Efeitos do diabetes nos grânulos de ANP de ratos Wistar em envelhecimento

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1 UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU Centro de Ciências Biológicas e da Saúde Programa de pós-graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento Rosangela Maria Cordeiro Garoto Efeitos do diabetes nos grânulos de ANP de ratos Wistar em envelhecimento São Paulo 2012

2 UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU Centro de Ciências Biológicas e da Saúde Programa de pós-graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento Rosangela Maria Cordeiro Garoto Efeitos do diabetes nos grânulos de ANP de ratos Wistar em envelhecimento Dissertação apresentada ao programa de Mestrado em Ciência do Envelhecimento da Universidade São Judas Tadeu para a obtenção do Título de Mestre São Paulo 2012 i

3 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Universidade São Judas Tadeu Bibliotecário: Ricardo de Lima - CRB 8/7464 G237e Garoto, Rosangela Maria Cordeiro Efeitos do diabetes nos grânulos de ANP de ratos wistar em envelhecimento / Rosangela Maria Cordeiro Garoto. - São Paulo, f.: il. tab.; 30 cm Orientador: Romeu Souza Rodrigues Dissertação (mestrado) Universidade São Judas Tadeu, São Paulo, Diabetes. 2. Envelhecimento. 3. Fator Natriurético Atrial. I. Rodrigues, Romeu Souza. II. Universidade São Judas Tadeu, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento. III. Título. CDD ii

4 Rosangela Maria Cordeiro Garoto Efeitos do diabetes nos grânulos de ANP de ratos Wistar em envelhecimento Dissertação apresentada ao programa de Mestrado em Ciência do Envelhecimento da Universidade São Judas Tadeu para obtenção do Título de Mestre. Área de concentração: Aspectos biológicos e funcionais do envelhecimento Orientador: Prof. Romeu Rodrigues de Souza SÃO PAULO 2012 iii

5 FOLHA DE AVALIAÇÃO Rosangela Maria Cordeiro Garoto Efeitos do diabetes nos grânulos de ANP de ratos Wistar em envelhecimento Dissertação apresentada ao programa de Mestrado em Ciência do Envelhecimento da Universidade São Judas Tadeu para obtenção do Título de Mestre. Área de concentração: Aspectos biológicos e funcionais do envelhecimento Orientador: Prof. Romeu Rodrigues de Souza Data: / / Banca examinadora Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Julgamento: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Julgamento: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Julgamento: iv

6 DEDICATÓRIA A minha amada mãe Pedrina (in memoriam), verdadeiramente a maior mestre que tive. A minha amada filha e esposo. Sem vocês não teria sentido. v

7 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus pelas oportunidades que me foram dadas na vida, principalmente por ter conhecido pessoas interessantes e também por ter vivido fases difíceis, que foram matérias-primas de aprendizado. Agradeço especialmente à minha amada filha Camila, que compreendeu a minha ausência e dizia se orgulhar de mim. Ao meu marido que, com seu apoio incondicional, deu-me forças para prosseguir até o final dessa jornada, com sua frase motivadora: Tem que fazer? Então faça! essa era minha mola. A minha irmã guerreira, Cida, meu querido cunhado Chico e sobrinha Aline que, enquanto eu estava longe, cuidaram de nossa mãe. E você minha irmã Wilma, que torcia e rezava por mim, é meu maior exemplo de ser humano. A minha amiga Silvana Flora, pois trocávamos experiências e nos apoiávamos mutuamente com amizade e comprometimento. Ao admirável Armando Bega, que mais uma vez, faz parte do meu crescimento profissional e, porque não, pessoal. Ao meu partner Rogério Krisan que por ele, pude ficar ausente do nosso negócio. Aos meus sobrinhos e afilhados, Eliana, Francini, Aline, Bete, Erika, Djalma e Zezé, que, sei, torceram por mim. Ao meu querido orientador professor Romeu Souza pelos ensinamentos. Seu carinho e dedicação serão inesquecíveis. Aos professores do Mestrado Ciências do Envelhecimento meu eterno agradecimento. Aos alunos do Curso de Graduação em Podologia da Universidade Anhembi Morumbi, que foram meu principal motivo de enfrentar e desbravar este desconhecido e rico mundo do Saber... A todos aqueles que de alguma forma estiveram e estão próximos de mim, fazendo esta vida valer cada vez mais a pena. vi

8 O propósito do aprendizado é crescer, e nossas mentes, diferentes de nossos corpos, podem continuar crescendo enquanto continuamos a viver. MORTIMER ADLER vii

9 RESUMO Autora: Rosangela Maria Cordeiro Garoto Orientador: Prof. Romeu Rodrigues de Souza Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento Universidade São Judas Tadeu A influência do diabetes nos efeitos do envelhecimento nos cardiomiócitos dos ventrículos é bem conhecida. Entretanto, informações sobre estes efeitos nos cardiomiócitos dos átrios são escassas. Os cardiomiócitos dos átrios ganharam importância a partir da descoberta de que eles produzem um hormônio denominado Peptídeo Natriurético Atrial (ANP) que atua na diurese e no controle da pressão arterial. O ANP fica armazenado sob a forma de grânulos eletrondensos espalhados no citoplasma dos cardiomiócitos. Foram descritos grânulos de 4 tipos: A, B, C e D. O objetivo deste trabalho foi avaliar histomorfometricamente os efeitos do diabetes melito nos grânulos dos tipos A e B do átrio direito de ratos Wistar durante o envelhecimento. Foram utilizados três grupos de animais, com 9 meses de idade, com 5 animais em cada grupo: G1 Grupo controle, jovem sacrificado no início do experimento, aos 9 meses de idade; G2 Grupo não diabético, idoso, sacrificado aos 13 meses de idade e G3 Grupo diabético, idoso, também sacrificado aos 13 meses de idade, mas portadores de diabetes desde os 9 meses de idade. Após o sacrifício dos animais, foram coletados fragmentos do átrio direito, de cada animal, os quais foram processados para exame à microscopia eletrônica de transmissão. Dez fotomicrografias eletrônicas dos cardiomiócitos de cada animal foram utilizadas para avaliar: a morfologia ultraestrutural dos cardiomiocitos, a densidade numérica e o diâmetro dos grânulos de ANP dos tipos A e B presentes no citoplasma dos cardiomiócitos. Os dados quantitativos obtidos foram tabulados e as médias comparadas estatisticamente entre os grupos pelo Anova e teste pos hoc de Tukey com nível de significância de 0,05. Os resultados obtidos mostraram que: 1. o envelhecimento promoveu alterações morfológicas ultraestruturais discretas nos cardiomiócitos e nos grânulos de ANP; 2. o envelhecimento associado ao diabetes produziu alterações morfológicas ultraestruturais mais evidentes nos cardiomiócitos do átrio direito; 3. o envelhecimento associado ao diabetes produziu diminuição significante nos níveis de ANP do tipo A, mas não nos do tipo B nos cardiomiócitos do átrio direito. Palavras-chave: Cardiomiócitos. Idoso. Átrio. ANP. viii

