RESPOSTA CELULAR NO ENCÉFALO DE COELHOS EXPERIMENTALMENTE INOCULADOS COM HERPESVIRUS BOVINO 5 (BoHV-5)

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL RESPOSTA CELULAR NO ENCÉFALO DE COELHOS EXPERIMENTALMENTE INOCULADOS COM HERPESVIRUS BOVINO 5 (BoHV-5) Francisco Javier Pedraza-Ordóñez Médico Veterinário JABOTICABAL - SÃO PAULO - BRASIL 2012

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL RESPOSTA CELULAR NO ENCÉFALO DE COELHOS EXPERIMENTALMENTE INOCULADOS COM HERPESVIRUS BOVINO 5 (BoHV-5) Francisco Javier Pedraza-Ordóñez Orientador: Co-orientadora: Prof. Dr. Antonio Carlos Alessi Prof a. Dr a. Noeme Sousa Rocha Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária (Patologia Animal). JABOTICABAL - SÃO PAULO - BRASIL Janeiro de 2012

3 P371r Pedraza Ordóñez, Francisco Javier Resposta celular no encéfalo de coelhos experimentalmente inoculados com herpesvírus bovino 5 (BoHV-5). / Francisco Javier Pedraza Ordóñez. Jaboticabal, 2012 xiv, 59 f. : il. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2012 Orientador: Antonio Carlos Alessi Co-orientadora: Noeme Sousa Rocha Banca examinadora: Gisele Fabrino Machado, Mary Suzan Varaschin, Rosemery de Oliveira Vasconcelos, Luiz Carlos Marques. Bibliografia 1. Doença nervosa. 2. Quantificação viral. 3. Bovinos. 4. Marcadores moleculares. 5. Infecção por herpesvirus. 6. Modelo animal. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 619:616.83:636.2 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.

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5 iii DADOS CURRICULARES DO AUTOR FRANCISCO JAVIER PEDRAZA-ORDOÑEZ nasceu em São Sebastião, Colômbia, em agosto de Formado no colégio Champagnat de Popayán (primeira a quarta series), Colégio São Francisco de Popayán (quinta a oitava series), Colégio São Francisco de Tuluá (ensino médio). Graduou-se em Medicina Veterinária na Universidade de Antioquia em Medellín-Colômbia (1993), Especialista em Patologia Animal pela mesma Instituição (1996) e Mestrado em Medicina Veterinária (Patologia Animal) da Universidade Estadual Paulista (FCAV-UNESP), câmpus de Jaboticabal, SP, Brasil (2003). Professor substituto na Universidade de La Paz em Barrancabermeja, Colômbia (1996), Professor efetivo na área de Patologia na Universidade (privada) Antonio Nariño, em Popayán ( ). Prestou concurso de méritos para ingressar como Professor efetivo na Universidade de Caldas em 1999, atuando na área da Patologia Veterinária. Membro fundador do Grupo de pesquisa CIENVET (Ciências Veterinárias), categorizado A1 por Colciencias (Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia, Ministério da Educação da Colômbia), membro fundador e atual Diretor do Grupo de Pesquisa em Patologia Veterinária (2004), classificado na categoria B de Colciencias. Promoveu a criação do Programa de Mestrado em Ciências Veterinárias, na Universidade de Caldas (2005) que atualmente possui 8 profissionais formados e 18 estudantes em formação. Desde 2009 é doutorando no Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária da FCAV-UNESP, sob orientação do Prof. Dr. Antonio Carlos Alessi.

6 iv AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer a todas as pessoas que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização desta Tese e de forma particular agradeço: Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Alessi, da FCAV-UNESP, câmpus de Jaboticabal, pela confiança, amizade e pela honrosa oportunidade de trabalhar sob a sua orientação e exemplo, como profissional e ser humano. À Profa. Dra. Noeme Sousa Rocha, da FMVZ-UNESP, câmpus de Botucatu, pela co-orientação, amizade, conselhos, ajuda e disponibilização do Laboratório de Patologia Investigativa e Comparada, para a elaboração deste trabalho. Ao Prof. Dr. Eduardo Furtado Flores, da UFSM, Rio Grande do Sul, por gentilmente ter cedido os blocos contendo encéfalos de coelhos experimentalmente infectados com o BoHV-5 e o anticorpo monoclonal 2F9 para a realização das avaliações imuno-histoquímicas no presente estudo. Ao Prof. Dr. João Pessoa Araujo Jr., do Instituto de Biociências da UNESP, câmpus de Botucatu, pela ajuda e disponibilização do Laboratório de Virologia, para a elaboração deste trabalho. À Profa. Dra. Márcia Guimarães da Silva, da UNESP, Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu, pela doação do kit e conselhos para extração do DNA viral a partir de tecidos com parafina. Aos colegas, Ricardo Yamatogui, Breno Salgado, Fabrizio Grandi, Larissa Doddi Marcolino, da UNESP em Botucatu, pela oportuna ajuda no Laboratório.

7 v À Universidad de Caldas em Manizales, Colombia por facilitar meu afastamento para fazer o Doutorado. Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) de Brasil, pela concessão da bolsa de Doutorado. Um agradecimento especial à minha família, minha esposa Lina Fernanda e meu filho Samuel, por me acompanhar nesta bela experiência chamada Doutorado, com paciência, carinho e dedicação, sem eles não teria logrado o triunfo. Agradeço também a meu Pai Fúlvio Antonio, meu Irmão Dúmer Antonio, aos todos meus sobrinhos e demais familiares que apesar da distância, sempre estão na torcida por mim. Especialmente agradeço a minha Mãe, María Dora, que desde o Céu me fortalece e da energia para alcançar cada objetivo na minha vida. Este trabalho foi possível graças ao apoio de muitas pessoas mais, que me incentivaram para continuar sempre para a frente, a todas elas, muito obrigado.

8 vi SUMÁRIO Pag SUMARIO... LISTA DE TABELAS... LISTA DE FIGURAS... LISTA DE ABREVIATURAS... RESUMO... SUMMARY... vi viii ix xi xiii xiv 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Descrição do BoHV Epidemiologia Patogenia Achados clínicos e diagnóstico diferencial Alterações macroscópicas Alterações microscópicas Diagnóstico Características moleculares do BoHV Patogenia da malacia ocasionada pelo BoHV JUSTIFICATIVA OBJETIVOS Geral Específicos

9 vii 5. MATERIAL E MÉTODOS Amostras de encéfalo Análise imuno-histoquímica Real time PCR (qpcr) Extração do DNA Quantificação das amostras Análise estatística RESULTADOS Achados histopatológicos Achados imuno-histoquímicos Imunodetecção de linfócitos T Imunodetecção de linfócitos B Imunodetecção de macrófagos Imunodetecção de astrócitos Imunodetecção do BoHV Quantificação viral pela real time PCR (qpcr) DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXOS... 56

10 viii LISTA DE TABELAS Tabela 1. Relação de anticorpos utilizados para detectar células inflamatórias e agente viral em cérebro de coelhos experimentalmente infectados pelo BoHV-5... Tabela 2. Aspectos morfológicos pesquisados em diferentes regiões do encéfalo de um coelho experimentalmente infectado com o BoHV-5... Tabela 3. Percentagem de partículas víricas detectadas no encéfalo de coelhos experimentalmente infectados com o BoHV-5... Tabela 4. Valores médios dos diâmetros maior e menor, assim como da área de astrócitos medidos no hipocampo dos coelhos D4 e C1... Pag

