UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DETECÇÃO MOLECULAR DE HERPESVÍRUS BOVINO (BOHV) EM BOVINOS COM DOENÇAS NEUROLÓGICAS NO ESTADO DE MATO GROSSO LAURA PEIXOTO DE ARRUDA C u i a b á - MT 2009

2 Livros Grátis Milhares de livros grátis para download.

3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DETECÇÃO MOLECULAR DE HERPESVÍRUS BOVINO (BOHV) EM BOVINOS COM DOENÇAS NEUROLÓGICAS NO ESTADO DE MATO GROSSO Autor: Laura Peixoto de Arruda Orientador: Prof. Dr. Edson Moleta Colodel Co-Orientador: Prof. Dr. Luciano Nakazato Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Sanidade Animal. Orientador: Prof. Dr. Edson Moleta Colodel. Co-Orientador: Prof. Luciano Nakazato C u i a b á - MT 2009

4 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. FICHA CATALOGRÁFICA O p Arruda, Laura Peixoto. Detecção molecular de Herpesvírus Bovino tipo 1 e 5 (BoHV 1 e BoHV5) em amostras de encéfalo de bovinos com doenças neurológicas no Estado de Mato Grosso conservadas em formol e infiltradas em parafina. Laura Peixoto de Arruda - Cuiabá, f. Dissertação (Mestre em Ciência Veterinária) Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso. Orientador(a): Prof Dr. Edson Moleta Colodel Co-orientador: Prof. Dr. Luciano Nakazato 1. Medicina Veterinária. 2. Patologia Veterinária. 3. Herpesvírus Bovino (BoHV-1 e BoHV-5) 4. Reação em cadeia pela Polimerase 5. Doenças neurológicas 6. Mato Grosso I. Universidade Federal de Mato Grosso CDU

5 CERTIFICADO DE APROVAÇÃO Aluna: LAURA PEIXOTO DE ARRUDA Título: Detecção molecular de Herpesvírus Bovino (BoHV) em bovinos com doenças neurológicas no Estado de Mato Grosso. Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias Aprovado em: Banca Examinadora: Prof. Dr.: Edson Moleta Colodel (Orientador) Instituição: CLIMEV/FAMEV/UFMT Assinatura: Prof. Dr.: Ricardo Antônio Amaral de Lemos (Membro) Instituição: FMVZ/UFMS Assinatura: Profª. Dra.: Caroline Argenta Pescador (Membro) Instituição: CLIMEV/FAMEV/UFMT Assinatura: Profº. Dr.: Luciano Nakazato (Suplente) Instituição:CLIMEV/FAMEV/UFMT Assinatura:

6 Dedicatória Dedico este trabalho à Laurita e Anacleto, meus queridos pais, os maiores dharmas que ganhei na minha existência; aos meus irmãos Felipe e Thales, que também sempre foram dharmas na minha vida. Juntos, formamos o quinteto fantástico.

7 Agradecimentos A Deus, à minha Mãe e meu Pai, por me impulsionarem a cada dia nesta existência difícil. Aos meus pais Anacleto e Laurita, os quais sempre estiveram ao meu lado, fonte eterna de carinho, compreensão, amor, exemplo, dedicação, apoio, e que tornaram possível a realização deste mestrado. Aos meus irmãos Felipe, Thales e também Larissa, por toda a companhia, amor e carinho, principalmente todos os dias quando eu chegava à noite em casa e cansada. Obrigada pelas brincadeiras, piadas, abraços, sustos, puxões de orelha, ombro para desabafar e por todos os momentos de alegria, estresse, ansiedade ou tristeza vividos. Ao meu orientador Edson Moleta Colodel, por todo aprendizado que tive, pela paciência em todas as situações difíceis ou estressantes, pelo companheirismo em todos os momentos compartilhados no laboratório ou fora dele, por toda ajuda, por toda compreensão, por ser um exemplo de sabedoria, e sabe, sempre me entusiasmei e fiquei feliz ao ser chamada de uma das crias do Moleta. À equipe do laboratório de Patologia Veterinária da UFMT (LPV-UFMT), cuja convivência diária chegou a ser quase maior do que com minha própria família, sendo, portanto, minha segunda família por todo este período. Primeiramente à Raquel e Naiani, que me proporcionaram infinitos motivos para sorrir, tornaram mais fáceis e divertidas as diversas situações estressantes ou trabalhosas vividas no lab e fora dele. Amigas eternas. Agradeço também à Fabiana Boabaid, Zebu (Eduardo), Nádia, Patrícia, Danúbia, Paulo Ricardo, Frodo e Sam (Gustavo e Flávio), Mayara, Natália, Pâmela, Daniel, Salsicha, também ao técnico e amigo Manoel, por todos os momentos inesquecíveis vividos. Ao professores amigos queridos Marcos Souza e Caroline Pescador, por todo aprendizado, ajuda e companheirismo que me proporcionaram no LPV. À minha querida amiga e psicóloga Evelyn Arruda, pelos ótimos momentos de alegrias e risadas, pelo apoio, paciência, pela parceria ímpar e por todos os passeios de moto quando eu sempre cantarolava na garupa.