10 SUMMARY Author: Rosangela Maria Cordeiro Garoto; Advisor: Prof. Romeu Rodrigues de Souza Post-graduate Program in Sciences of Aging São Judas Tadeu University The effects of diabetes have been studied on several tissues. However, Information about the effects of diabetes on the ANP granules from atrial cardiomyocytes from aged rats are not available. The atrial granules have a hormone called atrial natriuretic peptide (ANP) that works in the diuresis and in the blood pressure control. The aim of this experiment is to evaluate morphological and morphometrically the effects of diabetes on the atrial cardiomyocytes granules of ANP on aged rats. This experiment utilized 15 nine month old animals divided into 3 groups of 5 animals each; G1-control group, sacrificed at the beginning of the experiment; the animals were nine months old; G2-non-diabetic group, sacrificed at 13 months old and G3-diabetic group, also sacrificed at 13 months old but with diabetes since they were 9 months old. After the sacrifices, fragments of the right atrial wall were collected from each animal which were processed to be exmining in the electronic transmission microscope. Ten of the photomicrographies from the cardiomyocytes of each animal were used. The density number and the ANP granules diameter of the cardiomyocyte were evaluated. The collected data and average obtained were compared among the groups and recorded. The statistic comparisons and the pos hoc test of Tukey with a significant level of 0,05 were processed by ANOVA. The results showed that: 1. aging promoted discrete changes in the cardiomyocyte morphology and in granules of ANP; 2. the aging associated with diabetes produced morphological changes in cardiomyocyte ultrastructure of the right atrium, 3. the aging associated with diabetes produced a significant decrease in levels of ANP, type A but not of type B in the cardiomyocytes of the right atrium. Keywords: Aging. ANP. Diabetes. ix

11 Índice de Figuras Figura 1: Micrografia eletrônica de corte de átrio direito de animal do grupo controle, utilizada para determinar a densidade de grânulos de ANP (número por miócito) (setas) no citoplasma do cardiomiócito. Núcleo (N); mitocôndrias (M). Barra: 2 nm Figura 2: Micrografia eletrônica de corte de átrio direito de animal do G1, utilizada para contagem e medida do diâmetro dos grânulos de ANP tipo A (setas brancas) e tipo B (setas pretas) do citoplasma do cardiomiócito. Núcleo (N); M Mitocôndrias; G Aparelho de Golgi. Barra: 1 nm Figura 3: Micrografia eletrônica de corte de átrio direito de animal do G1, mostrando grânulos dos tipos A e B, em meio a mitocôndrias (M) próximos ao núcleo do cardiomiócitos (N). Barra: 1 nm Figura 4: Micrografias eletrônicas de cortes dos átrios direitos de ratos dos grupos G1 (A), G2 (B) e G3 (C) mostrando o núcleo (N), e grânulos de ANP (setas) em meio às organelas citoplasmáticas. Observar menor número de grânulos em G3 em relação a G1 (A) e G2 (B). Barra: 2 nm Figura 5: Micrografia eletrônica de corte de átrio direito de animal do G1, mostrando grânulos dos tipos A (setas pretas) e B (setas brancas), em meio a mitocôndrias (M) e miofibrilas (MF) próximos ao núcleo do cardiomiócito (N). G- Aparelho de Golgi. Barra: 1 nm Figura 6: Micrografia eletrônica de corte de átrio direito de animal do G2 não diabético, mostrando grânulos dos tipos A, bem corados (setas brancas), e outros, tipo B, com coloração pobre (setas pretas) miofibrilas (MF) próximos ao núcleo do cardiomiócito (N). G-Aparelho de Golgi. Barra: 1 nm Figura 7: Micrografia eletrônica de corte de átrio direito de animal do G3, mostrando grânulos dos tipos A (setas brancas), e outros com coloração pobre, tipo B (setas pretas). (N) Núcleo. A membrana nuclear apresenta invaginações para o interior do núcleo (setas azuis). M Mitocôndrias, aparecem deformadas e praticamente não coradas, sendo suas cristas não visíveis. Barra: 1 nm Figura 8: Gráfico representativo do número de grânulos de ANP A e B por miócito nos três grupos estudados. * Significante vs G x

12 Figura 9: Gráfico representativo do número de grânulos de ANP, tipo A por miócito nos três grupos estudados. * Significante vs G Figura 10: Gráfico representativo do número de grânulos de ANP, tipo B por miócito nos três grupos estudados. * Significante vs G Figura 11: Gráfico representativo do diâmetro médio (µm) dos grânulos de ANP tipo A nos três grupos estudados. * Significante vs G1 e G Figura 12: Gráfico representativo do diâmetro médio (nm) dos grânulos de ANP tipo B nos três grupos estudados Figura 13: Histograma de distribuição de frequências dos valores dos diâmetros dos grânulos de ANP (nm) do tipo A nos grupos de animais estudados Figura 14: Histograma de distribuição de frequências dos valores dos diâmetros dos grânulos de ANP (nm) do tipo B nos grupos de animais estudados xi

13 SUMÁRIO RESUMO... viii SUMMARY... ix ÍNDICE DE FIGURAS... x 1. INTRODUÇÃO Os grânulos de ANP Efeitos do envelhecimento nos grânulos de ANP Efeitos do diabetes nos grânulos de ANP OBJETIVOS Geral Específico MATERIAL E MÉTODOS Animais Indução do DM e coleta do material Análise morfológica e quantitativa dos grânulos de ANP Densidade de grânulos de ANP (número total de grânulos por miócito) Densidade de grânulos de ANP dos tipos A e B (número por miócito) Diâmetro médio dos grânulos dos tipos A e B Análise estatística RESULTADOS Análise morfológica dos grânulos de ANP dos cardiomiócitos Análise quantitativa dos grânulos de ANP Número de grânulos A e B por miócito xii

14 4.2.2 Número de grânulos tipo A por miócito Número de grânulos tipo B por miócito Diâmetro dos grânulos de ANP tipo A Diâmetro dos grânulos de ANP tipo B DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS xiii