11 ix Figura 1. LISTA DE FIGURAS Representação gráfica das regiões do encéfalo de coelho usadas na presente pesquisa. Na parte superior uma vista sagital do encéfalo mostrando as regiões do hipocampo (HI/CP), tálamo (TA), córtex anterior (CA), bulbo olfatório e córtex olfatório (BO/CO). Na parte inferior uma vista dorsal mostrando a região do córtex ventro lateral e dorso lateral (CVL/CDL)... Pag 15 Figura 2. Curva de dissociação (95 C por 15 s, 60 C por 30 s e 95 C por 15 s), no eixo da X aparecem os valores relativos da quantidade de BoHV-5 achado, no eixo Y os valores de temperatura de fusão na qual foi possível a amplificação das amostras positivas (incluídos dois controles), iniciador utilizado sugerido por Gomes et al. (2002) Figura 3. Fotomicrografia do encéfalo de coelho experimentalmente infectado com o BoHV-5. Coloração de H&E, 40X. Notar a presença de neurônios necróticos (setas). A. Imagem histológica do hipocampo (HI/CP) do coelho controle. B. Discreto manguito perivascular no Tálamo (TA) do coelho D4... Figura 4. Fotomicrografia do encéfalo do coelho experimentalmente infectado com o BoHV-5 mostrando um manguito perivascular com imunomarcação para Linfócitos T (anti-cd3 policlonal). Note a participação dos linfócitos T na resposta inflamatória nas áreas 1 (manguito perivascular) e 2 do fragmento tecidual (Barra = 50 μm, streptavidina HRP, objetiva 40X). A. Controle negativo, linfonodo de coelho, 40 X. B. Controle positivo, linfonodo de coelho... Figura 5. Fotomicrografia do encéfalo de coelho experimentalmente infectado com o BoHV-5, mostrando um manguito perivascular com imunomarcação para Linfócitos B (anti-bla monoclonal). Pode-se notar algumas células que fazem parte da reação ao redor do vaso sanguíneo (Barra = 50 μm, streptavidina HRP, objetiva 40X). A. Controle negativo, linfonodo de coelho. B. Controle positivo, linfonodo de coelho... Figura 6. Fotomicrografia do hipocampo de coelho experimentalmente infetado com o BoHV-5 mostrando imunomarcação para macrófagos nas setas pretas e fragmentos do núcleo dos neurônios necróticos na seta branca (anti-mac, monoclonal. Barra = 50 μm, streptavidina HRP, objetiva 20X). A. Controle negativo, linfonodo de coelho (40X). B. Controle positivo, linfonodo de coelho (40X)... Figura 7. Fotomicrografia do hipocampo de coelho mostrando imunomarcação para astrócitos, (Barra = 50 μm, streptavidina HRP, objetiva 40X). A. As setas mostram alguns astrócitos imunomarcados no hipocampo do coelho D4. B. Hipocampo do coelho D4 mostrando um padrão de marcação similar quando comparado com o hipocampo do coelho controle. C. Hipocampo do coelho controle (40X)

12 x Figura 8. Mensurações dos astrócitos no HI/CP do encéfalo de coelho. As barras representam a media do valor das mensurações dos diâmetros maior e menor dos astrócitos, assim como da área obtida a partir desses dados... Figura 9. Fotomicrografia do hipocampo de coelho experimentalmente infetado com o BoHV-5 mostrando imunomarcação para o vírus usando o anticorpo monoclonal 2F9 (Barra = 50 μm streptavidina HRP, objetiva 40X). A. Controle positivo córtex cerebral de coelho, as setas indicam a imunomarcação positiva. B. Controle positivo, córtex cerebral de bovino experimentalmente infectado com o BoHV-5. Note os corpos de inclusão, setas brancas. C. Hipocampo do Coelho D4, a imunomarcação aconteceu no núcleo e no citoplasma dos neurônios... Figura 10. Observa-se picos bem definidos da qpcr mostrando os casos positivos (incluindo os controles) usando os iniciadores sugeridos por Gomes et al. (2002). Os controles foram testados como esta descrito no Anexo D... Figura 11. Na parte superior observa-se os casos positivos por qpcr com os iniciadores sugeridos por Gomes et al. (2002), inclui dois controles e dois casos das amostras. Na parte inferior observa-se a qpcr usando os iniciadores sugeridos por Campos et al. (2009), note-se a quantidade de picos inespecíficos que não permitem supor a positividade dos casos analisados

13 xi LISTA DE ABREVIATURAS AOP-1 Proteína antioxidante 1 BO BoHV CA CO COBEA CVL/CDL DR EEB Bulbo olfatório Herpesvírus bovino Córtex anterior Córtex olfatório Colégio Brasileiro de Experimentação Animal Córtex ventro e dorso lateral Rafe dorsal Encefalopatia espongiforme bovina EVI-340/96 Estirpe viral (BoHV-5) gc gd ge gi HI/CP IBR LC MAPA MDBK MMPs ON PEM qpcr SV-507/99 Glicoproteína C Glicoproteína D Glicoproteína E Glicoproteína I Hipocampo e córtex posterior Rinotraqueite infecciosa bovina Locus coerulus Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento Linhagem celular (Madin Darby Bovine Kidney) Metaloproteinase de matriz Oxido nítrico Polioencefalomalacia Reação em cadeia da polimerase quantitativa (tempo real Estirpe viral (BoHV-5)

14 xii TA TG TICD 50 TX-89 UFSM Us9 VEV tif Tálamo Gânglio trigêmeo Doses infecciosas (50%) em cultura de tecido Estirpe viral (BoHV-5) Universidade Federal de Santa Maria Proteína viral (BoHV-5) Vírus da estomatite vesicular Proteína viral (BoHV-5)

15 xiii RESPOSTA CELULAR NO ENCÉFALO DE COELHOS EXPERIMENTALMENTE INOCULADOS COM HERPESVIRUS BOVINO 5 (BoHV-5) RESUMO O BoHV-5 é um alfa herpesvírus neurovirulento, que causa meningoencefalite fatal em bezerros. A morbidade é baixa contrastando com uma alta mortalidade, embora alguns animais possam-se recuperar. Varias pesquisas tem sido desenvolvidas para determinar a patogênese deste tipo de doença. No presente trabalho coelhos experimentalmente infectados com o Herpesvírus Bovino 5 (BoHV-5) foram submetidos a análise imuno-histoquímica e molecular, mediante a real time PCR, para descrever a resposta inflamatória em seis diferentes regiões do seu encéfalo. Todos os animais mostraram sinais neurológicos severos e foram eutanasiados vinte dias após a infecção inicial. Microscopicamente foi descrita uma meningoencefalite não supurativa, caracterizada por meningite, manguitos perivasculares mononucleares e malacia, mas não foram observados corpúsculos de inclusão viral. Os linfócitos T constituíram uma alta percentagem das células mononucleares envolvidas na neuroinflamação. Não foram encontradas diferenças significativas na resposta astrocitária quando comparados o grupo experimental e o grupo controle (p > 0,05). A quantificação viral pela qpcr permitiu achar partículas virais em todas as regiões encefálicas, de todos os animais do grupo experimental, sendo diretamente proporcional a quantidade de vírus e a visualização de lesões histológicas no encéfalo dos coelhos, assim como a imunodetecção do BoHV-5 pela imunohistoquímica. É possível suspeitar de um forte envolvimento do sistema imunitário do hospedeiro que fez a maioria dos animais reagir de maneira diferente ante a mesma quantidade do inóculo viral ministrado. Palavras-Chave: Encefalite viral, Estudo comparativo, Infecção por herpesvirus, Marcadores moleculares, Modelo animal, Quantificação viral.