8 Aos meus queridos companheiros de Orquestra Sinfônica da UFMT, em especial meu professor de trompa e amigo Edson Lopes, Odenil, Patrícia Andrade, Cecília, maestro Fabrício e demais músicos. Confesso que esta terceira família me proporcionou sempre um maravilhoso bem estar quando as diversas músicas e sinfonias faziam parte das nossas vidas. Aos amigos distantes Luciana Dalcin, Eduardo Guaraná, Rodrigo Prado, aos parentes distantes Romeuzinho e Raquel Peixoto, Lídia, Nanci, Reginalda, Aridelço, que mesmo não estando sempre presentes, me acompanharam nesta jornada. Também aos amigos Baby (Bárbara Provenzano), Lucas Andreatta, Fernando e Ricardo Moraes, Marcos Zarzenon, Rafael Paes, Simone e Tatiane Hirata, Hilvanete, Juliana Normando e Ana Paula Nicolini, pela amizade e convivência nos mais diversos momentos. Ao Lê, huumm, Shrimp, meu anjo, meu lindo Leandro Lima Uliano, que me faz até faltar as palavras. Conseguiu me fazer companhia e ser tão presente em minha vida mesmo estando distante. Aos avós Avany, Anacleto e também vovó Laura, embora eu não faça mais parte da sua memória em função do Alzheimer. Ao laboratório de Microbiologia Veterinária e Biologia Molecular Veterinária, em especial ao professor e co-orientador Luciano Nakazato, Professora Valéria Dutra, por todo auxílio e acompanhamento; à Daphine e Juçara, pelo aprendizado, paciência e por serem meu primeiro socorro quando as dúvidas apareciam. Aos mestrandos Ana Carolina e João, por todo companheirismo e compartilhar os diversos momentos noturnos, finais de semana e até a incrível situação de falta de luz; a amizade e todas as situações vividas são inesquecíveis. Aos meus novos amigos da Unic, em especial ao querido amigo e companheiro de trabalho Dulcindo, à Glenda Teles e demais estagiários do Laboratório de Patologia do Hovet-Unic e ao Lázaro Camargo, chefe e amigo ao qual eu admiro intensamente por ser um exemplo de pessoa e profissional. Aos animais, em especial July, Cléo e Figura. Ao Tufo e Flecha, que deixaram saudades, e a todos os animais que contribuíram para o conhecimento e aprendizado.

9 RESUMO Infecção por Herpesvirus é uma das principais causas de doença do sistema nervoso em bovinos na região Centro-Oeste do Brasil. O uso de técnicas moleculares para caracterização diagnóstica representa uma contribuição importante para o estudo dessa doença. Relatamos o uso de técnica específica de PCR multiplex para identificar o herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) e tipo 1 (BoHV-1) em 76 amostras de encéfalo de bovinos fixados em formol e incluídos em parafina, com 9 destas em duplicidade para tecidos congelados. Com base nas alterações histológicas as amostras foram separadas em 2 grupos. Dentre 40 amostras de meningoencefalite necrosante com características histológicas de infecção por BoHV houve amplificação de DNA de BoHV-5 em 16 amostras e em 36 amostras com lesões histológicas classificadas como encefalite não purulenta inespecífica ocorreu amplificação do DNA de BoHV-5 em 12 amostras. Não houve amplificação de BoHV-1 nos encéfalo estudadas. Termos de indexação: Herpesvírus bovino, PCR, BoHV-1, BoHV-5, Mato Grosso.

10 ABSTRACT Herpesvirus is one of the main causes of neurological diseases of cattle in the Midwest Region of Brazil. The application of molecular diagnostic techniques represents an important contribution for herpesvirus study. This report describes the detection of BoHV-5 and BoHV-1 by a specific multiplex PCR assay in seventy-six central nervous system (CNS) samples including paraffin-embedded, and in nine samples those both in fresh frozen and paraffin-embedded. The samples were divided in 2 groups according to histological features: Group 1-necrotizing meningoencephalitis characteristic of BoHV infecction (40 samples), Group 2- mononuclear encephalitis nonspecific (36 samples). The positive case for BoHV-5 in paraffin-embebbed tissues in each group was 40% and 33,3%, respectively. BoHV-1 was negative in all samples tested. Index terms: Bovine herpesvirus, PCR, BoHV-1, BoHV-5, Mato Grosso.

11 LISTA DE FIGURAS Páginas Figura 1: Meningoencefalite por Herpesvírus bovino. A- Infiltrado inflamatório mononuclear perivascular moderado (manguito perivascular). HE. Obj. 40X. B- Corpúsculo de inclusão intranuclear eosinofílico em astrócito (seta). HE. Obj. 100X. Figura 2: Meningoencefalite necrosante. A- Desaparecimento do córtex encefálico e infiltrado inflamatório predominando macrófagos (células guitter). HE. Obj 10X. B- Células guitter em fagocitose (detalhe da Fig. 2.A ). HE. Obj 40X Figura 3: PCR multiplex para detecção BoHV-1 e BoHV-5. Eletroforese em gel de agarose a 2%. Amostras em parafina. Figura 4: PCR multiplex para detecção BoHV-1 e BoHV-5. Eletroforese em gel de agarose a 2%. Amostra congelada

12 LISTA DE TABELAS Página Tabela 1: Municípios de procedência das amostras 59

13 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ATP: adenosina trifosfato BoHV-1.3: Herpesvírus Bovino tipo 1.3 BoHV-1: Herpesvírus Bovino tipo 1 BoHV-5: Herpesvírus Bovino tipo 5 BSE: Encefalopatia Espongiforme Transmissível BT: células turbinadas de bovino para cultivo celular DNA: ácido desoxirribonucléico ELISA: enzime-linked immunosorbent assay gb: glicoproteína B HS1 e HS2: Herpes Simples Humano 1 e 2 IBR: Rinotraqueíte Infecciosa Bovina IFD: Imunofluorescência direta IHQ: imuno-histoquímica IIC: Inoculação intracerebral em camundongo IPV: Vulvovaginite Pustular Infecciosa IPX: imunoperoxidase Kb: kilobase mg/kg: miligrama por kilo de peso vivo Nested-PCR: NO: óxido nítrico pb: pares de base PCR: Reação em cadeia pela polimerase PEM: polioencefalomalacia PI: pós-infecção SNC: Sistema Nervoso Central UC: região ultra curta do DNA UL: região ultra longa do DNA