15 15 1. INTRODUÇÃO 1.1 Os grânulos de ANP Ultraestruturalmente, os cardiomiócitos dos átrios caracterizam-se pela presença de grânulos eletrondensos de número e tamanho variados, situados junto ao núcleo centralmente localizado, próximo a numerosas mitocôndrias, miofibrilas, retículo endoplasmático rugoso e um aparelho de Golgi bem-desenvolvido. Os grânulos contêm um hormônio denominado peptídeo natriurético atrial (ANP), daí serem denominados de grânulos de ANP. Este hormônio é importante no mecanismo de regulação da pressão arterial. A partir dessa descoberta, numerosos trabalhos têm sido realizados sobre os grânulos de ANP (KISCH et al., 1956; PALADE et al., 1961; De BOLD et al., 1981; IIDA et al., 1988; CALIARI; TAFURI, 1993; SILVA et al., 2003). O ANP visa proteger o sistema cardiovascular a partir dos efeitos de sobrecarga do volume sanguíneo. O hormônio é liberado pelos cardiomiócitos na corrente sanguínea que irá atuar em vários tecidos, induzindo à vasodilatação e promovendo a natriurese e diurese. O ANP inibe efeitos de outros hormônios como a endotelina e a vasopressina e do sistema renina-angiotensinaaldosterona e ativa a mobilização e a oxidação lipídica (WIESNER, 2010). A maior parte dos grânulos de ANP está localizada junto ao núcleo do cardiomiócito, em associação com o aparelho de Golgi (PALADE et al., 1961; JAMIESON, 1964; IIDA et al., 1988). Alguns poucos grânulos estão espalhados pelo citoplasma (TOYOSHIMA et al., 1996; SILVA et al., 2003; De SOUZA et al., 2005). Segundo Gama et al. (2006), o número de grânulos de ANP, por ser significativamente maior no átrio direito, sugere uma maior capacidade de síntese de ANP nesse local em relação às outras regiões do coração, indicando que ele é secretado principalmente no átrio direito e em maior quantidade comparado com o átrio esquerdo. Este é um dos motivos pelos quais a maior parte dos estudos sobre os grânulos de ANP tem sido realizada nos grânulos do átrio direito. Os grânulos de ANP medem cerca de 100 a 250 nm de diâmetro, ocorrendo variações nas espécies. Em condições normais, não somente o ANP dos átrios, mas

16 16 todos os peptídeos natriuréticos cardíacos são secretados de forma pulsátil em períodos de 20 a 48 minutos, sendo que a meia-vida do ANP é de 2 a 5 minutos em seres humanos (SILVERTHORN, 2003; CHARLOUX et al., 2008). Os receptores para os peptídeos natriuréticos estão presentes em vários tecidos como coração, sistema vascular, rins, adrenais, pulmões e áreas específicas do sistema nervoso central, indicando uma grande variedade de ações biológicas destes peptídeos (ESPINER, 1994). A maioria desses receptores está localizada principalmente nos glomérulos renais e zona adrenal glomerulosa (CHAI, et al., 1986). Nem todos os grânulos presentes nos cardiomiócitos são iguais. Os autores descrevem quatro diferentes tipos de grânulos nos cardiomiócitos dos átrios, os quais foram classificados de acordo com seu conteúdo e eletrondensidade. São os tipos A, B, C e D. Os grânulos do tipo A e B são os mais estudados e conhecidos. Morfologicamente, segundo Marei (2002), os grânulos do tipo A contêm um material bastante eletrondenso e caracterizam-se pela presença de uma membrana bastante evidente separada do conteúdo por um halo vazio de 20 nm, junto à face interna de sua membrana. São armazenados principalmente nos átrios e em menor quantidade nos ventrículos e rins (GIRALDO, et al., 2011). Os grânulos do tipo B contêm o peptídeo natriurético cerebral (BNP), sendo secretados principalmente pelos cardiomiócitos. São mais pálidos, contendo granulações de aspecto fibroso. Ambos os tipos (A e B) liberam seu conteúdo na circulação sanguínea em resposta à dilatação ventricular e à sobrecarga de pressão. Os respectivos peptídeos promovem natriurese, vasodilatação e inibição do sistema renina angiotensina e da atividade do sistema nervoso simpático. Em relação ao BNP, sua principal fonte de produção são os ventrículos (SEOUNG et al., 2003). O BNP dos grânulos tipo B, que causa aumento do GMP cíclico (Guanosim Monofosfato Cíclico), é o segundo mensageiro intracelular para os peptídeos natriuréticos (Gerzer, 1985; Takahashi, 2003). O BNP é importante para impedir hipertrofia do miocárdio no diabetes, o que comprometeria os mecanismos do seu endotélio (ROSENKRANZ et al., 2003). Os grânulos do tipo C são corpúsculos residuais produzidos por células endoteliais e

17 17 liberam seu conteúdo em resposta ao estímulo de forças de cisalhamento (GIRALDO et al., 2011). Acredita-se ser um vasodilatador derivado do endotélio e tem um efeito antimitótico (WALTHER et al., 2000). Os grânulos do tipo D são pequenos, bastante eletrondensos e menos conhecidos (BERGER; RONA, 1971). Foram isolados de serpente mamba verde (Dendroaspis angusticeps) e sua importância clínica está ainda em estudo (GIRALDO et al., 2011). Os grânulos do tipo A e B, além do ANP, contêm um tipo específico de proteína denominada cromagranina A, que é uma vasostatina que tem efeitos cardiossupresivos (KRYLOVA, 2007). O ANP é liberado dos grânulos quando há distensão da parede atrial, especialmente durante a elevação da pressão arterial, promovendo assim o aumento da concentração plasmática do ANP (LACHANCE et al., 1991; GARCIA, 1974; SEUL et al., 1992; SILVA et al., 2003). No ser vivo, o ANP secretado para a corrente sanguínea atua nos túbulos renais, controlando a ação do sistema renina-angiotensina, o sistema simpático e os fluidos extracelulares e aumentando o fluxo e a permeabilidade capilar. Agindo como vasodilatador, diminui a reabsorção de água e sódio aumentando a natriurese e a diurese diminuindo a volemia e, consequentemente, a pressão arterial (OHBA et al., 2001; MCGRATH et al., 2005). Vários estudos têm sido realizados procurando aplicações para o ANP. Mouton et al. (1992), Massaru et al. (2001); Kitashiro et al. (2001); Sward et al. (2001); Henry, (2002); Mcgrath et al. (2005), por exemplo, mostraram que o ANP poderia ser utilizado como elemento terapêutico em pacientes portadores de problemas circulatórios. Kitashiro et al. (2001), por sua vez, injetaram ANP por via endovenosa para obter redução da pressão sistólica. Finalmente, Massaru et al. (2001) observaram que o ANP pode ser utilizado para promover remodelação do miocárdio em casos de infarto agudo. Trabalho recente (MIYASHITA et al., 2009) sugere que o ANP pode promover biogênese de mitocôndrias e oxidação de gorduras em músculo visando prevenir obesidade e intolerância à glicose. O uso de ANP tem também efeito terapêutico em pacientes com diversas patologias cardíacas e renais, tais como insuficiência cardíaca, fibrilação atrial e disfunção renal, ao