16 xiv CELLULAR RESPONSE IN BRAIN OF RABBITS EXPERIMENTALLY INOCULATED WITH BOVINE HERPESVIRUS 5 (BoHV-5). SUMMARY The BoHV-5 is a neurovirulent alpha herpesvirus, which causes fatal meningoencephalitis in calves. The morbidity is low in contrast with a high mortality, although some animals can heal. Several surveys have been developed trying to better understand the pathogenesis of this type of disease. In this study rabbits experimentally infected with bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) were subjected to immunohistochemical and molecular analysis by real time PCR, to describe the inflammatory response in six different regions of his brain. All animals showed severe neurological signs and were euthanized twenty days after the initial infection. Microscopically was described a meningoencephalitis characterized by nonsuppurative meningitis, mononuclear perivascular cuffs and malacia, but were not observed viral inclusion corpuscles. T lymphocytes constituted a high percentage of mononuclear cells involved in neuroinflammation and there were no significant differences in astrocyte response when comparing the experimental and control groups (p> 0.05). The viral quantification by qpcr allowed found viral particles in all brain regions of all experimental animals, being directly proportional to the amount of virus and the visualization of lesions in the brain of rabbits, as well as immunodetection of BoHV-5 by immunohistochemistry. It is possible to suspect a strong engagement of the host immune system that made the majority of animals respond differently compared to the same administered amount of viral inoculum. Keywords: Animal model, Comparative study, Herpesvirus infection, Molecular markers, Viral quantification, Viral encephalitis.

17 1 1. INTRODUÇÃO O herpesvírus bovino (BoHV-1 e BoHV-5) causa doenças respiratórias, reprodutivas e nervosas em animais susceptíveis. São vírus DNA, da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesviridae, gênero Varicellovírus (ROIZMAN & PELLETT 2001). O BoHV-1 é um agente patogênico do gado, cuja infecção resulta numa doença respiratória conhecida como IBR (rinotraqueite infecciosa bovina) (WEIBLEN et al., 1989). A forma reprodutiva, se manifesta com vulvovaginite em fêmeas ou balanopostite em machos (WEIBLEN et al., 1989; KAHRS, 2001; ZAPATA et al., 2002). Outros transtornos associados à infecção com o BoHV-1 incluem conjuntivite, queratoconjuntivite, enterite, morte embrionária, morte fetal e aborto (TAKIUCHI et al., 2005). O BoHV-1 também causa doença no sistema nervoso central (SILVA et al., 2007). O BoHV-5 encontra-se estreitamente relacionado com o BoHV-1, e são semelhantes em aspectos estruturais, biológicos, antigênicos e moleculares. Sua principal diferença está na capacidade de invadir e replicar no sistema nervoso central e causar doença neurológica no gado bovino (BELTRÃO et al., 2000; FREITAS et al., 2007). Os dois subtipos de herpesvírus possuem 85% de homologia de DNA, o que é traduzido numa alta porcentagem de reações cruzadas, em testes que usam anticorpos policlonais, inclusive, em alguns casos, com anticorpos monoclonais (ANDRADE & BARBOSA-STANCIOLI, 2006). Como consequência disso, é muito difícil a implantação de programas específicos de controle e erradicação para cada agente (PEDRAZA et al., 2010). A distribuição e apresentação da doença causada pelo BoHV-1 têm caráter mundial (KAHRS, 2001), já a causada pelo BoHV-5 é mais restrita. A baixa ocorrência da síndrome neurológica associada ao BoHV-5 em diferentes países é muito discutida, poderia dever-se ao desconhecimento do verdadeiro número de animais acometidos pela doença ou também pela proteção cruzada que poderia conferir a vacinação realizada em zonas endêmicas contra o BoHV-1 ou pela alta homologia antigênica existente entre ambos agentes virais (CASCIO et al., 1999; BELTRÃO et al., 2000).

18 2 A meningoencefalite herpética dos bovinos pode ser confundida clinicamente com doenças como a raiva, pseudo-raiva, polioencefalomalacia por deficiência de tiamina, intoxicação por chumbo e intoxicação por sal (LEMOS et al., 2002; SANCHES et al., 2000; SPILKI et al., 2003). Praticamente todas elas tem sido relatadas na America do Sul. Alguns casos de raiva por exemplo, têm sido diagnosticados claramente pelo uso de anticorpos monoclonais contra o vírus ou por testes biológicos. Entretanto, aqueles casos negativos, às vezes não são conclusivos de nenhuma entidade, permanecendo sem diagnóstico (LEMOS, 2005). A neuroinflamação está envolvida em múltiples mecanismos patológicos da encefalite herpética bovina. Alguns estudos em humanos sugerem que a inflamação e ativação das células gliais precedem o dano neuronal e que o estresse oxidativo acontece antes da citopatología característica da meningoencefalite causada por herpesvirus (CONTI et al., 2000). Algumas moléculas tipo radicais livres e proteínas antioxidantes estão elevadas na infecção com o BoHV-5 no encéfalo de bovinos naturalmente afetados por este vírus (CARDOSO et al., 2010). Evidencia experimental sugere que as condiciones pro-inflamatórias promovem o desenvolvimento de malacia (DEZENGRINI et al., 2009). Por outro lado, o BoHV-1 tem sido associado frequentemente a esse tipo de patogênese em bovinos. FLORES et al. (2009) a partir de múltiplos experimentos usando coelhos, concluíram que a inoculação do BoHV-1 para desenvolver doença neurológica nem sempre tem resultados bons que permitam descrever de maneira adequada o que acontece no encéfalo desses animais. Além disso, os estudos de reativação viral usando dexametasona como imunodepressor nos coelhos que sobrevivem à infecção, deve ser feita com animais diferentes em experimentos separados devido a que as doses infectantes devem ser menores, para evitar a morte por doença aguda, e os animais devem ser preferencialmente adultos, que são mais resistentes. Mesmo que existam pesquisas orientadas à procura de dados nesse sentido, ainda faltam muitas informações especificamente sobre a neuroinflamação causada pelo BoHV-5.

19 3 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Descrição do BoHV-5 O BoHV-5 é um alfa herpesvírus neurovirulento, que causa meningoencefalite fatal em bezerros e também é conhecido como herpesvírus da Encefalite Bovina (CHOWDHURY et al., 1997; CHOWDHURY et al., 2000; COLODEL et al., 2002; FIELDS et al., 1996). Inicialmente, o BoHV-5 foi classificado como um subtipo neurovirulento do BoHV-1 (BHV-1.3), no entanto, com base em suas características moleculares, finalmente foi descrito como um vírus distinto (CHOWDHURY et al., 1997; COLODEL et al., 2002; MEYER et al., 1996; MEYER et al., 1999). Os alfa herpesvírus têm um ciclo reprodutivo relativamente curto, em cultivo celular rapidamente destroem as células infectadas e tem capacidade para estabelecer de forma primária, infecções latentes, mais exclusivamente nos gânglios sensoriais Epidemiologia Para entender a epidemiologia do herpesvírus responsável pela meningoencefalite dos bovinos (BoHV-5) é preciso considerar que na maioria das vezes ele está acompanhado do herpesvírus que atinge o sistema respiratório desses animais (BoHV-1). Isto porque eles estão compartilhando aspectos estruturais, biológicos, antigênicos e moleculares de maneira muito estreita (BELTRÃO et al., 2000; FLORES et al., 2009). Desta forma, o estabelecimento das porcentagens de animais verdadeiramente infectados com o BoHV-5 é muito difícil, pelas reações cruzadas nos testes sorológicos (ROEHE et al., 1997). Num estudo feito na Colômbia, usando as cepas Cooper do BoHV-1 e SV507 do BoHV-5, foi possível separar sorologicamente animais positivos para cada um destes agentes etiológicos. Entretanto, os autores concluíram que o teste de soroneutralização para BoHV-1 (sempre que interpretado por profissionais habilitados) e muito útil e permite supor a infecção com o BoHV-5 devido à co-existência destes agentes nos rebanhos bovinos (PEDRAZA et al., 2011a).

