Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento - NC: ISSN:

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1 Análise da Viabilidade Terapêutica das Células-Tronco Mesenquimais Alogênicas no Tratamento de Felino Acometido por Complexo Gengivite Estomatite Felina ASSIS, Tatiana Lembo Silveira de [1] WINCK, Caroline Pinho [2] SANTOS, Enrico Jardim Clemente [3] ASSIS, Tatiana Lembo Silveira de; WINCK, Caroline Pinho; SANTOS, Enrico Jardim Clemente. Análise da Viabilidade Terapêutica das Células-Tronco Mesenquimais Alogênicas no Tratamento de Felino Acometido por Complexo Gengivite Estomatite Felina. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento. Ano 02, Vol. 01. pp , Abril de ISSN: RESUMO: A gengivo-estomatite crónica felina (GECF) é uma doença clinicamente complexa, severa e que apresenta lesões de caráter crônico com frequentes reagudizações e refractabilidade aos tratamentos disponíveis. Atualmente existem diferentes abordagens terapêuticas, podendo ser médica, cirúrgica ou combinação de ambas. Entretanto, as respostas ao tratamento apresentam muitas variáveis e os sucessos terapêuticos revelam-se normalmente incompletos, transitórios e de duração imprevisível, tornando-se essencial estabelecer uma estratégia terapêutica para cada animal. A utilização terapêutica das célulastronco mesenquimais(ctms) vêm mostrando-se extremamente promissora no tratamento de diferentes doenças que acometem tanto grandes como pequenos animais. Seu potencial reparativo permite que uma vez introduzidas no organismo, adquira tanto a morfologia como a funcionalidade de qualquer tipo celular danificado que constitua o tecido lesionado. Este trabalho visa por meio das características singulares das células tronco mesenquimais alogênicas de tecido adiposo de felinos (CTMs-TAF) analisar tanto a eficácia como a viabilidade terapêutica das no tratamento do GECF. Palavra-Chave: Terapia Celular, Patologias da Cavidade Oral, Gengivo-Estomatite Crónica Felina, Célula Tronco Mesenquimal. 1 / 14

2 INTRODUÇÃO: A GECF é uma uma inflamação oral grave, idiopática, clinicamente complexa, com frequentes reaguditzações e refractabilidade aos tratamentos disponíveis. Dentre os sinais clínicos apresentados pelos felinos temos são dor oral moderada a grave e desconforto, incluindo inapetência, redução Grooming, perda de peso e hipersalivação. A patogênese da FCGS ainda não está completamente elucidada embora acredite-se que devido ao hospedeiro, o sistema imunológico que responde de maneira inapropriada a estimulações secundárias (1). Existem diferentes abordagens terapêuticas podendo ser médica, cirúrgica ou combinação de ambas. Entretanto, as respostas ao tratamento apresentam-se muito variáveis e os sucessos terapêuticos revelamse normalmente incompletos e de duração imprevisível (1). As CTMs, por definição, são células indiferenciadas com alto potencial de proliferação, auto-renovação e diferenciação em diferentes tipos celulares como, por exemplo, osteoblastos (2), condrócitos (3) e adipócitos (4). Estando presentes em todos os tecidos que constituem o animal, as CTMs são responsáveis pela manutenção da homeostase e reparação tecidual durante o transcorrer da vida do animal (5). Quando estimuladas, as CTMs liberam um grande número de moléculas bioativas que atuam modulando o sistema imune e a resposta inflamatória, angiogênese e mitose das células envolvidas no processo de reparação tecidual. Estudos demonstraram que as CTMs apresentam efetuso de quimiotaxia, anti-fibrótico e antiapoptótico (6-9). A utilização terapêutica das CTMs vêm mostrando-se extremamente promissora. Seu potencial reparativo permite que uma vez introduzidas no organismo, adquira tanto a morfologia como a funcionalidade de qualquer tipo celular danificado que constitua o tecido injuriado (6). Este trabalho visa por meio das características singulares das CTMs analisar tanto a eficácia como a viabilidade terapêutica no tratamento do GECF. MATERIAL E MÉTODOS: Seleção de Animais Doadores de tecido adiposo para o Tratamento Alogênico Os animais foram selecionados a partir de populações de pacientes de clínicas veterinárias da cidade de São Paulo mediante ao consentimento livre e esclarecido por parte dos proprietários. As CTMs utilizadas no presente estudo foram obtidas a partir de animais jovens, saudáveis com até seis meses de vida (Figura 1). 2 / 14