18 18 melhorar a excreção de sódio e a diurese (KITASHIRO et al., 2001; MCGRATH et al., 2005, SWARD et al., 2001). Podemos dizer que a quantidade de grânulos de ANP e o tamanho dos grânulos medem indiretamente a quantidade de ANP presente nos cardiomiocitos dos átrios. 1.2 Efeitos do envelhecimento nos grânulos de ANP Durante o envelhecimento, ocorre diminuição do número de cardiomiócitos tanto nos átrios como nos ventrículos (LAKATTA et al., 1987; THOMPSON, 1988; ANVERSA et al., 1990; FLEG et al., 1995; CHANG et al., 2000; ARONSON, 2003) o que induz à hipertrofia dos cardiomiócitos remanescentes (CHIMENTI et al., 2003). Esta é caracterizada por um pronunciado aumento do número de miofibrilas e por uma relativa redução no número de mitocôndrias e do retículo endoplasmático, fatores responsáveis pela produção e armazenamento de ANP. Todos estes fatores podem sugerir uma diminuição da produção de ANP com o avanço da idade. As informações sobre os efeitos do envelhecimento nos grânulos de ANP do miocárdio dos átrios são escassas e os resultados contraditórios. Além disso, os trabalhos falam sobre grânulos em geral sem especificar os tipos de grânulos a que se referem (tipos A ou B). Segundo WU et al. (1997), no miocárdio do átrio direito do rato idoso, o conteúdo de ANP encontra-se reduzido significantemente enquanto no plasma está aumentado, em relação ao grupo controle, o que sugere maior secreção. MIFUNE et al. (1991) também observaram menor número e menor diâmetro dos grânulos de ANP em átrio direito de gerbil idoso em relação ao jovem, ao passo que Cavallini et al. (1994); Reckelhoff et al. (1992) não observaram diferença significante no número e tamanho dos grânulos de ratos idosos em relação aos ratos jovens. Já Pollack et al. (1997) observaram redução dos níveis de ANP no sangue de ratos idosos, o que sugere menor secreção. Outros autores também verificaram que com o envelhecimento houve aumento dos níveis de ANP no plasma (KORYTKOWSKI; LANDENSON, 1991; TONOLO et al., 1989), por aumento da saída de ANP dos átrios (GIORDAN et al.,1993; WU et al., 1997).

19 19 Se injetarmos extrato de átrios em ratos a pressão arterial diminui nos mais velhos, mas não nos jovens e a secreção de sódio, potássio e urina aumentam igualmente nos dois grupos (LAI et al., 2000; KORYTKOWSKI; LANDENSON, 1991; TONOLO et al., 1989; WU et al., 1997). Os átrios de ratos idosos e jovens respondem da mesma forma a uma injeção aguda de solução salina na veia. Ocorre elevação dos níveis de ANP no plasma e nos átrios tanto nos jovens quanto nos idosos (RECKELHOFF et al., 1992). Outros estudos mostraram no rato e no homem elevação dos níveis de ANP no plasma com o passar da idade (MORROW et al., 1989; KAO et al., 1990). Com o envelhecimento ocorre uma diminuição da pressão arterial ao infundir ANP no sangue de humanos (HAUSDORFF et al., 1995). Provavelmente isso não ocorre devido a diferenças no grau de vasodilatação, ou natriurese ou resposta a catecolaminas; em vez disso, esta resposta hipotensora no idoso deve-se ao maior efeito do ANP no volume cardíaco de ejeção, na resistência periférica ou nas respostas ao barorreflexo no idoso (HAUSDORFF et al., 1995). 1.3 Efeitos do diabetes nos grânulos de ANP O diabetes mellitus (DM) é uma síndrome de etiologia múltipla, decorrente da falta de insulina e ou da incapacidade dela exercer adequadamente seus efeitos. Caracteriza-se por hiperglicemia crônica com distúrbios do metabolismo dos carboidratos, lipídeos e proteínas. As consequências do DM a longo prazo incluem disfunção e falência de vários órgãos, especialmente rins, olhos, nervos, coração e vasos sanguíneos. O DM é progressivo e se agrava a cada dia quando não diagnosticado e tratado a tempo. A intolerância à glicose tende a aumentar com a idade, associando-se a alterações no perfil lipídico (aumento de Triglicérides (TG), diminuição de HDL), hipertensão, aumento dos níveis de fibrinogênio e do peso corpóreo. Essas modificações metabólicas são atribuídas ao aumento da resistência à insulina, característica do DM no idoso (diabetes tipo II) (LERCO et al., 2003). Estudos sobre efeitos do diabetes nos grânulos de ANP dos cardiomiócitos dos átrios são escassos, sendo todos realizados em animais jovens e com resultados discrepantes. Da mesma forma que para o envelhecimento, os artigos sobre efeitos do diabetes nos grânulos não especificam se são do tipo A ou B, mas apenas referem-se a grânulos de ANP. Mifune et al. (1992) e também Matsubara et

20 20 al. (1990) e Yano et al. (1991) mostraram que o número de grânulos nos cardiomiócitos de camundongos diabéticos era maior do que em animais normais. Porém o diâmetro dos grânulos era menor nos animais diabéticos do que nos normais, não permitindo assim uma conclusão. Utilizando então radioimunoensaio verificaram que os níveis de ANP nos cardiomiócitos dos animais diabéticos era maior do que nos normais, o que sugere maior secreção. Em contrapartida, em outro estudo realizado em ratos, Wu et al. (1998) observaram que em ratos jovens diabéticos, por 4 semanas, a concentração de ANP nos átrios era menor em relação ao grupo controle e no plasma era maior do que no grupo controle, sugerindo pois maior secreção para o plasma. Os autores concluíram que a síntese de ANP nos átrios não mudou, mas sua liberação para o plasma foi maior nos animais diabéticos porque o conteúdo de ANP nos átrios havia diminuído. Outros estudos sobre efeitos do diabetes nos cardiomiócitos foram realizados no miocárdio dos ventrículos. Estes estudos mostram resultados discrepantes. Um trabalho realizado em ratos Wistar com 15 semanas de DM induzido mostrou não haver diferenças significantes no miocárdio do ventrículo esquerdo de animais normais e diabéticos (MELO et al., 2004). Alguns autores (MATSUBARA et al., 1990, FREDERSDORF et al., 2004 e OKOSHI et al., 2007) observaram hipertrofia dos cardiomiócitos enquanto outros encontraram atrofia em animais diabéticos (GIACOMELLI; WIENER, 1976; KAWAGUCHI et al., 1999). Do ponto de vista ultraestrutural, trabalhos mostram que os cardiomiócitos do ventrículo esquerdo de animais com DM possuem menor número de retículo endoplasmático e túbulos transversos (THOMPSON, 1988), e a presença de mitocôndrias dilatadas e fragmentadas em cardiomiócitos de ratos diabéticos (GIACOMELLI; WIENER, 1976; REINILA; AKERBLOM 1984; BHIMJI, et al., 1986; e HSIAO et al., 1987) além da presença de corpos lisossômicos eletrondensos perinucleares (MATSUBARA et al., 1990), dados que falam a favor de menor síntese de substâncias nos cardiomiócitos, inclusive do ANP. Neste trabalho pretendemos avaliar os efeitos do envelhecimento sem a doença e com diabetes nos níveis de ANP do átrio direito.