20 4 O BoHV-5 é transmitido por contato direto com aerossóis contaminados ou com fômites e também pelo sêmen (GOMES et al., 2003). Pode infectar animais jovens e adultos, sendo os bezerros e animais até 24 meses os mais susceptíveis (COLODEL et al., 2002). RISSI et al. (2006) observaram que os surtos podem ocorrer em grupos de animais (com idades entre um e dez e oito meses), embora também existam casos esporádicos. Os dados sobre morbidade indicam que só um pequeno grupo de animais num rebanho pode ser atingido, no máximo 5% (SALVADOR et al., 1998; RISSI et al., 2006). No entanto, COLODEL et al. (2002) afirmam que a morbidade pode ser baixa, mas que a mortalidade pode atingir até 22%. Dados mais extremos indicam que os animais podem morrer em um percentual de quase 100% depois de adoecerem (SALVADOR et al., 1998). Em outros estudos, as observações clínicas indicaram que alguns animais podem se recuperar e dessa forma, a mortalidade pode diminuir de 100% até 75% aproximadamente (ELIAS et al., 2004). Aparentemente, a meningoencefalite pelo herpesvírus pode acontecer em qualquer época do ano, sem predileção pela raça ou sexo do animal afetado. Devido à sua capacidade para estabelecer latência, afeta com maior frequência os animais mantidos em pastagens pelas diferenças de manejo (com maior probabilidade de estresse pelo desmame, castração, vacinação, mudança de pastagens e transporte para comercialização, entre outros), quando comparado com os animais submetidos a confinamento (SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004; RISSI et al., 2006). Um aspecto importante na epidemiologia é a dificuldade de impedir a migração de animais doentes (provavelmente assintomáticos) que nas práticas comerciais são transladados e introduzidos em rebanhos aparentemente livres (COLODEL et al., 2002; SALVADOR et al., 1998) Patogenia Tanto o BoHV-1 como o BoHV-5, são vírus neurotrópicos e estabelecem latência no gânglio trigêmeo (TG), logo depois da inoculação intranasal e conjuntival.

21 5 Geneticamente tem 85% de homologia em seu DNA, mas diferem em sua capacidade de causar doença neurológica em bezerros. Após sua inoculação intranasal em coelhos, o BoHV-5 invade o encéfalo, via nervo olfativo, resultando em sinais neurológicos agudos comparáveis aos que se têm encontrado nos bezerros. As partículas virais e os danos neurais foram observados no encéfalo de coelhos afetados dentro das áreas ligadas através da via do nervo olfativo como são, bulbo olfativo, núcleo olfativo anterior, córtex piriforme/entorrinal, córtex frontal/cíngulado, giro hipocampo/dentado, amígdala, rafe dorsal (DR) e locus coeruleus (LC). Estes coelhos tiveram poucos neurônios afetados no TG e nenhuma invasão viral desde a ponte até o núcleo trigêmeo espinal que são os neurônios de segunda ordem na via do nervo trigêmeo (CHOWDHURY et al., 2000). No encéfalo de coelhos infectados experimentalmente com BoHV-5 (cepa TX-89) o vírus foi isolado do bulbo olfativo, córtex anterior (córtex frontal, trato olfativo e a porção anterior do córtex olfativo), córtex posterior (córtex temporal, parietal, piriforme, entorrinal e occipital), amígdala e hipocampo. Menos frequentemente o BoHV-5 foi isolado do mesencéfalo e diencéfalo, ponte e medula; e do cerebelo e gânglio trigêmeo. Nos coelhos experimentalmente inoculados com BoHV-1 (cepa cobre), o vírus não foi recuperado de nenhuma região do encéfalo (CHOWDHURY et al., 1997). De maneira similar, coelhos inoculados com BoHV-5 evidenciaram replicação extensiva do vírus no encéfalo, mas os inoculados com BoHV-1 não a apresentaram lesões e também não foi possível recuperar o vírus a partir dessas amostras (SILVA et al., 2007). Os sinais clínicos de bezerros que morreram de encefalite, logo após serem inoculados por via intranasal com cepa americana (TX-89) do BoHV-5, foram tremores musculares, marcha em círculos, bruxismo e ataxia, seguido de decúbito lateral, convulsões, movimentos de pedalagem e opistótono. As lesões no encéfalo destes animais consistiram em uma difusa meningoencefalite não supurativa, caracterizada por necrose neural, gliose e manguitos perivasculares linfocíticos (CHOWDHURY et al., 1997). As glicoproteínas que se localizam na superfície do envoltório do vírus, desempenham um papel importante na patogenia da doença, porque atuam na entrada

22 6 do vírus na célula hospedeira, na maturação do vírus, na dispersão do vírus célula a célula e na liberação do mesmo. Analisando-se as sequências dos genes que codificam as glicoproteínas entre BoHV-1 e o BoHV-5 foi demonstrado que estes têm 72% de identidade e 77% de similaridade (CHOWDHURY et al., 2000). Os resultados de um experimento com coelhos, deixaram antever que a glicoproteína C (gc) do BoHV-5 não é necessária para permitir a entrada do vírus, via nervo olfativo, mas é importante para a dispersão neural eficiente. A virulência dentro do SNC foi diferente (menor) quando usaram a gc do BoHV-1 ao invés da gc do BoHV-5 (CHOWDHURY et al., 2000). Vários trabalhos foram feitos na procura de dados importantes relacionados com a patogênese da meningoencefalite causada pelo BoHV-5 (CARDOSO et al., 2010), a grande maioria deles tem comparado o BoHV-5 com o BoHV-1 devido a sua estreita relação molecular mesmo que tenham diferenças importantes na hora de ingressar no sistema nervoso central (CHOWDHURY et al., 2002). Recentemente tem sido comprovado que sete genes (UL5, UL48, UL39, UL19, UL14, UL29 e UL15) são muito conservados (95 a 97%) entre o BoHV-5 e BoHV-1, no entanto que, quatorze (UL44, UL3, BICP4, UL24, US8, UL11, UL49, US4, BICP0, UL3.5, LR ORF2, US2, BICP22 e UL0.7) tem uma baixa conservação entre os dois vírus (entre 41 e 75%), destacando-se neste grupo os genes UL44, US8 e US4, que codificam respectivamente para as glicoproteínas gc, ge e gg, podendo explicar a diferença entre os mecanismos usados pelos dois vírus para ingressar no sistema nervoso central (DEL MEDICO ZAJAC et al., 2010) Achados clínicos e diagnóstico diferencial Os principais sinais clínicos nos bovinos incluem, depressão, anorexia, isolamento do rebanho, secreção serosa ocular e nasal, sialorréia, tremores musculares mais evidentes na cabeça e no pescoço, hiperestesia ao tato ou ao som, seguido por perda dos reflexos sensoriais, principalmente visual, descrevendo-se também a afecção dos reflexos auditivos e cutâneos (VASCONCELOS et al., 1993; SALVADOR et al., 1998; LEMOS et al., 2002). Observa-se também andar em círculo, ataxia, choque com