14 ANEXOS Páginas 1. Protocolo de Extração de DNA Material Congelado 2. Protocolo de Extração de DNA Material em parafina 61 62

15 SUMÁRIO Páginas 1. Introdução Revisão Bibliográfica Meningoencefalite por Herpesvírus tipo Etiologia Epidemiologia Patogenia e sinais clínicos Achados de necropsia e histopatológico Diagnóstico Diagnóstico Diferencial Polioencefalomalacia Meningoencefalites Tratamento e profilaxia Material e Métodos Resultados Discussão Conclusão 35 Referências Bibliográficas 35

16 15 Considerações Iniciais 1. INTRODUÇÃO Os distúrbios do sistema nervoso central (SNC) em bovinos abrangem um grupo de enfermidades importantes que incluem principalmente as doenças infecciosas e degenerativas (RIET-CORREA et al., 2002). A identificação, em meados da década de 1980, da encefalopatia espongiforme bovina (BSE) e o surgimento da variante da doença humana Creutzfeldt-Jakob (vcjd) realçou a importância socio-econômica e de saúde pública das doenças que acometem o SNC (BARROS et al., 2006). Na região Centro-Oeste, assim como em várias regiões do país as principais enfermidades que afetam o SNC de bovinos são causadas por vírus, destacando-se entre elas a raiva, meningoencefalite por BoHV-5 e febre catarral maligna (BARROS et al., 2006; SANCHES et al., 2000; MENDONÇA et al., 2008). A polioencefalomalacia é uma doença degenerativa importante nesta região, que pode estar associada com intoxicação por enxofre (GOULD, 1998), sal (NAKAZATO et al., 2000), chumbo (DRIEMEIER & BARROS, 2007), distúrbios no metabolismo da tiamina (LEMOS & RIET-CORREA, 2007), mas que permanece com a patogenia ainda não completamente elucidada. A ocorrência de meningoencefalite por herpesvirus em bovino foi relatada no Estado de Mato Grosso (COLODEL et al., 2002) sendo a doença neurológica inflamatória mais importante para bovinos no Estado, depois da raiva bovina (UBIALI et al., 2008). O BoHV-5 é um vírus pertencente à família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus (ROIZMAN, 1992). Devido às semelhanças com estirpes virais respiratórias e genitais, o BoHV-5 foi inicialmente classificado como BoHV-1.3. Posteriormente, com base em diferenças epidemiológicas, antigênicas e moleculares, houve a proposta de reclassificação, na qual o BoHV-5 passou a compor uma nova espécie da família Herpesviridae. Com relação à composição genômica, o DNA do BoHV-5 apresenta similaridade de 85% com o BoHV-1 (DELHON et al., 2003). Embora

17 16 surtos de meningoencefalite por herpesvírus sejam previamente atribuídos a BoHV-1 em países, como Austrália, Estados Unidos, Canadá e Uruguai, a maior freqüência desta enfermidade tem sido observada principalmente no hemisfério sul, em países como Argentina e Brasil (BARROS et al., 2006). Neste último, a doença foi relatada no Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro, São Paulo, Mato Grosso do Sul (SILVA et al., 2007a), Goiás (PAULA et al., 2005), Pará (RIET-CORREA et al., 2006), Minas Gerais (GOMES et al., 2002) e Mato Grosso (COLODEL et al., 2002). A infecção pelo BoHV-5 em bovinos determina um quadro neurológico que inclui diversos sinais clínicos. Entretanto, estudos demonstram que tanto o BoHV-1 como o BoHV-5 podem não estar estritamente associados às suas respectivas síndromes clínicas e estarem envolvidos em casos clínicos classicamente atribuídos ao outro vírus (SILVA et al., 2007a; GOMES et al., 2003). Diversos estudos têm proposto a utilização de técnicas moleculares na rotina de diagnóstico do BoHV-5 e diferenciação do BoHV-1, como a PCR e nested-pcr (SILVA et al. 2007, CLAUS et al. 2005, ASHBAUGH et al. 1997, ELY et al. 1996) sendo estas específicas e práticas, além de outras técnicas existentes, a imuno-histoquímica (HÜBNER et al. 2005, VOGUEL et al. 2003, MEYER et al. 2001), cultivo celular (SOUZA et al. 2002) e análise de restrição enzimática (D ARCE et al. 2002). Métodos que permitam detecção viral em materiais inclusos em parafina auxiliam a expansão do conhecimento sobre a importância dos herpevírus bovinos permitindo estudos retrospectivos de prevalência de BoHV-5 e BoHV- 1, já que a similaridade entre os dois vírus e a dificuldade em diferenciação sorológica não permitiam levantamento adequado da prevalência de infecção por esses vírus (ROEHE et al. 1998). Neste trabalho, demonstramos uma técnica para detecção molecular, de Herpesvírus Bovino 5 (BoHV-5) e o Herpesvírus Bovino 1 (BoHV-1), em amostras, infiltradas em parafina, de encéfalo de bovinos com doença neurológica. Selecionamos amostras do arquivo do Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT) entre os anos 1999 a 2008 que foram testadas negativas para Raiva e que tinham como