21 21 2. OBJETIVOS 2.1 Geral O objetivo geral do presente trabalho é verificar o efeito do diabetes nos grânulos de ANP dos cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar, em envelhecimento. 2.2 Específico O objetivo específico deste trabalho é avaliar os efeitos do diabetes nos seguintes aspectos dos grânulos de ANP dos cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar, em envelhecimento: 1. Morfologia dos cardiomiócitos; 2. Densidade numérica dos grânulos de ANP do tipo A; 3. Densidade numérica dos grânulos de ANP do tipo B; 4. Diâmetros dos grânulos de ANP do tipo A; e 5. Diâmetros dos grânulos de ANP do tipo B.

22 22 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Animais Foram utilizados 3 grupos de ratos Wistar machos com 9 meses de idade, com 5 animais por grupo: G1 Grupo controle, sacrificado no início do experimento aos 9 meses de idade; G2 Grupo não diabético, sacrificado aos 13 meses de idade; G3 Grupo diabético, a partir dos 9 meses de idade e sacrificado aos 13 meses de idade. Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas (3 e 2 em cada) em ambiente com temperatura de 23º C e ciclo claro-escuro controlado de 12 horas. Os ratos tiveram livre acesso a uma dieta padrão contendo 52% de carboidratos, 21% de proteínas e 4% de lípides (Nuvilab CR1, Nuvtal Nutrientes Ltda., Curitiba-PR) e receberam água ad libitum. Após a eutanásia de cada animal, o coração foi coletado, o átrio direito retirado e processado para análise e captura de imagens ao microscópio eletrônico de transmissão, as quais foram utilizadas para realizar estudos qualitativos e quantitativos nos cardiomiocitos do átrio direito. 3.2 Indução do DM e coleta do material O DM foi induzido nos animais do G3 por uma injeção intravenosa de Streptozootocina (50 mg/kg, Sigma) (WU et al., 1998) após uma noite de jejum (8-10 horas). Ratos não diabéticos ou controle receberam somente veículo (10 mm de tampão citrato, ph 4,5) após uma noite de jejum. Após 30 dias da indução ao DM, foi colhida uma amostra de sangue dos animais do G3, que foram encaminhadas para o laboratório, tendo se constatado a presença de níveis glicêmicos compatíveis com DM. Os valores da glicemia foram os seguintes: mg/dl nos ratos não diabéticos e mg/dl nos animais diabéticos. Os animais de todos os grupos foram eutanasiados com Pentobarbital sódico e seus ventrículos perfundidos com solução salina heparinizada (1 mg/300 ml da

23 23 solução). Os átrios direitos foram retirados e reduzidos a fragmentos de aproximadamente 4 mm³. Os fragmentos foram colocados em solução fixadora de glutaraldeído a 5% em solução tampão de cacodilato de sódio (0,2 m, ph 7,3) durante três horas. A seguir, os fragmentos foram lavados três vezes com a mesma solução tampão por 5 minutos cada vez, e colocados subsequentemente em uma solução de tetróxido de ósmio a 1% em tampão e cacodilato de sódio durante 2 horas. Os fragmentos permaneceram durante a noite no acetato de uranila a 0,5% com sucrose (54 mg/100 ml) e após terem sido lavados com o tampão foram desidratados na série crescente e álcool absoluto e óxido do propileno, durante 8 horas, sob rotação. A seguir, os fragmentos foram incluídos em resina pura durante 5 horas e finalmente deixados na mesma resina a 60º C durante 5 dias. Os cortes ultrafinos foram obtidos com uma faca de diamante, em ultramicrótomo (Sorvall MT- 2), e após terem sido contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo foram utilizados para realizar fotomicrografias dos cardiomiócitos em microscópio eletrônico de transmissão (Jeol) do Instituto de Ciências Biomédicas da USP. 3.3 Análises morfológica e quantitativa dos grânulos de ANP Os estudos morfológico dos cardiomiócitos e quantitativo dos grânulos de ANP do átrio direito foram realizados em microscópio Zeiss, acoplado a um programa de análise de imagens computadorizado (Axio Vision, Zeiss) do Laboratório de Estudos Morfoquantitativos e Imuno-histoquímicos (LEMI) da Universidade São Judas Tadeu, utilizando as imagens de cada animal e de cada grupo, capturadas previamente ao microscópio eletrônico e gravadas em pen-drives. De cada animal foram feitas 10 fotomicrografias eletrônicas, com ampliação final de x6000 para estudo da densidade numérica de grânulos de ANP dos tipos A e B nos cardiomiócitos. Para uniformizar os dados, somente os miócito que continham o núcleo centralmente localizado com os grânulos que coubessem no campo foram fotografados (Figura 1). Pelo mesmo motivo, somente as fotomicrografias com aumento de x15000, que continham parte do núcleo com os grânulos que coubessem no campo foram utilizadas para a medida dos diâmetros dos grânulos dos tipos A e B presentes nos cardi omiócitos (Figura 2).