23 7 obstáculos, trismo, diminuição do tônus lingual, dificuldade para a apreensão do alimento e deglutição da água, nistagmo, bruxismo, catatonia, posição em decúbito prolongado, com dificuldade para voltar à normalidade e finalmente, prostração em decúbito ventral, decúbito lateral, movimentos de pedalagem e morte (BELTRÃO et al., 2000; COLODEL et al., 2002; PEREZ et al., 2002). A meningoencefalite causada pelo BoHV-5 deve ser diferenciada clinicamente de outras doenças que atingem o encéfalo dos bovinos, como a raiva, botulismo, polioencefalomalacia por deficiência de tiamina, listeriose, meningoencefalite bacteriana, intoxicação por chumbo e até a encefalopatia espongiforme bovina (EEB), que apresentam sintomatologia clínica que eventualmente pode gerar confusão (GOMES et al., 2003; LEMOS 2005; SANT ANA & BARROS, 2010) Alterações macroscópicas No sistema nervoso central muitas vezes não são encontradas lesões, mas pode-se observar achatamento das circunvoluções cerebrais e malacia cortical, caracterizada por áreas multifocais irregulares que podem medir entre 0,5 e 3 cm, geralmente de cor amarelo e superfície deprimida. Ao corte pode-se observar um aspecto finamente granular e algumas vezes associado com hemorragias, principalmente submeningeais (COLODEL et al., 2002; PEREZ et al., 2002). Outras alterações podem incluir protrusão do cerebelo através do forâmen magno, congestão dos vasos meningeanos, aumento do líquido cefalorraquidiano, ou ainda malacia, as quais são observadas principalmente em casos com evolução prolongada (LEMOS et al., 2002). Em bezerros acometidos pela forma sistêmica, além das lesões do sistema nervoso, observam-se ulcerações no sistema digestório, principalmente em abomaso e rúmen e ainda, hepatomegalia, pericardite e pneumonia (RIET-CORREA et al., 1989).

24 Alterações microscópicas As lesões histopatológicas correspondem a uma meningoencefalite necrosante aguda, não supurativa, amplamente distribuída, que pode variar entre os graus leve até acentuado. A lesão é caracterizada por necrose neuronal, gliose, ruptura do neurópilo e manguitos perivasculares mononucleares constituídos principalmente por linfócitos, na substância cinzenta do encéfalo (SALVADOR et al., 1998). Podem ser encontrados corpúsculos de inclusão eosinofílicos intranucleares, os quais estão presentes nos astrócitos e neurônios e podem se correlacionar com diferentes graus da infecção. Nas infecções leves pode-se observar um corpúsculo de inclusão por campo, nas infecções moderadas dois e nas severas três ou mais (COLODEL et al., 2002; LEMOS et al., 2002; SALVADOR et al., 1998) Diagnóstico Devido à semelhança clínica com outras doenças, o diagnóstico clínico da meningoencefalite herpética dos bovinos é muito subjetivo e pode dar lugar a procedimentos epidemiológicos equivocados (PEDRAZA & ALESSI, 2004). Embora possa haver suspeita com base na somatória de dados clínicos e epidemiológicos, a análise histopatológica é necessária para a determinação do diagnóstico (SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002). O achado dos corpúsculos de inclusão intranucleares em astrócitos e neurônios podem facilitar o diagnóstico (ELIAS et al., 2004), mas, nem sempre eles são observados (SANCHES et al., 2000). Dessa forma, são necessárias técnicas mais sofisticadas, como o isolamento viral a partir do encéfalo e das secreções nasais, para confirmar-se o envolvimento deste agente etiológico na meningoencefalite. Para isso precisa-se de material fresco, eficientemente coletado e que chegue rápido ao laboratório. Também são necessárias técnicas imunológicas, para a caracterização do agente, sendo muito usados os anticorpos monoclonais (ROEHE et al., 1997). Segundo HÜBNER et al. (2005), a imuno-histoquímica é uma boa técnica para a identificação do agente em amostras de tecido fixado em formalina e na

25 9 padronização utilizada pelos autores foi possível marcar o BoHV-5 em neurônios, células da glia e células mononucleares do infiltrado celular. O uso de testes moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) é apropriado para detectar o BoHV-5 e diferenciá-lo do BoHV-1, em amostras de campo ou procedentes de experimentos no laboratório (ALEGRE et al., 2001; GOMES et al., 2003) Características moleculares do BoHV-5 Devido às diferenças nos mecanismos patogênicos dos herpesvírus bovinos foi preciso focalizar as pesquisas nas características moleculares de cada um deles para encontrar detalhes que facilitem a compreensão do comportamento patogênico dos mesmos. Para o BoHV-5, foram descritas inicialmente, as características moleculares de glicoproteínas de membrana como a glicoproteína C (gc), associada ao ingresso do BoHV-5 no encéfalo (CHOWDHURY et al., 2000) e posteriormente foram procuradas moléculas associadas ao estabelecimento de latência, sempre tentando identificar a rota provável de ingresso e permanência do vírus no sistema nervoso central do hospedeiro (MEYER et al., 1999). As principais diferenças na estrutura molecular antigênica dos herpesvírus 1 e 5 encontram-se nas glicoproteínas da cápside. As glicoproteínas que se localizam no envoltório viral tem sido identificadas como: B, C, D, E, G, H e I (MEYER et al., 1996; MEYER et al., 1999) e as proteínas Us9 e -tif (CHOWDHURY et al., 2002; GILLETTE et al., 2002). Recentemente foi concluído o estudo do genoma do BoHV-5, encontrando 138,390 pb, contendo 75% de composição pelas bases Guanina e Citosina e as sequências longa UL104,054 pb e curta US 9,548 pb, sendo a curta rodeada pelos elementos IR e TR cada um com 12, 109 pb (DELHON et al., 2003). Sabe-se que a glicoproteína D (gd) é critica e essencial como receptor que propicia a união em muitos herpesvírus. Entre o BoHV-5 e BoHV-1 existe 82% de identidade de aminoácidos, sendo por isso, que a replicação deles é muito semelhante (GABEV et al., 2010). Pela divergência na identidade de aminoácidos relacionados com a latência entre BoHV-1 e BoHV-5 (menos do 75% nas moléculas BICP0, BICP4 e BICP22, e 74% entre ge1 e ge5) e sabendo-se que a ge junto com a proteína Us9 são

26 10 as responsáveis pela capacidade do BoHV-5 para invadir o encéfalo, a ge deste vírus constituí-se numa das principais diferenças entre eles, para invadir o sistema nervoso dos bovinos (GABEV et al., 2010; CHOWDHURY et. al., 2002). A proteína Us9 do BoHV-1 é crucial para a reativação do vírus no TG e a mesma proteína no BoHV-5 tem um papel importante no transporte viral desde os receptores de neurônios olfatórios até os neurônios de segunda ordem dentro do bulbo olfatório (SILVA et al., 2009). Em um experimento em que se utilizou um recombinante de BoHV-5 carente de Us9, foi demonstrada sua incapacidade para invadir o cérebro de coelhos (CHOWDHURY et al., 2002). Por outro lado, aparentemente a glicoproteína I (gi) forma um complexo com a ge (gi/ge) que potencializa o ingresso do vírus na célula. SILVA et al. (2009) usaram um recombinante de BoHV-5 sem ge/gi/us9 resultando em diminuição, mas não bloqueio total, do ingresso do vírus no SNC Patogenia da malacia ocasionada pelo BoHV-5 Inicialmente houve confusão pelo termo polioencefalomalacia (necrose cerebrocortical) que significa malacia da sustância cinzenta do cérebro, mas já foi estabelecido que o termo pode ser usado para definir a condição mórbida ocasionada pela deficiência de tiamina e também para descrever lesões características de várias doenças incluindo a meningoencefalite pelo BoHV-5 (LEMOS, 2005; SANT ANA & BARROS, 2010). Existem algumas proteases dependentes do zinco, denominadas metaloproteinases da matriz (MMPs) que têm um papel importante na resposta inflamatória, principalmente a MMP-9, que aparentemente participa na ruptura da barreira hematoencefálica atuando diretamente na membrana basal, depois do ingresso do vírus no hospedeiro (CARDOSO et al., 2010). Por outro lado, o radical oxido nítrico (ON) é muito importante na resposta imune contra o BoHV-5. Especificamente a enzima óxido nítrico sintetase é que converte a L-arginina em óxido nítrico e tem três isoformas, uma endotelial, outra neuronal e finalmente uma induzível. Esta última aparentemente é a responsável pelos efeitos tóxicos na célula, logo depois de ser ativada pela interleucina 1 (IL-1 ) e pelo interferon (DEZENGRINI et al., 2009). A proteína

27 11 antioxidante 1 (AOP-1) funciona como uma peroxidase que compacta e coleta radicais livres como o H 2 O 2. A participação desta molécula na patogenia das encefalites foi testada também para BoHV-5, mas a conclusão é que são precisos novos estudos para se ter certeza do envolvimento destas moléculas na geração do dano tissular na meningoencefalite herpética (CARDOSO et al., 2010).