3 Análise Molecular Foi coletada uma amostra de sangue para a análise da presença de coronavírus felino (FCoV), vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírus da leucemia felina (FeLV), Chlamydia psittaci (CPS), herpes vírus felino (FHV-1), Haemobartonella felis (HFE) e micoplasma através da amplificação de fragmentos dos respectivos genomas pelo método da reação em cadeia de polimerase (PCR) em materiais extraídos (RNA e DNA). Os RNAs foram extraídos com Trizol LS (Invitrogen) e utilizados para síntese de cdna através de transcrição reversa com superscript II (Invitrogen). DNAs foram extraídos utilizando-se o DNAzol (Invitrogen). Reações positivas apresentam fragmentos de DNA de 185 pb e 410 pb (FCoV), 557 pb (FIV) 166 pb (FeLV), 167 pb (CPS), 173 pb (FHV-1), 205 pb (FCV), 170 pb (HFE) e 510 pb (micoplasma). Foram submetidas a cada pesquisa duas amostras extraídas, controles positivos e negativos. Isolamento das CTMs-TAF O tecido adiposo obtido no momento da castração foi lavado em 1x PBS de forma a retirar sangue e debris. Após a lavagem o tecido foi mantido durante 30 minutos a 370C/5% de CO2 em presença de 0,075% de colagenase tipo IV (Sigma). Foi adicionado 5 ml de meio basal sendo o sobrenadante retirado e centrifugado durante 5 minutos a 200 g. O precipitado foi ressuspenso e transferido para uma garrafa de cultivo de 25 cm2 a qual foi mantida a 370C/5% CO2 durante 48 horas em presença de meio basal quando o mesmo foi trocado. Os repiques subsequentes forma feitos por meio de ação enzimática utilizando 0.025% de tripsina (Invitrogen) (10). As células-tronco foram divididas em alíquotas de 2 x 106, ressuspensas em meio de congelamento (10% de DMSO, 70% de soro fetal bovino e 20% de meio basal contendo 2 x 106 células-tronco) e armazenadas em nitrogênio líquido. As células-tronco foram administradas com menos de 1 ano de armazenamento. Para serem aplicadas nos felinos, as células forma descongeladas em banho-maria por 2 minutos a 370C, o meio de criopreservação removido e as células transferidas para garrafa de cultivo de 25 cm2 a qual foi mantida a 370C/ 5% CO2 (Figura 1). Análise Tumorigênica A análise do potencial tumorigênico foi realizado por meio da introdução de 1x106 células, 4a passagem, através da via subcutânea. As CTMs-TAF foram ressuspensas em 2 ml e introduzidas subcutaneamente em três camundongos da linhagem nude. Os animais foram mantidos em ambiente estéril durante o período de sete semanas. Análise Proliferativa Para a análise proliferativa foi isolada uma colônia da CTM-TAF e expandida até atingir uma confluência 3 / 14

4 de 70% em uma garrafa de 25 cm2. As células foram removidas enzimaticamente (tripsina 0.025%, Invitrogen) e distribuídas, em triplicatas, em garrafas de 25 cm2 na concentração de 105 células. Após três dias as células foram removidas, contadas em câmara de Neubauer e distribuídas em três novas garrafas de 25 cm2 na concentração de 1 x 105 células. O processo foi repetido até a 10a passagem (11) (Figura 1). Potencial de Diferenciação Osteogênico, Adipogênico e Condrogênico O potencial de diferenciação osteogênico das CTM-TAF, 4a passagem, foi realizado através do cultivo em meio basal Dulbecco smodifiedeagle smedium High Glucose (DMEM-HG; Invitrogen), 15% de soro fetal bovino (FBS; HyClone, Logan, Utah), 1% de antibiótico (Penicilina g 10.00u/ml; Invitrogen, Streptomicina mg/ml; Invitrogen), 1% de l-glutamina (200mm; Invitrogen) e 1% de aminoácidos não essenciais (200mm; Invitrogen) durante o período de 24 horas na concentração inicial de 1x105 células. Após 24 h, o meio foi trocado para o de diferenciação osteogênica Dulbecco s Modified Eagle s Medium Low Glucose (DMEM-LG; Invitrogen), 1% de 10-5M de dexametasona (Sigma), 1% 5mM de acido ascórbico (Sigma), 10% de soro fetal bovino (FBS; HyClone, Logan, Utah) e 1% Streptomicina/Penicilina (Penicilina g 10.00u/ml, Streptomicina mg/ml; Invitrogen). A troca do meio foi feita a cada 3 ou 4 dias. No 10o dia foi adicionado 1% de 200mM de b-glicerolfosfato (Sigma) ao meio de cultura e também nas trocas subseqüentes. As células foram mantidas em cultura até o 21o dia de diferenciação. A caracterização das células foi feita por meio da coloração de Von Kossa (10) (Figura 1). Para a análise do potencial de diferenciação adipogênico as CTM-TAF, 4a passagem, foram cultivadas em meio basal durante por 24 h na concentração inicial de 1x105 células. Após 24 horas o meio foi trocado para o de diferenciação adipogênica composto por Dulbecco smodifiedeagle smedium HIGH Glucose (DMEM-HG; Invitrogen), 10% de soro fetal bovino (FBS; HyClone, Logan, Utah), 1 mm de dexametasona (Sigma), 100 mm de endomentacina (Sigma), 0,5M de isobutilmetilxantina (Sigma) + 10 µm de insulina (Sigma) e 1% de antibiótico (Penicilina g 10.00u/ml; Invitrogen, Streptomicina mg/ml; Invitrogen), sendo a troca do meio foi feita a cada 3 ou 4 dias. As células foram mantidas em cultura até o 21o dia de diferenciação. As células foram então fixadas por 60 minutos a temperatura ambiente em presença de paraformaldéido 4%, lavadas 3 vezes com etanol 70%, mantidas a temperatura ambiente por cinco minutos com OilRed O, sendo posteriormente lavadas 3 vezes com água destilada (10)(Figura 1). Para a análise do potencial de diferenciação condrogênico as CTM-TAF, 4a passagem, foram transferidas, na concentração 1 x 106, para tubos falcon de 15 ml, centrifugadas a 200g por 5 minutos. Em seguida foram cultivadas na presença de meio Dulbecco s Modified Eagle s Medium HIGH Glucose (DMEMHG; Invitrogen) suplementado com 1% de soro fetal bovino (FBS; HyClone, Logan, Utah), 6,25 mm de insulina (Sigma), 0,1 mm de dexametasona (Sigma), 1 mm de piruvato de sódio (Invitrogen), 10 ng/ml 4 / 14