24 Densidade de grânulos de ANP (número total de grânulos por miócito) Nas fotomicrografias com aumento de x6000, foi obtida a densidade de grânulos de ANP (número de grânulos por miócito) (Figura 1). Figura 1: Micrografia eletrônica de corte de átrio direito de animal do grupo controle, utilizada para determinar a densidade de grânulos de ANP (número por miócito) (setas) no citoplasma do cardiomiócito. Núcleo (N); mitocôndrias (M). Barra: 2 nm

25 Densidade de grânulos de ANP dos tipos A e B (número por miócito) Nas fotomicrografias com aumento de x15000, foi obtida a densidade de grânulos de ANP dos tipos A e B (número de grânulos por miócito) (Figura 2) Diâmetro médio dos grânulos dos tipos A e B Nas fotomicrografias com aumento de x15000, foram feitas as medidas dos diâmetros dos grânulos de ANP, dos tipos A e B presentes no citoplasma dos cardiomiócitos, em cada campo (Figura 2). Nas figuras 2 e 3, são vistos grânulos do tipo A e do tipo B. Em todos os grupos, foram encontrados grânulos de ambos os tipos. Os grânulos do tipo A geralmente são maiores que os do tipo B. Estes apresentam um aspecto arredondado com minúsculas saliências pontiagudas emergindo do grânulo como se fossem espículas. Geralmente são pequenos e de diâmetro menor que os do tipo A. Os grânulos do tipo A, ao contrário, têm a superfície lisa, apresentam um membrana envolvente, são arredondados e contêm um halo em torno de material eletrondenso no interior. Figura 2: Micrografia eletrônica de corte de átrio direito de animal do G1, utilizada para contagem e medida do diâmetro dos grânulos de ANP tipo A (setas brancas) e tipo B (setas pretas) do citoplasma do cardiomiócito. Núcleo (N); M Mitocôndrias; G Aparelho de Golgi. Barra: 1 nm.

26 26 Figura 3: Micrografia eletrônica de corte de átrio direito de animal do G1, mostrando grânulos dos tipos A e B, em meio a mitocôndrias (M) próximos ao núcleo dos cardiomiócitos (N). Barra: 1 nm.

27 Análise estatística Os dados obtidos para cada parâmetro foram tabulados, as médias calculadas e comparadas estatisticamente entre os grupos, para verificar os efeitos do envelhecimento sobre cada parâmetro e a influência do DM sobre estes efeitos. As comparações estatísticas entre as médias dos grupos de animais foram feitas utilizando o Anova e o teste pos hoc de Tukey com nível de significância de 0,05.

28 28 4. RESULTADOS 4.1 Análise morfológica dos grânulos de ANP dos cardiomiócitos Os cortes ultrafinos dos cardiomiócitos mostram padrões diferentes com variações nos grupos estudados. Os cardiomiócitos apresentam núcleo central com cromatina dispersa no núcleo e citoplasma contendo número variado de grânulos de ANP, junto ao núcleo, miofilamentos com seu aspecto típico, formado por sarcômeros nos quais se destacam as linhas Z. Numerosas mitocôndrias podem ser vistas no citoplasma (Figura 4). Figura 4: Micrografias eletrônicas de cortes dos átrios direitos de ratos dos grupos G1 (A), G2 (B) e G3 (C) mostrando o núcleo (N), e grânulos de ANP (setas) em meio às organelas citoplasmáticas. Observar menor número de grânulos em G3 em relação a G1 (A) e G2 (B). Barra: 2 nm.

29 29 Nos animais do G1, os grânulos de ANP aparecem bem corados, com características morfológicas nítidas, permitindo diferenciar facilmente os do tipo A e B. Da mesma forma, as diferentes organelas aparecem com sua morfologia típica (Figura 5). Figura 5: Micrografia eletrônica de corte de átrio direito de animal do G1, mostrando grânulos dos tipos A (setas pretas) e B (setas brancas), em meio a mitocôndrias (M) e miofibrilas (MF) próximos ao núcleo do cardiomiócito (N). G-Aparelho de Golgi. Barra: 1 nm.

30 30 Nos animais do G2, aparecem grânulos de ANP bem corados, ao lado de outros, pouco corados, com características morfológicas diferentes das do grupo controle: pálidos e sem apresentar o halo característico dos grânulos do tipo A ou as espículas superficiais do tipo B (Figura 6). Figura 6: Micrografia eletrônica de corte de átrio direito de animal do G2 não diabético, mostrando grânulos dos tipos A, bem corados (setas brancas), e outros, tipo B, com coloração pobre (setas pretas) miofibrilas (MF) próximos ao núcleo dos cardiomiócito (N). G-Aparelho de Golgi. Barra: 1 nm.

31 31 Nos animais do G3, os grânulos de ANP são menores que os dos grupos G1 e G2 e pouco corados. A membrana nuclear apresenta invaginações, que a tornam de contorno irregular. As mitocôndrias são pouco coradas e de forma irregular, sendo suas cristas não visíveis (Figura 7). Tanto no G2 como no G3, grânulos não identificados não foram considerados para efeitos quantitativos. Figura 7: Micrografia eletrônica de corte de átrio direito de animal do G3, mostrando grânulos dos tipos A (setas brancas), e outros com coloração pobre, tipo B (setas pretas). (N) Núcleo. A membrana nuclear apresenta invaginações para o interior do núcleo (setas azuis). M Mitocôndrias aparecem deformadas e praticamente não coradas, sendo suas cristas não visíveis. Barra: 1 nm.

32 Análise quantitativa dos grânulos de ANP Número de grânulos A e B por miócito Neste gráfico, foram analisados os valores das médias e desvios-padrão relativos ao número de grânulos de ANP, tipos A e B em conjunto, por miócito nos 3 grupos estudados. A comparação estatística desses valores apresentou diferença significativa entre os grupos G2 (74,8 ± 8,1) e G3 (50,4 ± 6,2) (p<0,05). Figura 8: Gráfico representativo do número de grânulos de ANP A e B por miócito nos três grupos estudados. * Significante vs G2.

33 Número de grânulos tipo A por miócito Os valores das médias e desvios-padrão relativos ao número de grânulos de ANP, tipo A por miócito nos 3 grupos estudados estão apresentados na figura 9. A comparação estatística desses valores trouxe diferença significativa entre os grupos G2 (58 ± 4) e G3 (41 ± 3) (p<0,05). Figura 9: Gráfico representativo do número de grânulos de ANP, tipo A por miócito nos três grupos estudados. * Significante vs G2.

34 Número de grânulos tipo B por miócito Os valores das médias e desvios-padrão relativos ao número de grânulos de ANP, tipo B por miócito nos 3 grupos estudados estão apresentados na figura 10. A comparação estatística desses valores mostrou não haver diferença significativa entre os valores dos grupos G1 (13,5 ± 5), G2 (14 ± 3) e G3 (12 ± 4) (p>0,05), porém G1 e G3 se mantiveram. Figura 10: Gráfico representativo do número de grânulos de ANP, tipo B por miócito nos três grupos estudados. * Significante vs G2.

35 Diâmetro dos grânulos de ANP tipo A Os valores das médias e desvios-padrão relativos ao diâmetro dos grânulos de ANP (nm) do tipo A nos 3 grupos estudados estão apresentados na figura 11. A comparação estatística desses valores apresentou diferença significativa entre os grupos G3 (42 ± 0,9) e G1 (49,9 ± 0,8) e entre os grupos G3 (42 ± 0,9) e G2 (48 ± 1,4) (p<0,05). Figura 11: Gráfico representativo do diâmetro médio (nm) dos grânulos de ANP tipo A nos três grupos estudados. * Significante vs G1 e G2.