28 12 3. JUSTIFICATIVA Atualmente não se conhece completamente os mecanismos da resposta inflamatória do sistema nervoso central em bovinos infectados naturalmente com o herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5). O conhecimento sobre a patogenia do BoHV-5 na doença neurológica dos bovinos é relativamente recente e, por conseguinte, ainda encontra-se em estudo uma grande parte dos eventos que ocorrem neste tipo de entidade. Outras doenças do sistema nervoso central, como a infecção pelo vírus da raiva em casos naturais e experimentais, têm sido mais estudadas pela sua condição de zoonose. Da mesma forma, têm sido realizados vários estudos experimentais com vírus que apresentam neurotropismo, como o Vírus da Estomatite Vesicular (VEV), procurando dados que permitam aprofundar o conhecimento da forma como o encéfalo responde à agressão. O desconhecimento dos eventos que ocorrem durante a inflamação do encéfalo, numa infecção viral, impede o avanço no conhecimento da doença, levando a um planejamento escasso das estratégias de controle e ou erradicação da mesma. A realização desta pesquisa, utilizando-se os coelhos como modelo experimental, permite aprofundar o conhecimento da patogenia da encefalite causada por BoHV-5, em primeira instância pela descrição dos eventos inflamatórios ocorridos pela infecção, mas no futuro, revelar-se-á como base para interpretar se a resposta inflamatória é benéfica para o hospedeiro ou se pelo contrário, é a responsável pelo grande transtorno necrótico que acompanha o quadro de meningoencefalite não supurativa característico deste tipo de doença. Existem vários animais que servem como modelo de infecção do BoHV-5, mas o coelho tem sido o melhor descrito.

29 13 4. OBJETIVOS 4.1. Geral Descrever a participação celular na resposta inflamatória e relacioná-la com a quantidade de vírus em diferentes regiões do encéfalo de coelhos experimentalmente infectados com herpesvírus bovino 5 (BoHV-5) Específicos Determinar a participação de linfócitos T, linfócitos B, astrócitos e macrófagos,, na encefalite induzida em coelhos infectados pelo BoHV-5. Quantificar, mediante a técnica de PCR em tempo real (qpcr), a carga viral em seis regiões diferentes do encéfalo de coelhos experimentalmente infectados com o BoHV-5. Detectar partículas virais do BoHV-5 no encéfalo de coelhos experimentalmente infectados com o vírus. Comparar a resposta inflamatória, a carga viral e a presença do BoHV-5 nas diferentes regiões do encéfalo de coelhos inoculados experimentalmente com o vírus.

30 14 5. MATERIAL E MÉTODOS 5.1. Amostras de encéfalo Neste trabalho foram usadas amostras de encéfalo de coelhos (n=5) com encefalite de origem viral, experimentalmente induzida por BoHV-5, no Laboratório de Virologia, do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, do Centro de Ciências Rurais da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). Os blocos fazem parte de um grupo de amostras usadas em outros experimentos 1. As amostras permaneceram por 12 horas em solução tamponada de formol e logo após foram incluídas em parafina para análise microscópica. A resposta inflamatória foi avaliada em seis regiões diferentes do encéfalo, de cinco coelhos inoculados com o BoHV-5. Um coelho foi usado como controle e não foi inoculado com o vírus. Os blocos de parafina contendo os encéfalos dos coelhos experimentalmente infectados foram identificados com a letra D para representar o grupo de animais doentes. Os blocos do coelho controle foram identificados com a letra C. Conforme mostrado na figura 1, o encéfalo de cada animal foi dividido em seis partes, bulbo olfatório (BO), córtex olfatório (CO), córtex anterior (CA), córtex ventro e dorso lateral (CVL/CDL), hipocampo e córtex posterior (HI/CP) e tálamo (TA), para fazer comparações na resposta inflamatória em cada um deles. Apenas dois coelhos D4 e D5 tinham as seis regiões do encéfalo disponíveis; o coelho D1 não tinha os blocos 1 No laboratório de Virologia da UFSM, coelhos Nova Zelândia desmamados (30-35 dias de idade) foram anestesiados com Zoletil (Tiletamina e Zolazepam, Virbac, SP, Brasil) e logo inoculados pela via intra-nasal com 1 ml de uma suspensão de vírus contendo doses infetantes (TCID 50 ) de dois estirpes virais de BoHV-5 (SV-507/99 e EVI-340/96). Todos os animais foram monitorados para sinais neurológicos diariamente, por 20 dias depois da inoculação. No dia 20 os coelhos D1, D2 e D5 convulsionaram e pelo estado de saúde, todos os coelhos foram eutanasiados nesse dia. Esfregaços nasais foram feitos a cada três dias até o dia 12 pós-inoculação para fazer isolamento viral em células MDBK, segundo o protocolo padronizado na UFSM. Os experimentos com os animais foram aprovados pelo Comitê de Ética e Bem Estar Animal, Universidade Federal de Santa Maria, UFSM, segundo os Princípios Éticos para experimentação Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e com a Lei Federal no de 8 de maio de 1979 (FLORES et al., 2009).

31 15 correspondentes ao córtex anterior e o córtex olfatório; o coelho D2 não tinha o hipocampo e o coelho D3 o córtex anterior, o hipocampo e o córtex ventro e dorsolateral. Em resumo, de 30 amostras possíveis, só foram testadas 24 devido à carência de amostras completas em três dos animais. Figura 1. Representação gráfica das regiões do encéfalo de coelho usadas na presente pesquisa. Na parte superior uma vista sagital do encéfalo mostrando as regiões do hipocampo (HI/CP), tálamo (TA), córtex anterior (CA), bulbo olfatório e córtex olfatório (BO/CO). Na parte inferior uma vista dorsal mostrando a região do córtex ventro lateral e dorso lateral (CVL/CDL). O critério para a análise microscópica incluiu a observação de mudanças morfológicas no encéfalo, tais como malacia, manguitos perivasculares, corpúsculos de inclusão intranucleares compatíveis com o herpes vírus 5 (BoHV-5) e a presença de células gitter. Igualmente, foram observadas as mudanças na morfologia dos astrócitos, determinando se teriam reatividade ou não, comparando-os com aqueles do grupo controle. Para interpretação da magnitude das lesões, as mesmas foram classificadas de forma qualitativa em quatro categorias representadas por cruzes, assim, quando aproximadamente menos do 20% do tecido foi afetado, a quantificação denominou-se discreta, representada por uma cruz (+); entre 21 e 60% foi moderada, representada por duas cruzes (++) e mais do que 60% considerou-se acentuada,