5 TGF-?1(R&D System, LGC Biotechnology) e 1% de antibiótico (Penicilina g 10.00u/ml; Invitrogen, Streptomicina mg/ml; Invitrogen) sendo que a troca do meio indutor foi realizada diariamente durante 21 dias. Posteriormente o pellet esférico formado foi fixado, incluso, cortado e corados com azul de toluidina (Sigma) (12) (Figura 1). Figura 1: Um fragmento do tecido adiposo de um felino jovem, clinica e laboratorialmente saudável é coletado e encaminhado para o Laboratório da CELLTROVET. Neste as CTMs são isoladas, caracterizadas e armazenadas no Banco de Células-Tronco da CELLTROVET para serem posteriormente encaminhadas para sua inoculação no paciente. Aplicação das CTMs-TAF Foi atendido um felino, macho, Himalaio/Persa, com 11 anos de idade, diagnosticado com Estomatite Ulcerativa, Neutrofílica, Linfoplasmocitaria com tecido de granulação (Complexo Gengivite Estomatite Felina). Para tal foi realizado, a partir de um fragmento tecidual da região caudal inferior interna da bochecha, o exame histopatológico (coloração com Hematoxilina e Eosina). O paciente teve o seu perfil renal e hepático, hemograma completo, raio-x de tórax e ultrassom abdominal de forma a determinar tanto o seu quadro laboratorial como minimizar a possibilidade de neoplasias. Foram aplicadas CTMs- 5 / 14

6 TAF tanto pela via endovenosa como intra-gengival. Cada dose com 2 x 106 CTMs-TAF. O animal foi acompanhado quinzenalmente de forma a determinar a evolução do quadro clínico. RESULTADOS E DISCUSSÃO: No presente estudo, as CTMs-TAF isoladas a partir de felinos jovens e saudáveis, foram caracterizadas com base em sua morfologia fibroblastoide, capacidade de adesão ao plástico, potencial de proliferação celular e capacidade de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica (7) (Figura 2). Quando injetadas em camundongos nude, as CTMs-TAF não foram capazes de induzir a geração de teratocarcinomas. 6 / 14

7 Figura 2: Análise do potencial de proliferação celular das CTMs-TAF(A), morfologia fibroblastoide da cultura celular (B) e diferenciações osteogênica (C), adipogênica (D) e condrogênica (E); Obj 4x(B), 40x(C), 20x(D) e 40x(E). Na medicina veterinária as CTMs vêm sendo utilizadas e sua eficácia demonstrada em estudos relacionados à osteoartrites (13-16), lesões tendíneas (17-19), lesões na córnea (20), sequela de cinomose (21), aplasia medular (22), lesão medular (23-25) e ulceras (26,27) dentre outras. Na medicina veterinária Dentre as fontes de CTMs mais utilizadas são a medula óssea, tecido adiposo e cordão umbilical. Dentre estas, as células provenientes do tecido adiposo destacam-se por sua facilidade de obtenção e abundância, proporcionando o mínimo desconforto para o animal (28). O animal do presente estudo apresentava um quadro de gengivite intensa, com formação de granulomas, lesões de reabsorção e secreção purulenta fétida. Não se alimentava e apresentava sialorreia intensa, tendo que ser tratado com fluidoterapia. Os exames relacionados ao perfil renal e hepático além do hemograma completo, demonstravam valores dentro da normalidade. Não foi detectada qualquer tido de formação neoplásica por meio dos exames de raios-x de tórax e ultrassom abdominal. 7 / 14