36 Diâmetro dos grânulos de ANP tipo B Os valores das médias e desvios-padrões relativos ao diâmetro dos grânulos de ANP (nm) do tipo B nos 3 grupos estudados estão apresentados na figura 12. A comparação estatística desses valores não apresentou diferença significativa entre os grupos G1 (42,2 ± 0,2), G2 (41,2 ± 0,8) G3 (39 ± 0,2). Figura 12: Gráfico representativo do diâmetro médio (nm) dos grânulos de ANP tipo B nos três grupos estudados.

37 37 O histograma da distribuição de frequências dos valores dos diâmetros dos grânulos de ANP (µm) do tipo A nos 3 grupos estudados está apresentado na figura 13. A observação da figura mostra que nos animais do G3 houve uma diminuição dos grânulos de tamanho pequeno e médio em relação aos valores do G1 enquanto no G2 houve uma distribuição praticamente semelhante aos valores de G1. Figura 13: Histograma de distribuição de frequências dos valores dos diâmetros dos grânulos de ANP (nm) do tipo A nos grupos de animais estudados.

38 38 O histograma da distribuição de frequências dos grânulos de ANP (µm) do tipo B de acordo com seus diâmetros nos 3 grupos estudados está apresentado na figura 14. A observação dessa figura mostra que nos animais do G3 houve uma discreta diminuição dos grânulos de tamanho pequeno e médio em relação aos valores do G1 enquanto no G2 houve uma distribuição praticamente semelhante aos valores de G1. Figura 14: Histograma de distribuição de frequências dos valores dos diâmetros dos grânulos de ANP (nm) do tipo B nos grupos de animais estudados.

39 39 5. DISCUSSÃO O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos do diabetes nos grânulos de ANP do átrio direito de ratos Wistar durante o período de envelhecimento. Foram sacrificados animais com 9 meses de idade, com 13 meses de idade não diabéticos e com 13 meses de idade, diabéticos desde os 9 meses de idade. Os animais com 13 meses de idade foram considerados como se estivessem começando a envelhecer, de acordo também com outros autores (ÁGUILA et al., 1998). O diabetes foi induzido por injeções de streptozotocina de forma semelhante à realizada por outros autores (WU et al., 1998). A análise dos grânulos de ANP foi realizada em fotomicrografias eletrônicas dos cardiomiócitos de todos os grupos, as quais foram submetidas a técnicas morfométricas em sistema de análise de imagens computadorizado apropriado. Após a análise morfológica e o término das contagens e medidas dos grânulos de ANP e da análise estatística dos dados, os resultados mostraram alterações promovidas nos cardiomiócitos e nos grânulos de ANP tanto pelo envelhecimento como pelo diabetes e envelhecimento. Embora se saiba que existem 4 tipos de grânulos (A, B, C e D), foram analisados apenas os efeitos sobre grânulos dos tipos A e B, que são os mais conhecidos e estudados (BERGER; RONA, 1971; MAREI, 2002; GIRALDO et al., 2011). O envelhecimento isoladamente produziu efeitos relativamente discretos nos cardiomiócitos e nos grânulos de ANP, tanto nos do tipo A como nos do B. Porém, quando associado ao diabetes, seus efeitos foram bastante evidentes. Com o envelhecimento ocorreram efeitos especialmente morfológicos nos grânulos de ANP, os quais apareceram pouco corados e sem apresentar suas características típicas, dificultando assim que sejam identificados se do tipo A ou do tipo B. Os resultados deste trabalho mostram que, diferentemente de outros autores (KORYTKOVSKI; LANDENSON, 1991; e WU et al., 1997), o envelhecimento não promoveu alterações significantes na quantidade de ANP do átrio direito. Wu et al.

40 40 (1997) e Lai et al. (2000), por exemplo, mostraram diminuição dos níveis de ANP no átrio de ratos idosos. Em princípio, esta diferença de resultados entre o presente trabalho e o dos autores citados poderia ser explicada pelo fato de que utilizamos animais ainda no início do envelhecimento, e que não teriam sofrido os efeitos evidentes desse processo, ao contrário daqueles autores que utilizaram animais mais velhos (16 e 18 meses). Entretanto, pesa contra este argumento o fato de Reckelhoff et al. (1992) terem encontrado resultados semelhantes aos nossos mesmo em ratos com 21 meses de idade. Uma possível explicação para estes resultados diferentes é que sejam devidos a diferentes metodologias utilizadas por nós e pelos vários autores. Foi demonstrado que a resposta natriurética ao ANP (OR et al., 1993; POLLACK et al., 1997) e a ação hipotensora do ANP (MULKERRIN et al., 1993) são ambas atenuadas com o envelhecimento, o que poderia contribuir para o aumento da pressão arterial frequente no envelhecimento. A princípio pensou-se que a menor capacidade do rim do idoso de excretar sódio (menor resposta natriurética ao ANP) poderia ser consequência de uma menor sensibilidade deste órgão ao ANP. Entretanto, depois, outros trabalhos mostraram que este fenômeno não se deve a uma diminuição de sensibilidade renal à ação do ANP (DEPRIEST et al., 1990). Sugeriu-se então que os cardiomiócitos dos idosos é que seriam menos sensíveis ao excesso de cloreto de sódio no sangue, pois tanto a elevação de pressão como de sódio no sangue são fatores que estimulam a ação do ANP. Para confirmar ou não esta hipótese, Reckelhoff et al. (1992) injetaram uma solução salina hipertônica em ratos jovens e idosos e verificaram que os níveis de ANP nos átrios de ambos os grupos eram semelhantes, concluindo que os corações dos animais idosos respondiam da mesma forma que os de jovens expostos a uma sobrecarga de cloreto de sódio. Ou seja, a menor capacidade do idoso de excretar sódio não é devida a uma menor habilidade do miocárdio dos átrios de produzir ou secretar ANP. Estes resultados sugerem, portanto, uma capacidade normal dos cardiomiócitos do idoso de sintetizar ANP.

