NOVAS TECNOLOGIAS DE EDIÇÃO DE GENES
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- Mirella Canedo Chaplin
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1 CRBio2 - XXIII Encontro de Biologia ENBIO ES - 1/12/2017 NOVAS TECNOLOGIAS DE EDIÇÃO DE GENES O impacto na sociedade Dra. Maria Antonia Malajovich Diretora Científica de ACTE Biotecnologia: ensino e divulgação maria.antonia@bteduc.bio.br
2 COMO MODIFICAR UM GENOMA? Ação de agentes mutagênicos: produtos químicos, radiações (1927) Engenharia genética: inserção de DNA exógeno (1973) Opinião pública dividida por argumentos racionais, políticos e religiosos. Dificuldades: desenvolvimento de um traço novo (13 anos, 135 milhões US$) e aprovação do processo regulatório (75 novos estudos, 5 a 7 anos). Edição gênica ou genômica Baseada em proteínas ZFNs (Zinc finger nucleases, 2003) e TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases, 2010) Baseada no RNA: CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, 2012)
3 A IMUNIDADE BACTERIANA Os ataques virais (bacteriófagos) reduzem em 10% a capacidade da indústria de laticínios. Trás o sequenciamento de Streptococcus thermofilus, descoberta das sequências CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats), que variam em diferentes linhagens e conferem resistência aos fagos (Mojica, 2005; Horvath e Barrangou, Danisco, 2007). Genes Cas Sequências repetidas Sequências espaçadoras CRISPRs: mecanismos de defesa (5 tipos e 16 subtipos) presentes em 40% das eubactérias e 90% das arqueas sequenciadas.
4 CRISPR EM PROCARIONTES 1 A IMUNIDADE BACTERIANA Streptococcus thermofilus 1 Ataque 2 - Fragmentação do DNA viral pelas enzimas de restrição bacterianas. SEQUÊNCIA CRISPR Incorporação de algumas sequências de DNA do fago no genoma bacteriano entre os segmentos repetitivos do sistema CRISPR. Cas9 5 CRISPR RNA 4 Novo ataque 5 Transcrição e processamento do DNA incorporado como CRISPR RNA, que se associa a Cas Degradação Cas-dependente do DNA do bacteriófago.
5 A IMUNIDADE BACTERIANA Em 2007 Danisco é comprada por DuPont que registra numerosas patentes e inicia a vacinação das linhagens utilizadas na produção. A partir de 2012, produção de queijo para pizza mediante linhagens CRISPR. Atualmente, todas as linhagens de DuPont estão CRISPeRizadas. Não são organismos geneticamente modificados
6 UMA FERRAMENTA DE EDIÇÃO CRISPR/Cas9 Cas9 + crrna (transcrito do lócus CRISPR) + tracrrna (RNA transativador do crrna) configuram uma endonuclease cujo sítio de clivagem está definido pela complementariedade de bases entre o crrna e o DNA-alvo (Doudna e Charpentier, 2012). Para gerar uma nuclease sítio-específica basta sintetizar um RNA guia (grna= quimera de crrna e tracrrna) que, associado a uma nuclease como Cas9, produzirá um corte sítio-específico (Jinek et al. 2012). Nucleases sítio-específicas Cas9-gRNA agem também em células eucarióticas (levedura, camundongo) Com algumas pequenas alterações essa nuclease pode agir também em células humanas eucarióticas, inclusive humanas (Zhang, 2013; Church, 2013)
7 CRISPR Introdução da enzima e do RNA-guia nas células mediante vetores (Lentivírus, vírus adenoassociados, plasmídeos, lipídeos) ou diretamente como ribonucleoproteína. Possibilidade de fugir dos padrões atuais da regulamentação.
8 A GUERRA DAS PATENTES CRISPR/Cas9 não pode ser patenteada, porque se trata de um fenômeno natural. A patente das técnicas de edição gênica está sendo disputada por Doudna, Charpentier (Berkeley, Viena) e Zhang (Broad Institute). Atualmente, estariam sendo disputadas mais de 1880 famílias de patentes ligadas a CRISPR. Mais de 100 famílias novas, cada uma delas reclamando direitos de propriedade intelectual são publicadas mensalmente (IPStudies, firma consultora Suiça). A biotecnologia é um empreendimento milionário construído sobre pesquisadores, universidades, empreendedores, empresas, e interesses econômicos de grandes capitais.