18 17 principais alterações meningoencefalite necrótica e meningoencefalite não purulenta inespecífica. 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Meningoencefalite por Herpesvirus tipo ETIOLOGIA O Herpesvirus Bovino tipo 5 (BoHV-5) é um vírus pertencente à família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus (ROIZMAN et al., 1992). Nesta família estão incluídos importantes vírus como o Herpes Simples Humano (HS1 e 2), vírus da doença de Aujeszky e da rinopneumonite eqüina, entre outros (HALFEN & RIET-CORREA, 2007). Os vírus da subfamília Alphaherpervirinae apresentam como características gerais o diâmetro de aproximadamente 70 a 110 nm, genoma DNA linear de fita dupla com aproximadamente 137 kilobases (Kb) constituído por uma região única longa (UL) e outra única curta (US); nucleocapsídeo icosaédrico com 162 capsômeros e envelope glicoprotéico (FENNER et al., 1993). Os herpesvírus codificam várias enzimas envolvidas no metabolismo do ácido nucléico como a timidina kinase (TK), timidina sintetase, dutpase e ribonucleotídeo redutase, além daquelas que participam da síntese do DNA como a DNA polimerase, a helicase e a primase (ROIZMAN et al., 1992). Atualmente são descritas 10 glicoproteínas do envelope viral, denominadas gb, gc, gd, ge, gg, gh, gi, gk, gl, e gm. Estas glicoproteínas possuem diferentes propriedades antigênicas, funções na replicação viral e interações com a célula infectada (ACKERMANN et al., 1982). As glicoproteínas gb, gc e gd são importantes componentes imunogênicos e estão envolvidas nas interações iniciais com a célula hospedeira. A gc é considerada a mais imunogênica e está relacionada à adsorção, enquanto a gb e a gd estão envolvidas na penetração e fusão da

19 18 partícula viral às células alvo (BABIUK et al., 1996). Uma das propriedades biológicas mais importantes da família Herpesviridae é a habilidade de estabelecer latência em neurônios dos gânglios sensoriais após a infecção aguda (STEVENS, 1994). A capacidade de estabelecer e posteriormente reativar da infecção latente desempenha um papel fundamental na perpetuação desse vírus na natureza (ROCK, 1994). Os primeiros isolamentos de herpesvírus a partir de animais com sinais clínicos neurológicos foram atribuídos ao BoHV-1, vírus associado a várias síndromes, tais como a rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), vulvovaginite pustular infecciosa (IPV), balanopostite, conjuntivite e abortos. Porém, estudos preliminares já apontavam diferenças entre os herpesvírus isolados de focos de encefalite, daqueles isolados de focos de problemas respiratórios e/ou genitais (METZLER et al., 1986; RIET-CORRÊA et al., 1989; COLLINS et al., 1993; D OFFAY et al., 1993). Devido às semelhanças com estirpes virais respiratórias e genitais, inicialmente o BoHV-5 foi classificado como BoHV-1.3. Posteriormente, com base em diferenças epidemiológicas, antigênicas e moleculares, houve a proposta de reclassificação, na qual o BoHV-5 passou a compor uma nova espécie da família Herpesviridae. Entretanto, a maior diferença entre o BoHV-1 e o BoHV-5 está na capacidade do BoHV-5 invadir e replicar-se no SNC, determinando enfermidade neurológica (ROIZMAN et al., 1992; BELKNAP et al., 1994). Com relação à composição genômica, o DNA do BoHV-5 apresenta similaridade de 85% com o BoHV-1. Sugere-se que as diferenças na seqüência de nucleotídeos entre esses dois vírus estejam distribuídas por todo o genoma (CHOWDHURY, 1995) EPIDEMIOLOGIA A diferenciação sorológica entre o BoHV-1 e o BoHV-5 é de difícil realização devido à ocorrência de reações cruzadas que não permitem o estabelecimento da proporção de animais supostamente infectados com o BoHV-1, que na verdade foram infectados com o BoHV-5. Dessa forma é desconhecida a prevalência do BoHV-5 no mundo (ROEHE et al., 1997).

20 19 Porém, surtos de meningoencefalite necrosante herpética têm sido relatados em vários países como Austrália (JOHNSTON et al., 1962), Estados Unidos (BARENFUS et al., 1963), Hungria (BARTHA et al., 1969), Canadá (BECK, 1975), Argentina (CARRILLO et al., 1983) e Uruguai (DIAS et al., 1982). No Brasil já foram descritos casos clínicos ocorridos nos Estados do Rio Grande do Sul (RIET-CORRÊA et al., 1989; WEIBLEN et al., 1989; SCHILD et al., 1994; ELIAS et al., 2004), Mato Grosso (COLODEL et al., 2002), Mato Grosso do Sul (SALVADOR et al., 1998), Goiás (PAULA et al., 2005), São Paulo (SALVADOR et al., 1998), Paraná (HALFEN & RIET-CORREA, 2007), Rio de Janeiro, Minas Gerais (SILVA et al., 2007a; GOMES et al., 2002) e Pará (RIET- CORRÊA et al., 2006). Embora não existam relatos da infecção em outros Estados, sugere-se que o BoHV- 5 seja enzoótico em todo o país (SOUZA et al., 2002). A faixa etária acometida é ampla e a doença ocorre na forma de surtos ou casos esporádicos. Em Mato Grosso, surtos de meningoencefalite por herpes afetaram animais de 2 a 72 meses, embora o maior número de casos ocorreu em bovinos com idade próxima a 24 meses (COLODEL et al., 2002). No Rio Grande do Sul, surtos ocorrem em animais jovens, entre 1 e 18 meses de idade (RISSI et al., 2006) embora em alguns casos sejam descritas ocorrências até 2 anos e meio de idade (RIET-CORREA et al., 1996). No Brasil, a maioria dos casos ocorre em animais jovens de meses (BARROS et al., 2006). A morbidade e mortalidade geralmente são baixas, variando de 0,05 a 5% (SALVADOR et al., 1998; RISSI et al., 2006). Considerando a morbidade e mortalidade estipulada dentro de um lote afetado, os índices de morbidade e mortalidade variam entre 0,8 e 22% (COLODEL et al., 2002). A letalidade geralmente é próxima a 100% (SALVADOR et al., 1998; RISSI et al., 2006) embora em alguns surtos sejam encontrados índices de letalidade em torno de 75% ou menos (ELIAS et al., 2004). A meningoencefalite por herpes não possui caráter sazonal e afeta bovinos de ambos os sexos e diferentes raças. Atinge principalmente animais criados extensivamente em pastagens e raramente ocorre em animais confinados (SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al. 2002;ELIAS et al., 2004). Os surtos da doença geralmente estão associados a condições de estresse