32 16 representada por três cruzes (+++). A ausência de lesões foi representada como o número zero ( 0 ) Análise imuno-histoquímica A técnica de imuno-histoquímica para a detecção de células inflamatórias no sistema nervoso central foi feita com o mesmo protocolo usado por PEDRAZA et al. (2008), no Laboratório de Neuropatologia da FCAV-UNESP. Para a detecção do herpesvirus bovino 5 foi seguido o protocolo proposto por HÜBNER et al. (2005). A detecção de cada antígeno conserva um protocolo básico que inclui vários passos como: desparafinização, hidratação, recuperação antigênica, bloqueio de peroxidase endógena, bloqueio de antígenos inespecíficos, adição de anticorpo primário, adição de anticorpo secundário, adição de um sistema amplificador da reação (Streptavidina HRP), adição de um cromógeno (Diaminobenzidina), contra-coloração (Hematoxilina de Harris) e montagem da lâmina. Os anticorpos utilizados estão descritos na Tabela 1. Houve uma variação sobre o protocolo usado por PEDRAZA, et al. (2008), sendo substituído o sistema de amplificação do complexo Avidina-Biotina pela Streptavidina-HRP. Para a detecção do BoHV-5 foi usada a diluição 1:100, a recuperação antigênica foi incubada em 10 minutos. De um coelho clinicamente sadio, submetido a eutanásia para fins de ensino, no Biotério da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, do campus de Botucatu foram usados fragmentos de seus linfonodos como controles positivos para marcação de linfócitos T, linfócitos B e macrófagos, e como controle positivo dos astrócitos, um fragmento do seu encéfalo. Para o BoHV-5 foram usados como controles positivos um bloco contendo encéfalo de coelho experimentalmente infectado com o BoHV-5 (mesmas estirpes virais usadas nos coelhos doentes), incluído nas amostras procedentes da UFSM. Além disso, foi utilizado também um bloco contendo córtex anterior do encéfalo de um bovino experimentalmente infectado com o BoHV-5, gentilmente cedido pelo Dr. Didier

33 17 Quevedo Cagnini da FMVZ-UNESP. Como controle negativo de todas as reações, foi omitida a adição do anticorpo primário e em seu lugar foi usado um tampão substrato TRIS ph 7,4. Além disso, os fragmentos do coelho C1 (grupo controle) foram usadas também para este fim. Tabela 1. Relação de anticorpos utilizados para detectar células inflamatórias e agente viral em cérebro de coelhos experimentalmente infectados pelo BoHV-5. Reativação / Recuperação Antigênica Anticorpos Primários Diluição / Tempo Marca Anticorpo secundário Banho Maria Anti-linfócito B 4 37 C 1 NCL-BLA 36 Clone A2742 1: horas Dako Universal DAKO Câmara Pascal de pressão 2 Câmara Pascal de pressão 2 Anti-linfócito T CD 5 3 Clone A Anti-GFAP 5 Clone Z :100 2 horas 1: horas Dako Dako Universal DAKO Universal DAKO Câmara Pascal de pressão 2 Anti-macrófago 4 MAC 387 Clone M : horas Novocastra Universal DAKO Proteinase K 3 Anti BoHV-5 1:100 Clone 2F horas SV-UFSM 6 Universal DAKO 1 Sistema de aquecimento (Water Bath LS Logen), 20 min. (solução citrato ph 6.0) 2 Microprocessador câmara controlada de pressão DAKO (Cytomation), por 20 min. 3 Recuperação enzimática 10 minutos 4 Anticorpo monoclonal 5 Anticorpo policlonal 6 Setor de Virologia, Universidade Federal de Santa Maria. Os diâmetros maior e menor de quarenta astrócitos (vinte em cada grupo) foram medidos usando o programa ImageJ (versão 1.44o, 2010) 2 a fim de estabelecer 2 ImageJ é programa de processamento de imagem baseado em Java, de domínio público, desenvolvido no instituto Nacional de Saúde nos Estados Unidos.

34 18 diferenças entre os grupos infectado e controle e determinar a presença de astrócitos reativos. Mediante a formula r 1 r 2 foram obtidos os valores da área dos astrócitos em ambos grupos Real time PCR (qpcr) Extração do DNA Para a extração do material genético total dos tecidos incluídos em parafina foi usado o illustra TM Tissue & Cells genomic Prep Mini Spin Kit (GE Health care biosciences, Pittsburg Pennsylvania, USA), segundo as instruções do fabricante; duas reações em branco (só reagentes sem as amostras) foram extraídos junto a cada grupo de 10 cortes de tecido parafinado, com o fim de avaliar uma possível reação cruzada. Finalmente, a concentração do DNA foi determinada pela leitura de densidade óptica a 260 nm Quantificação das amostras Para a reação de qpcr foi utilizado 4 μl do DNA extraído, 400 nm dos iniciadores (primers) senso: TACGGACTGCCGGATTAACA, anti-senso: GTCACCACTA CCACCGCCGCCA ACAT segundo GOMES et al. (2002), 10 μl de 2X Power Sybr Green PCR Master Mix (PROMEGA, USA) e água livre de nucleases até obter o volume final de 20 μl. As condições da reação foram as seguintes: 95 C/10 minutos para a desnaturação inicial, amplificação com 40 ciclos (95 C por 15s de desnaturação, 60 C por 1 minuto para o anelamento e extensão), e para a confirmação do produto foi realizado uma curva de dissociação (95 C for 15 s, 60 C for 30 s e 95 C for 15 s) para posterior análise. Os dados da fluorescência foram coletados durante o anelamento e extensão e o threshold cycle numbers (CT) foram determinados usando ABI PRISM

35 Sequence Detector (Applied Biosystems, USA) e software SDS versão1.2.3 ( Sequence Detection Systems Real Time PCR System Applied Biosystems,USA). Como controle negativo a amostra foi substituída por água livre de nucleases. Todas as amostras de qpcr foram realizadas em duplicatas. Figura 2. Curva de dissociação (95 C por 15 s, 60 C por 30 s e 95 C por 15 s), no eixo da X aparecem os valores relativos da quantidade de BoHV-5 achado, no eixo Y os valores de temperatura de fusão na qual foi possível a amplificação das amostras positivas (incluídos dois controles), iniciador utilizado sugerido por Gomes et al. (2002). A curva padrão foi realizada por meio de diluições decimais seriadas. A amostra mais positiva, ou seja, com maior quantidade de fitas de DNA foi utilizada para gerar uma curva padrão relativa, considerando um total de 5 pontos e sendo a maior diluição o valor de 100, e a menor diluição o valor de 0,01. Para avaliação de cada amostra considerou o valor de R2 com valores acima de 0,99 da curva padrão relativa e obtidas, deste modo, valores para a analise estatística (Figura 2). Um controle

36 20 endógeno, a expressão do gene Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) foi incluído para verificar a existência do DNA de coelho nas amostras Analise estatística A imunomarcação de células inflamatórias foi analisada mediante razões e proporções como tem sido usado para estudos descritivos. Para analisar a quantidade de vírus nas diferentes regiões do encéfalo foi usada em primeiro lugar uma ANOVA, teste de Fischer (Anexo A) estabelecendo de forma geral a diferença entre as medias obtidas e posteriormente o teste de Duncan para saber qual das regiões tinha sido mais atingida pelo BoHV-5. Para comparar as medias das mensurações dos astrócitos entre o grupo experimental e o grupo controle foi usado o teste T de student (Anexo B). Em todos os casos verificou-se a coincidência dos dados com uma curva normal.

37 21 6. RESULTADOS 6.1. Achados histopatológicos Na análise microscópica, nem todos os coelhos tiveram lesões compatíveis com a infecção pelo BoHV-5, apenas o animal D4 mostrou uma resposta típica da neuroinflamação herpética (meningite e encefalite não supurativa) caracterizada pela presença de manguitos perivasculares e infiltrado inflamatório meningeano, constituído principalmente por monócitos e macrófagos, mas não foram observados corpúsculos de inclusão. Os detalhes podem ser observados na Tabela 2 e na Figura 3. O coelho D3 nas regiões do BO e CO, o coelho D1 no HI/CP e o coelho D5 no CO também apresentaram discretas alterações inflamatórias. Tabela 2. Aspectos morfológicos pesquisados em diferentes regiões do encéfalo de um coelho experimentalmente infectado com o BoHV-5. Aspecto morfológico Regiões do encéfalo BO CA* CO* TA HICP* VLDL Malacia Manguitos perivasculares Corpos de inclusão viral Gliose difusa Satelitose Células gitter * Os achados foram referidos nas regiões do córtex anterior (CA), córtex olfatório (CO) e hipocampo (HICP) do animal D4. A quantificação foi estabelecida como uma cruz (+) para a intensidade discreta, duas cruzes (++) na moderada e três cruzes (+++) na acentuada. Para a ausência dos achados foi utilizado o numero zero (0).