9 CRISPR COMO INSTRUMENTO DE PESQUISA Mutação de ponto Deleção de um ou de vários genes Inserção de um transgene Ativação da transcrição de um gene (Associação de Cas com molécula ativadora) Repressão da transcrição de um gene (Bloqueio da RNA-polimerase por Cas) Modificações epigenéticas (Associação de Cas com moléculas capazes de metilar ou acetilar histonas) Indução de um gene por um estímulo externo (substâncias químicas, luz)
10 FACILIDADE DE ACESSO Ao alcance de todos, biohackers incluídos Instituições: Harvard Plasmid Database, DNASU Plasmid Repository, National Institutes of Health s PlasmID, Mammalian Gene Collection etc. Organizações independentes: Addgene - The non profit plasmid repository Em 2015, plasmídeos enviados a pesquisadores de 80 países. Preço por plasmídeo 65 US$ (2016). Empresas: Invitrogen/Thermofisher
11 CRISPR NA INDÚSTRIA Engineering any genome, at any site, in any way Em bactérias, CRISPR permite remover modificações genéticas para se adequar a critérios de biossegurança ou de proteção da propriedade intelectual Fermentações industriais Produção de enzimas, fragrâncias, flavores e novos materiais. Melhor qualidade e maiores rendimentos em materiais bioterapêuticos (Proteínas recombinantes, vacinas, vetores para terapias gênicas)
12 CRISPR NA AGRICULTURA Primeiro produto comercial liberado nos Estados Unidos: cogumelo (Agaricus bisporus) que não escurece. A USDA não considerou necessária sua regulação, assim como em relação a outros eventos anteriores obtidos mediante ZFN ou TALEN. Trigo com menos gliadinas - Com CRISPR/Cas9 foram deletados 35 dos 45 genes responsáveis pela síntese dessas proteínas (Barro, 2014). Pequenos testes com celíacos no México e na Espanha. Obtenção de linhagens de Gloria da manhã (Ipomoea nil), com flores brancas. Banana resistente a doenças. E as grandes empresas? Monsanto: primeira licença da tecnologia para uso agrícola (CRISPR-Cpf1). DuPont: testes de campo para lançar em 2020 um milho com menos amilose, editado com CRISPR, de interesse para a indústria de alimentos. Criação da Coalition for Responsible Gene Editing in Agriculture (The US Pork Board, Monsanto, Syngenta, Bayer)
13 CRISPR NA CRIAÇÃO DE ANIMAIS Gado bovino Obtenção de gado sem chifres. Sexagem de embriões. Piscicultura - Inativação de genes codificadores de hormônios que assegure sua esterilidade em caso de escapamento (Ictalurus punctatus, Bagre americano ou Peixe gato). Avicultura Galinhas poedeiras de ovos hipoalergênicos. Sexagem de embriões. Controle de doenças Suínos resistentes ao vírus da síndrome respiratória e à Febre Africana (transferência de um gene de javali, que é um animal naturalmente resistente). Gado resistente ao tripanosoma da doença do sono. Melhoramento genético de mascotes (peixes, cachorros).
14 CRISPR NA SAÚDE Combate a infecções virais (HIV, Hepatite B) ou causadas por linhagens bacterianas altamente patogênicas. Possibilidade de xenotransplantes. Inativação de 62 retrovírus endógenos potencialmente patogênicos ao homem e de 20 genes do porco, potencialmente imunogênicos e capazes de induzir rejeição. (Church, 2015). Obtenção de animais-modelo para o tratamento experimental de doenças (Duchenne, Fibrose cística). Terapias gênicas somáticas e luta contra o câncer. Primeiros testes na China. Possibilidade de aperfeiçoamento da imunoterapia CAR-T (Chimeric Antigen Receptor T-cell therapy) para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda.
15 CRISPR NA SAÚDE - ASPECTOS CONTROVERSOS Suécia, Reino Unido e China já liberaram o uso da tecnologia em embriões humanos que não serão implantados. Grupos chineses realizaram os primeiros estudos de reparação do gene HBB, responsável pela β-talassemia, e de incorporação de uma mutação no gene CCR5 para impedir a invasão pelo HIV. Pouca eficiência e mutações off-target. CRISPR é uma tecnologia muito recente que ainda deve ser aperfeiçoada antes de ser aplicada ao ser humano. A comunidade científica de vários países começa a vislumbrar a possibilidade de edição genética de embriões para terapias gênicas da linhagem germinal, uma fronteira até agora técnica e moralmente intransponível. Qual será o posicionamento da sociedade?
16 CRISPR, SAÚDE E MEIO AMBIENTE: ASPECTOS CONTROVERSOS Erradicação de espécies invasoras ou de vetores de doenças (Anopheles) mediante a inserção de genes que reduzam a viabilidade ou a fertilidade. Normas estritas de segurança em função do risco dos genes se espalhar em lugares onde a espécie não é invasiva. Gene drives Um gene Cas9-gRNA inserido no seu sítio de corte irá reparar o cromossomo homólogo, transformando o heterozigoto em homozigoto e se espalhando rapidamente na população (Esvelt, 2014).
17 BIOSSEGURANÇA E REGULAÇÃO As normas da legislação brasileira estão de acordo com o Protocolo de Cartagena sobre Biossegurança e as diretrizes do Codex Alimentarius e da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE). A principal norma reguladora brasileira sobre as atividades com organismos geneticamente modificados é a Lei de Biossegurança (Lei n , de 24 de março de 2005). A palavra final sobre as questões técnicas corresponde à Comissão Nacional Técnica de Biotecnologia (CTNBio). Qual o status de um organismo editado? Em primeira aproximação, seria um organismo geneticamente modificado. Porém, diferentemente dos OGMs que estão no mercado, um organismo editado não carrega necessariamente genes de outras espécies. A edição pode inativar um gene, gerar uma versão mais favorável de um gene existente ou transferir uma variante da mesma espécie, tal como ocorreria na natureza por mutação espontânea ou por melhoramento. A análise terá que ser caso a caso.
18 BIBLIOGRAFIA ADDGENE. CRISPR-Cas9 Animation. You Tube CRISPR Update CRISPR Updates, News and Articles DOUDNA J., STERNBERG S.H. A Crack in Creation: Gene editing and the unthinkable power to control evolution. Boston, Houghton Mifflin Harcourt, GRENS K. There is CRISPR in your yoghurt. The Scientist January INVITROGEN/THERMOFISHER. MOJICA F.M. Sistemas CRISPR-Cas, una revolución biotecnológica con origen bacteriano, NATIONAL ACADEMIES OF SCIENCES, ENGINEERING, AND MEDICINE. Human Genome Editing: Science, Ethics, and Governance. Washington, DC: The National Academies Press, Nature News Top Science News ScienceDaily -
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