21 20 relacionadas a diversas práticas de manejo, como desmame, castração, vacinação, transporte, troca de pastos, modificações na alimentação ou intempéries (ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006; RISSI et al. 2006). A enfermidade também pode estar associada a introdução de bovinos de outros locais, favorecendo a disseminação viral em novos rebanhos (COLODEL et al. 2002; SALVADOR et al., 1998) PATOGENIA E SINAIS CLÍNICOS O Herpesvírus Bovino tipo 5 é transmitido principalmente por contato direto, embora também possa ocorrer por contato indireto. A mucosa nasal, orofaríngea e ocular são sítios de replicação primária. O vírus invade terminações nervosas e é transportado ao encéfalo, onde o BoHV-5 pode se replicar ativamente ou estabelecer latência (ENGELS & ACKERMANN, 1996; VOGUEL et al., 2003). A principal via de acesso do vírus ao encéfalo, segundo estudos experimentais em coelhos e bovinos, é através da mucosa nasal e trato olfatório (VOGUEL et al. 2003; BELTRÃO et al., 2000) embora o vírus possa utilizar outras rotas de acesso, como as fibras sensoriais e autonômicas que compõem o nervo trigêmeo, sendo este um acesso mais lento e menos eficiente (BELTRÃO et al., 2000; DIEL et al., 2005). O período de incubação é em geral de dias, mas o vírus pode ficar latente, e a doença pode ocorrer vários meses após a infecção (PEREZ et al., 2002). O gânglio de Gasser constitui o principal local de latência, embora o DNA viral também seja detectado, por PCR, no córtex cerebral, tálamo, mesencéfalo, ponte, medula, cerebelo e menos frequentemente no bulbo olfatório (VOGUEL et al., 2003). A reativação e excreção do vírus pode ocorrer naturalmente, em situações de estresse e experimentalmente com administração de dexametasona (PEREZ et al., 2002; VOGUEL et al., 2003). Geralmente, na reativação viral os animais não apresentam sinais clínicos, mas em infecções experimentais em bovinos, o reaparecimento dos sinais e desenvolvimento de enfermidade neurológica tem sido frequente (VOGUEL et al., 2003; PEREZ et al., 2002). A eliminação de BoHV-5 ocorre até o 17º dia

22 21 pós-infecção (PI) nas secreções nasais e até o 9º dia PI nas secreções orais; o pico de eliminação viral ocorre 4-7 dias PI (BARROS et al., 2006). Os animais afetados apresentam sinais clínicos caracterizados por anorexia, corrimento nasal e ocular, isolamento do rebanho (COLODEL et al., 2002; SALVADOR et al., 1998, HALFEN & RIET, 2007), depressão profunda (RIET-CORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002; RISSI et al., 2006), febre (ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006; RISSI et al., 2006), sialorréia (COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006), cegueira (RIET-CORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006; HALFEN & RIET 2007), nistagmo (SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002), marcha para trás ou andar em círculos (SALVADOR et al., 1998; ELIAS et al., 2004), pressão da cabeça contra objetos (COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006; HALFEN & RIET 2007), tremores musculares (COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004), deambular cambaleante, inabilidade para ingestão de água ou apreensão de alimentos, paralisia da língua (COLODEL et al., 2002; BARROS et al., 2006; HALFEN & RIET, 2007), bruxismo (ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006), decúbito prolongado com dificuldade para voltar à estação e, decúbito esternal evoluindo para decúbito lateral, movimentos de pedalagem, opistótono e morte (RIET-CORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006; RISSI et al., 2006; HALFEN & RIET, 2007). O curso da enfermidade é de 3-15 dias, com evolução média de 6 dias (BARROS et al., 2006). Nos casos de evolução mais longa os animais também apresentam emagrecimento progressivo (SALVADOR et al., 1998) ACHADOS DE NECROPSIA E HISTOPATOLÓGICO Na necropsia com frequência não são evidenciadas lesões significativas (SALVADOR et al., 1998; MEYER et al., 2001; COLODEL et al., 2002; RISSI et al., 2006;). As alterações encontradas variam de acordo com a intensidade de lesões degenerativas e inflamatórias do encéfalo. As principais alterações