41 41 Lai et al. (2000) lançaram a hipótese de que o rim do idoso responde menos à ação do ANP, para excretar sódio, porque ocorreriam alterações nessa ação. Realmente esta suspeita se confirmou, pois estes autores realizaram um trabalho em que injetaram extrato de átrios de ratos idosos e jovens em ratos de 4 meses de idade e verificaram diferentes respostas destes dois grupos à ação da injeção do ANP. Os resultados mostraram que os extratos de átrios de ratos idosos tinham uma ação hipotensora maior que a dos extratos de ratos jovens. Sugeriram que este resultado poderia ser uma ação compensatória para prevenir elevações de pressão que ocorrem nos idosos. O presente trabalho mostrou que o envelhecimento de seres com diabetes promoveu efeitos morfológicos significantes nos grânulos de ANP: eles são menores que os dos animais jovens e idosos normais e pouco corados. Além disso, estão presentes em menor número nesse grupo do que nos demais. A membrana nuclear apresentou invaginações, tornando-a de contorno irregular. As mitocôndrias são pouco coradas e possuindo forma irregular, sendo suas cristas não visíveis. O diabetes promoveu também alterações quantitativas no ANP. Houve diminuição dos níveis de ANP, representada pela redução do número de grânulos do tipo A tal como observado também por outros autores (TODD et al., 1990), mas não do tipo B nos animais idosos diabéticos (tal como observado por Rosenkranz et al., 2003). Podemos aventar três hipóteses para explicar a diminuição do ANP do tipo A nos cardiomiócitos de animais diabéticos idosos: 1ª) o nível de ANP diminuiu por uma redução da produção; 2ª) houve diminuição de ANP por aumento da secreção para a corrente sanguínea; e 3ª) os receptores para ANP no rim respondem menos à ação do ANP. Quanto à segunda hipótese, cremos que é a menos viável. É conhecido que o diabetes pode levar a alterações no balanço hidroeletrolítico, afetando o volume sanguíneo e consequentemente a pressão arterial (HEBDEN et al., 1986). Sabe-se que o ANP tem uma participação importante na manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico e no controle da pressão arterial (ANANDA-SRIVASTAVA; TRACHTE, 1993; ESPINER et al., 1995). Como neste caso, os animais não eram hipertensos, não haveria necessidade de maior eliminação do ANP para a corrente

42 42 sanguínea levando a uma redução de seus níveis nos cardiomiócitos. Entretanto, trabalho de McKenna et al. (2000) mostrou que os níveis de ANP estavam aumentados no plasma de diabéticos, quando recebiam uma infusão de glicose intravenosa, mostrando que o ANP era liberado ao aumentar a glicemia. Quanto à terceira hipótese, há possibilidades que ela tenha influído, pois O Hare et al. (1986); Jungmann et al. (1988) demonstraram que a ação natriurética do ANP estava diminuída em pacientes com diabetes tipo I. Entretanto, os mecanismos responsáveis por estes fenômenos permanecem não elucidados envolvendo problemas com os receptores de ANP e níveis reduzidos de ANP nos cardiomiócitos (MIFUNE et al., 1992). Na verdade, temos que lembrar que tudo isso são hipóteses, pois a quantidade de ANP no plasma de diabéticos ainda tem resultados contraditórios. Smoyer et al. (1990) encontraram aumento de ANP no plasma, enquanto Predel et al. (1990) observaram níveis normais de ANP no plasma de diabéticos humanos. Em ratos, os resultados também são discrepantes: vários autores encontraram aumento de ANP sanguíneo (ORTOLA et al., 1987; TODD et al., 1990; JIN ET al., 1991), enquanto outros não observaram essa elevação (HEBDEN; MCNEILL, 1988). Assim sendo, a primeira hipótese parece ser mais cabível neste caso. Sabemos que com o envelhecimento, há uma redução geral das funções na maioria dos tecidos por alterações estruturais e ultraestruturais de suas células e substâncias intercelulares (GAMA et al., 2006). No miocárdio dos átrios não deve ser diferente. Essas alterações devem levar a uma diminuição da produção de ANP. Devemos ainda acrescentar o fato de que o diabetes também tem uma ação deletéria, pois, como foi demonstrado neste trabalho, a maioria das organelas citoplasmáticas apresentava-se pouco evidentes e com sinais de degeneração. Assim sendo, podemos aceitar que o diabetes associado ao envelhecimento promove redução da produção de ANP. Já o tipo B de ANP não sofreu modificações com o diabetes, confirmando sua importância para evitar alterações no miocárdio, como proposto por Rosenkranz et al. (2003).

43 43 As alterações promovidas pelo diabetes no ANP dos cardiomiócitos em jovens devem ser também incluídas no conjunto dos fatores responsáveis pelas alterações hidroeletrolíticas causadas pelo diabetes, em idosos.

44 44 CONCLUSÃO Após a análise dos dados deste trabalho, referentes aos efeitos do diabetes associado ao envelhecimento nos grânulos de ANP do átrio direito de ratos Wistar, podemos concluir que: 1. O envelhecimento promoveu alterações morfológicas ultraestruturais discretas nos cardiomiócitos e nos grânulos de ANP. 2. O envelhecimento associado ao diabetes produziu alterações morfológicas ultraestruturais mais evidentes nos cardiomiócitos do átrio direito. 3. O envelhecimento associado ao diabetes produziu diminuição significante nos níveis de ANP do tipo A, mas não do tipo B nos cardiomiócitos do átrio direito.

45 45 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGUILA, M.B.; MANDARIM, L. C.A.; APFEL MI. Stereology of the myocardium in young and aged rats. Arq. Bras. Cardiol. Rio de Janeiro: Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro-UERJ, vol. 70, n. 2, p , fev ANANDA-SRIVASTAVA, M.B.; TRACHTE, G.J., Atrial natriuretic factor receptors and signal transduction mechanisms. Pharmacol Rev. Quebec: Department of Physiology, Faculty of Medicine, Groupe de recherche sur le système nerveux autonome, University of Montreal, vol. 45, n. 4, p , dez ANVERSA, P.; CAPASSO, J.M. Cellular basis of aging in the mammalian heart Scanning Microsc., vol. 5, n. 4, p , dez (Discussion M Associação Americana de Diabetes. Standards of medical care in diabetes. Diabetes Care. 2006; 29:s4-s42). ARONSON, D. Cross-linking of glycated collagen in the pathogenesis of arterial and myocardial stiffening of aging and diabetes. J. Hypertens., vol. 21, p. 3-12, BERGER, J.M.; RONA, G. Functional and fine structural heterogeneity of atrialcardiocytes. Methods Achiev Exp Pathol, vol. 5, p , BHIMJI, S.; GODIN, D.V.; MCNEILL, J.H. Myocardial ultrastructural changes in alloxan-induced diabetes in rabbits. Acta Anat. (Basel)., vol. 125, p , CALIARI, M. V.; TAFURI, W.L.; DÉCOURT, Luiz V. O coração endócrino. A descoberta do peptídeo natriurético atrial. Belo Horizonte: Instituto de Ciências Biológicas da UFMG e Instituto de Ciências Exatas e Biológicas da UFOP, CAVALLINI, G.; CLERICO, A.; DEL CHICCA, M.; GORI, Z.; BERGAMINI, E. Changes in endocrine atrial rat cardiocytes during growth and aging: an