38 22 Figura 3. Fotomicrografia do encéfalo de coelho experimentalmente infectado com o BoHV-5. Coloração de H&E, 40X. Notar a presença de neurônios necróticos (setas). A. Imagem histológica do hipocampo (HI/CP) do coelho controle. B. Discreto manguito perivascular no Tálamo (TA) do coelho D Achados imuno-histoquímicos A imunodetecção de células inflamatórias foi realizada em todos os cortes do encéfalo dos animais doentes e do controle. Só o animal identificado como D4 apresentou marcação positiva para as células inflamatórias e para o vírus. Para a análise, os fragmentos de tecido foram divididos em duas áreas, a primeira denominada área 1, correspondendo à periferia dos vasos sanguíneos (constituída pelos manguitos perivasculares) e outra denominada área 2, constituída pelos neurônios, o neurópilo e a porção restante do tecido.

39 23 Pelo fato de nem todos os animais apresentarem alterações inflamatórias, a limitada quantidade de tecido em cada lâmina e, o pequeno número de células marcadas, a comparação da neuroinflamação com base na presença de linhagens celulares diferentes foi limitado à análise do hipocampo do animal D4, seguindo um sistema semelhante ao descrito para a interpretação dos achados histopatológicos por H&E Imunodetecção de Linfócitos T. Figura 4. Fotomicrografia do encéfalo do coelho experimentalmente infectado com o BoHV-5 mostrando um manguito perivascular com imunomarcação para Linfócitos T (anti-cd 3 policlonal). Note a participação dos linfócitos T na resposta inflamatória nas áreas 1 (manguito perivascular) e 2 do fragmento tecidual (Barra = 50 μm, streptavidina HRP, objetiva 40X). A. Controle negativo, linfonodo de coelho, 40 X. B. Controle positivo, linfonodo de coelho.

40 24 Após analisar a presença de Linfócitos T no encéfalo do coelho mediante a detecção do antígeno CD 3 na superfície celular, observou-se que nas áreas 1 e 2 dentro do fragmento do encéfalo, este tipo de célula sempre esteve presente em relativo alto grau de infiltração quando comparado com as outras linhagens celulares (Figura 4) Imunodetecção de Linfócitos B. Os Linfócitos B evidenciados pela detecção do antígeno BLA na superfície celular apresentaram-se em menor proporção quando comparados com os Linfócitos T, tanto na área 1 como na 2, no fragmento de tecido (Figura 5). Figura 5. Fotomicrografia do encéfalo de coelho experimentalmente infectado com o BoHV-5, mostrando um manguito perivascular com imunomarcação para Linfócitos B (anti-bla monoclonal). Pode-se notar algumas células que fazem parte da reação ao redor do vaso sanguíneo (Barra = 50 μm, streptavidina HRP, objetiva 40X). A. Controle negativo, linfonodo de coelho. B. Controle positivo, linfonodo de coelho.

41 Imunodetecção de macrófagos Os macrófagos integraram o infiltrado inflamatório geralmente acompanhando as áreas de malacia, embora não exclusivamente nesta localização. Nenhum dos outros coelhos mostrou infiltrado severo destas células no encéfalo, exceto no coelho D4 no qual foi evidente em semelhante proporção quando comparado com os linfócitos T (Figura 6). Figura 6. Fotomicrografia do hipocampo de coelho experimentalmente infetado com o BoHV-5 mostrando imunomarcação para macrófagos nas setas pretas e fragmentos do núcleo dos neurônios necróticos na seta branca (anti-mac, monoclonal. Barra = 50 μm, streptavidina HRP, objetiva 20X). A. Controle negativo, linfonodo de coelho (40X). B. Controle positivo, linfonodo de coelho (40X).

42 Imunodetecção de astrócitos A análise do grau de participação dos astrócitos na inflamação dos encéfalos de coelho esteve limitada a sítios diferentes onde havia manguitos perivasculares (área 2). As diferentes partes do encéfalo do coelho do grupo controle (BO, CA, TA, HI/CP, VL/DL) também mostraram marcação positiva para este tipo de células, mas na região do hipocampo uma quantidade maior de astrócitos foram vistos. Além disso, a analise foi restrita a esta área devido à necessidade na comparação com a região afetada pelo BoHV-5 a qual foi o HI/CP do coelho D4 (Figura 7). Figura 7. Fotomicrografia do hipocampo de coelho mostrando imunomarcação para astrócitos, (Barra = 50 μm, streptavidina HRP, objetiva 40X). A. As setas mostram alguns astrócitos imunomarcados no hipocampo do coelho D4. B. Hipocampo do coelho D4 mostrando um padrão de marcação similar quando comparado com o hipocampo do coelho controle. C. Hipocampo do coelho controle (40X).

43 27 Os astrócitos estiveram similares nos coelhos do grupo experimental e no grupo controle, em ambos casos, esses astrócitos mostravam-se moderadamente corados em marrom (imunorreatividade moderada), o núcleo tendia a se apresentar aparentemente maior no hipocampo do coelho D4, acompanhando o que poderia se considerar um aumento de volume celular e o nucléolo tornava-se ligeiramente mais visível. Quando comparados os astrócitos no hipocampo dos coelhos D4 e C1, não houve diferença significativa (p > 0,05) nas medias dos diâmetros maior (respectivamente 7,5 vs 6,8) e menor (5,2 vs 4,8), também não na media da área do corpo celular (30,4 vs 25,7) como observado na Figura 8. As mensurações individuais podem ser observadas no Anexo C. Os processos astrocíticos apresentavam-se aparentemente mais espessos no hipocampo do coelho D4, no entanto, as suas ramificações não eram nítidas, principalmente nas regiões onde ocorria necrose, por isso, o comprimento desses prolongamentos não foi medido Infectado Controle 00 Diâmetro maior Diâmetro menor Área Figura 8. Mensurações dos astrócitos no HI/CP do encéfalo de coelho. As barras representam a media do valor das mensurações dos diâmetros maior e menor dos astrócitos, assim como da área obtida a partir desses dados.

44 Imunodetecção do BoHV-5 O BoHV-5 foi detectado somente no encéfalo do coelho D4. A imunodetecção das partículas virais foi observada como agregados pequenos no citoplasma dos neurônios e alguns astrócitos, mostrando um padrão de forma arredondada ou ovóide e um número variável de corpúsculos de inclusão. Não foram observadas as mesmas características no interior dos núcleos neuronais, exceto em alguns neurônios como é mostrado na figura 9. Figura 9. Fotomicrografia do hipocampo de coelho experimentalmente infetado com o BoHV-5 mostrando imunomarcação para o vírus usando o anticorpo monoclonal 2F9 (Barra = 50 μm streptavidina HRP, objetiva 40X). A. Controle positivo córtex cerebral de coelho, as setas indicam a imunomarcação positiva. B. Controle positivo, córtex cerebral de bovino experimentalmente infectado com o BoHV-5. Note os corpos de inclusão, setas brancas. C. Hipocampo do Coelho D4, a imunomarcação aconteceu no núcleo e no citoplasma dos neurônios.