23 22 macroscópicas incluem malácia cortical, comumente localizada no córtex frontal telencefálico, iniciando como áreas tumefeitas, marrom-amareladas ou hemorrágicas e que se tornam gelatinosas e acinzentadas com a progressão da doença (SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002; BARROS et al., 2006; RISSI et al., 2006). Em outras porções do encéfalo também são descritas eventualmente a ocorrência de áreas gelatinosas na substância cinzenta (malácia) do tálamo, núcleos da base e cápsula interna (ELIAS et al., 2004; RISSI et al., 2006). Nos casos mais avançados ocorrem depressões acentuadas indicando desaparecimento segmentar do córtex telencefálico, por vezes com aspecto granular ao corte (COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004; RISSI et al., 2006). Outras alterações encontradas incluem hiperemia difusa das leptomeninges (RISSI et al., 2006; BARROS et al., 2006), achatamento de circunvoluções, protrusão cerebelar pelo forâmen magno, congestão e focos de hemorragia submeningeana (RIET-CORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002, PEREZ et al. 2002). Microscopicamente, a infecção por herpesvírus causa meningoencefalite não-supurativa com malácia em diversas áreas do SNC, caracterizada por gliose focal e/ou difusa, infiltrado inflamatório perivascular misto, principalmente composto por linfócitos, plasmócitos e macrófagos, por vezes com número discreto de neutrófilos, localizados tanto na substância branca quanto cinzenta, mais pronunciados na substância branca, podendo formar até 16 camadas (SALVADOR et al., 1998; ELIAS et al., 2004). Há necrose não laminar ocorrendo principalmente na substância cinzenta do córtex cerebral, cujas alterações variam de acordo com o grau de evolução da doença. As lesões mais recentes são caracterizadas por necrose neuronal aguda (neurônios eosinofílicos e retraídos, satelitose, neuronofagia), tumefação do endotélio vascular, aumento do espaço perineuronal e perivascular, espongiose da neurópila em camadas corticais profundas (COLODEL et al., 2002; BARROS et al., 2006). Corpúsculos de inclusão eosinofílicos intranucleares são observados em neurônios, mas principalmente astrócitos tumefeitos com núcleo aumentado de volume e com cromatina rebatida formando um halo periférico. Ocasionalmente, são encontrados corpúsculos basofílicos que ocupam todo o núcleo de tamanho aumentado (RIET-CORREA et al., 1989;; SALVADOR et al., 1998;COLODEL et al., 2002; RISSI et al., 2006). Em alguns relatos os

24 23 corpúsculos de inclusão não são encontrados (BARENFUS et al., 1963; CARRILLO et al., 1983) ou raramente vistos (GEORGE et al., 1991). Com a progressão da enfermidade, superior a 3 dias observa-se infiltrado de macrófagos de citoplasma espumoso (células Gitter) nas áreas de malácia e região submeningeana. Ocasionalmente encontram-se áreas descorticadas, com substituição da neurópila por células Gitter e as meninges repousando sobre os vasos sanguíneos. No tálamo, cápsula interna, núcleos da base, tubérculo quadrigêmeo, ponte, cerebelo e medula oblonga e medula cervical a malácia geralmente é caracterizada por múltiplos nódulos gliais nos casos menos avançados e por acúmulos focais de macrófagos nos casos com lesões mais severas (SALVADOR et al., 1998) ou também são vizualizadas áreas contendo neurônios retraídos, fortemente eosinofílicos, gliose difusa ou multifocal e aumento dos espaços perivasculares (ELIAS et al., 2004). Segundo RISSI et al. (2006) a intensidade das lesões quanto a localização no encéfalo, foi mais acentuada, em ordem decrescente, na região cortical dos lobos frontais do telencéfalo, na cápsula interna e núcleos da base, no tálamo, no tronco encefálico, no córtex parietal, córtex occipital e cerebelo DIAGNÓSTICO O diagnóstico da Meningoencefalite por Herpesvírus tipo 5 pode ser presuntivo com base na anamnese, epidemiologia, sinais clínicos, achados de necropsia e histopatológicos característicos (ELIAS et al., 2004; RISSI et al., 2006; COLODEL et al., 2006). No entanto, a histopatologia associada a inclusões intranucleares não distingue entre BoHV-5 e BoHV-1. No diagnóstico laboratorial indireto, a sorologia tem valor limitado, uma vez que os métodos rotineiros disponíveis para a detecção de anticorpos não diferenciam animais infectados pelo BoHV-5 daqueles infectados pelo BoHV-1 (TEIXEIRA et al., 2001). Entretanto, há diferenciação sorológica entre os dois vírus através da técnica ELISA de bloqueio monoclonal para glicoproteína E (ge) de BoHV-1, que permite distinguir anticorpos anti-bohv-1 de anticorpos anti-bohv-5 (WELLEMBERG et al., 2001).

25 24 As técnicas de diagnóstico confirmatórias envolvem o isolamento do BoHV- 5 do encéfalo ou de secreção nasal dos animais doentes, podendo ser realizado em células de linhagem de rim bovino CRIB, MDBK (Madin Darby bovine kidney), cultivos primários de células de testículo de terneiro (TT), de pulmão de feto bovino e de células turbinadas de bovino (BT),observando o efeito citopático e confirmação através de testes de soroneutralização ou imunofluorescência (RIET-CORRÊA et al., 1989; BELKNAP et al., 1994; D OFFAY et al., 1995; SALVADOR et al., 1998; MEYER et al., 2001; KUNRATH et al., 2004), cuja distinção entre BoHV-5 e BoHV-1 pode ser realizada através de utilização de anticorpos monoclonais contra as glicoproteínas do envelope viral (OLDONI et al., 2004; KUNRATH et al., 2004). O mesmo pode ser realizado através da prova de imunoperoxidase (IPX) sobre cultivo de células infectadas (ROEHE et al., 1997; VOGUEL et al., 2002). Em tecidos fixados em formol e inclusos em parafina, a imunohistoquímica (IHQ) é a técnica mais indicada. A marcação por anticorpo primário para BoHV-5 detecta antígenos virais com concentrações diferentes em vários locais do sistema nervoso central, sendo mais intenso na região cortical do telencéfalo. Há marcação de neurônios, células da glia, macrófagos (D OFFAY et al., 1995) e células mononucleares do infiltrado perivascular (HÜBNER et al., 2005). A otimização da técnica permite a detecção inclusive em material de arquivo, através de métodos adequados de recuperação antigênica associado a anticorpos eficazes na detecção de BoHV-5 (HÜBNER et al., 2005). Geralmente, a quantidade de vírus isolado não tem correlação com a detecção através da IHQ. A técnica revela a presença de antígenos do BoHV-5 essencialmente nos locais do SNC que demonstram lesões inflamatórias (MEYER et al., 2001). As técnicas moleculares, para a detecção do genoma viral, como a PCR e nested-pcr (GOMES et al., 2002) podem ser empregadas com sucesso para o diagnóstico da infecção pelo BoHV-5. O multiplex PCR foi desenvolvido para diferenciação de BoHV-1 e BoHV-5 simultaneamente a partir da codificação de região genômica da glicoproteína B (COSTA et al., 2005), glicoproteína D (ALEGRE et al., 2001) ou glicoproteína C (ASHBAUGH et al., 1997; CLAUS et al., 2005). A técnica tem sido empregada tanto em tecido fresco quanto em material incluso em parafina (ELY et al., 1996; GOMES et al., 2002; FERRARI