8 A análise histopatológica macroscópica revelou inúmeros fragmentos de diâmetro (maior 0,5 e 0,2 menor) e superfície lisa com coloração esbranquiçada acastanhada. Já a análise microscópica demonstrou corte na mucosa oral, com presença de área extensa de ulceração superficial, acompanhada de exsudação neutrofílica e com pequena porção de epitélio escamoso preservado, sem atipias, com presença de intensa exocitose neutrofílica. No tecido subjacente observou-se intensa proliferação fibroplásica e neovascularização (tecido de granulação), acompanhada de intenso processo inflamatório predominantemente neutrófilo, com menor quantidade de linfócitos e plasmócitos. Mais profundamente observou-se focos micronodulares de inflamação linfoplasmocitária. Em alguns dos fragmentos observouse processo inflamatório acometendo musculatura esquelética profundamente não tendo sido detectados indícios de malignidade nas amostras avaliadas. Com base nos dados histopatológicos foi diagnosticado um quadro de estomatite ulcerativa, neutrofílica e linfoplasmocitária, intensa, associada a proliferação de tecido de granulação. O felino foi submetido a cirurgia visando a retirada dos granulomas. Durante o procedimento foram aplicadas, após serem descongeladas, doses de CTMs-TAF tanto pela via endovenosa como intra gengival (Figura 3). Após o procedimento, foi receitado antibiótico, voltando a se alimentar normalmente 1 dias após a cirurgia. Dois meses após a cirurgia ocorreu a recidiva dos granulomas, menores, mas ainda com gengivite, lesões de reabsorção e pús. Estes dados sugerem a necessidade da aplicação de mais doses de CTMs-TAF uma vez que ocorreu uma melhora significativa após a primeira infusão. Figura 3: Procedimento cirúrgico visando a retirada dos granulomas durante o qual foram infundidas CTMs-TAF tanto pela via endovenosa como intra gengival. 8 / 14

9 O animal passou por consulta com especialista em odontologia, que após avaliação sugeriu extração dos dentes pré-molares e molares (lesões de reabsorção), mas deixando claro que provavelmente seria necessária a extração também dos caninos e incisivos devido a intensa gengivite. O felino foi submetido a extração de pré-molares e molares e remoção dos granulomas sendo infundidas, após terem sido descongeladas, CTMs-TAF tanto pela via endovenosa como intra-gengival. Não foi aplicado anti-inflamatório, apenas antibiótico e analgésico no dia do procedimento. Foi prescrito como medicação pós-cirúrgica, antibiótico (Amoxicilina com Clavulanato) e Periovet para limpeza da região. O fato de não ter sido necessária a utilização anti-inflamatórios se deve, provavelmente a está característica das CTMs uma vez que, por meio de ação modulatória, regulam a produção de citocinas pró-inflamatórias (29). As CTMs têm sido alvo de uma série pesquisas voltadas para doenças imunomediadas e doenças inflamatórias crônicas. Quando entram em contato direto com um tecido ou ainda mediante a interação parácrima, as CTMs desencadeiam a liberação de uma série de fatores solúveis que atuam no sistema imunológico com, por exemplo, em linfócitos e células dendríticas apresentadoras de antígeno (6). Os resultados por nós obtidos com infusão de CTMs-TAF após serem criopreservadas são equivalentes aos obtidos no tratamento utilizando CTMs-TAF. Autólogas (30). Ambas aboradagens se demonstraram seguras e eficazes no que tange ao tratamento do CGEF. Foi relatado que ao chegar em casa animal se alimentou com ração seca não sendo necessário o uso de anti-inflamatório e analgésico. O felino retornou 4 meses após a cirurgia para a reavaliação. Não foi detectada recidiva do CGEF nem efeitos adversos as infusões das CTMs-TAF como vômito, náusea, alteração da pressão arterial e/ou variação na frequência respiratória (Figura 4). 9 / 14

10 Figura 4: Após 4 meses da cirurgia o felino retornou para a reavaliação. Não tendo sido detectada recidiva do complexo gengivite estomatite. CONCLUSÃO Os resultados demonstram que a aplicação das CTMs-TAF alogênicas de felinos jovens e clinicamente saudáveis, após serem expostas ao processo de criopreservação, resultou em uma significativa melhora da qualidade de vida do animal uma vez que não foi observada a recidiva do CGEF quando realizadas múltiplas aplicações. 10 / 14

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