônias (variável) Validação (1-2 semanas)

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