26 25 et al., 2007). Também pode ser utilizada além destas técnicas, a análise de restrição enzimática no genoma (D ARCE et al., 2002) para diferenciação entre os dois herpesvírus DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL O herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) é o agente causador da meningoencefalite herpética em bovinos (ROIZMAN et al., 1992), embora ocasionalmente o herpesvírus bovino tipo 1(BHV-1) possa também causar encefalites (SILVA et al., 2007a). A enfermidade pode ser confundida com polioencefalomalacia, intoxicação pelo chumbo e outros agentes que conduzam a sinais clínicos neurológicos (RIET-CORREA et al., 2002) Polioencefalomalacia Polioencefalomalacia (PEM) é um termo descritivo para a necrose com amolecimento (malácia) da substância cinzenta (pólio) do encéfalo, também designada necrose cerebrocortical (BARROS et al., 2006). O termo PEM, no entanto, tem gerado controvérsia, pois foi empregado para designar uma doença específica de ruminantes associada à deficiência de tiamina, e não somente a uma lesão (JENSEN et al., 1956). Portanto, polioencefalomalacia pode ser um termo utilizado em doenças como a intoxicação por sal (privação hídrica) em suínos e bovinos (NAKAZATO et al., 2000), intoxicação por chumbo em bovinos (DRIEMEIER & BARROS et al., 2007), meningoencefalite por BoHV-5 (RIET-CORREA et al., 2006) e intoxicação por enxofre (GOULD, 1998). Também se denomina como polioencefalomalacia uma doença neurológica associada a distúrbios do metabolismo da tiamina. Os ruminantes dependem de síntese de tiamina pelas bactérias ruminais, portanto, alterações da flora ruminal podem levar à diminuição na produção de tiamina por falta de

27 26 bactérias que a sintetizam ou por presença de bactérias que produzem tiaminases,que hidrolizam a tiamina (JENSEN et al., 1956; LEMOS & RIET- CORREA, 2007). A deficiência de tiamina causa alteração da glicólise e alteração da produção de ATP, pois é cofator para enzima transcetolase que atua na via pentose fosfato, essencial para produção da maioria do ATP. A tiamnina também é cofator de outras enzimas do cliclo de Krebs (CEBRA & CEBRA, 2004). No Brasil, a PEM tem sido diagnosticada em vários Estados, sem que a etiologia tenha sido esclarecida. Alguns surtos são associados com intoxicação por cloreto de sódio/privação hídrica e outros a altos níveis de enxofre (LEMOS & RIET-CORREA, 2007). Ocorre principalmente em bovinos adultos, em pastejo extensivo, apresentando-se tanto na forma isolada como em surtos, com morbidade variando em torno de 1%, podendo chegar a 14%, e letalidade de 43% a 100% (BARROS et al., 2006). Os sinais clínicos são diversos, incluindo cegueira total ou parcial de origem central, andar a esmo ou em círculos, movimentos involuntários, incoordenação, tremores musculares, pressão da cabeça contra objetos, opistótono, nistagmo, estrabismo lateral, ataxia, diminuição dos reflexos palpebral e pupilar, diminuição do tônus da língua, depressão, tendência a afastar-se do rebanho, decúbito esternal e lateral e morte. Nas fases iniciais o animal pode apresentar agressividade e excitação (NAKAZATO et al., 2000; CEBRA & CEBRA, 2004; LIMA et al., 2005; LEMOS & RIET-CORREA, 2007; KUL et al., 2006; BARROS et al., 2006). Os achados de necropsia variam com a severidade e curso clínico da doença. Nos estudos de NAKAZATO et al. (2000) a maioria dos casos de PEM não havia relato de alterações macroscópicas. Dentre as alterações freqüentes, nos casos de evolução rápida o encéfalo está tumefeito por edema com achatamento dos giros cerebrais e herniação da porção caudal do telencéfalo pelo forâmen magno. As lesões corticais do telencéfalo variam desde alterações leves de cor (marrom-amarelada) até amolecimento e alteração acentuada na coloração do córtex telencefálico. Nos casos com evolução mais prolongada nota-se encéfalos de tamanho reduzido com desaparecimento do córtex cerebral (NAKAZATO et al., 2000; LIMA et al., 2005; BARROS et al., 2006).

28 27 Histologicamente a PEM se caracteriza por necrose laminar do córtex cerebral, observando-se aumento dos espaços perineuronais e perivasculares, e aumento da eosinofilia do citoplasma neuronal com picnose, proliferação dos vasos sangüíneos com células endoteliais tumefeitas e de núcleos arredondados (NAKAZATO et al., 2000), vacuolização da neurópila, esferóides axonais, hemorragias e discretos astrócitos reativos, gliose e infiltrado inflamatório mononuclear (LIMA et al., 2005). Dependendo do tempo de evolução é seguida de infiltração por macrófagos grandes com núcleos periféricos e citoplasma espumoso (células gitter) e cavitação. Em casos crônicos o córtex é substituído por células gitter. Pode ocorrer malácia dos núcleos da base, tálamo e mesencéfalo (LEMOS & RIET-CORREA, 2007). Nos casos associados à intoxicação por cloreto de sódio podem ocorrer discreta a moderada infiltração de eosinófilos principalmente nos espaços submeningeanos e perivasculares do córtex cerebral, e em alguns casos na neurópila, associados a hemorragia moderada a severa (NAKAZATO et al., 2000). O diagnóstico é realizado com base nos achados histopatológicos e reforçado pela epidemiologia, quadro clínico, achados de necropsia. A resposta ao tratamento com tiamina também auxilia o diagnóstico. As dosagens dos níveis de enxofre da água e pastagem, somando-se às quantidades da mistura mineral e verificando as quantidades consumidas pelos animais, complementa os quadros suspeitos de intoxicação por enxofre, assim como o nível de gás sulfeto de hidrogênio da camada gasosa dorsal do rúmen (LIMA et al., 2005; BARROS et al., 2006). Em suspeitas de intoxicação por sal, a confirmação pode ser obtida por dosagem dos níveis de sódio no líquor. A meningoencefalite por BoHV-5 possui semelhanças histológicas que dificultam e podem confundir com PEM, principalmente devido às extensas áreas de malácia cortical e infiltrado de células gitter. A diferenciação pode ser feita pela presença de lesões inflamatórias na substância branca e corpúsculos de inclusão intranucleares nos casos de infecção por BoHV-5 (LEMOS & RIET- CORREA, 2007). No início da enfermidade, os animais apresentam boa resposta ao tratamento com 10-20mg/kg de tiamina e 0,2mg/kg de dexametasona via intramuscular, repetindo o protocolo a cada 4 ou 6 horas, dependendo da

29 28 gravidade do caso (BARROS et al., 2006). Desconhece-se se a tiamina tem alguma ação no tratamento da intoxicação por cloreto de sódio, mas nos casos observados no Uruguai não houve resposta ao tratamento com tiamina (LEMOS & RIET-CORREA, 2007) Meningoencefalites Diversas doenças infecciosas em bovinos causam alterações microscópicas relacionadas a inflamações do sistema nervoso central, caracterizadas por infiltrado inflamatório perivascular, vasculite, infiltrado inflamatório meningeano, gliose multifocal ou difusa. As doenças de origem viral causam inflamações não-supurativas, predominando linfócitos, plasmócitos e macrófagos; por vezes há infiltrado inflamatório misto com predomínio de células mononucleares (BARROS et al., 2006). No Brasil, a Raiva é a principal doença inflamatória de origem viral do sistema nervoso de bovinos, atribuído pelo caráter zoonótico e pelo índice elevado de ocorrência em levantamentos realizados em animais que morreram com sintomatologia nervosa (SANCHES et al., 2000; UBIALI et al., 2007). No estudo histopatológico, nem sempre são visualizados corpúsculos de inclusão intracitoplasmáticos, sendo as técnicas de Imunofluorescência direta (IFD) e inoculação intracerebral em camundongos recém nascidos (IIC) os testes padrões de diagnóstico (MAPA, 2005). Nos casos histologicamente classificados como meningoencefalite ou meningoencefalomielite nãosupurativa aguda, o auxílio das técnicas IFD, IIC e imuno-histoquímica são necessárias para relacionar a inflamação com a infecção pelo vírus da Raiva (PEDROSO et al., 2008). Além da raiva, outras enfermidades virais são importantes como causa de inflamação no sistema nervoso em bovinos, como a Febre Catarral Maligna, doença de Aujeszky (BARROS et al., 2006) TRATAMENTO E PROFILAXIA

30 29 Nos casos de meningoencefalite por herpes não há tratamento e geralmente a letalidade é próxima a 100%. Há animais que se recuperam mas o percentual é baixo (RIET-CORREA et al., 1989; ELIAS et al, 2004). Não há medidas de controle e profiláticas diretas para os casos de infecção por BoHV- 5. A doença pode ser minimizada reduzindo situações de estresse, principalmente no desmame, quando há diminuição dos níveis de anticorpos da imunidade passiva (RISSI et al., 2006). Adicionalmente há necessidade de examinar animais antes da introdução dos mesmos no plantel, podendo testálos sorologicamente; isolar animais afetados e eliminar do rebanho animais sorologicamente positivos quando o número de animais reagentes for pequeno. Como método de controle, principalmente em surtos, aponta-se a vacinação do rebanho como uma possível alternativa. Estudos demonstram que há proteção cruzada entre os vírus BoHV-1 e BoHV-5, pois a vacina contendo antígenos apenas de BoHV-1 induz a produção de anticorpos com atividade neutralizante contra o BoHV-5 (VOGUEL et al., 2002). Os testes in vivo, de vacinas inativadas produzidas com amostra de BoHV-5, produzidas de suspensões virais com títulos altos e adjuvante oleoso, induzem a produção de níveis satisfatórios de anticorpos após a terceira dose (HALFEN et al., 2000). Em coelhos, os animais imunizados com vacina contendo antígenos para BoHV-1 obtiveram grau de proteção contra BoHV-5 (BELTRÃO et al., 2000). 3 MATERIAL E MÉTODOS Nos anos 1999, 2000, 2005, 2006, 2007 e 2008, um total de 402 amostras de encéfalo de bovinos com quadro clínico neurológico, foram coletadas por veterinários autônomos e veterinários do Instituto de Defesa e Agropecuária do Mato Grosso (INDEA-MT) e encaminhadas ao Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT). Estas amostras foram negativas no teste de imunofluorescência direta e prova

31 30 biológica que caracterizam o diagnóstico de infecção pelo vírus da raiva. Deste grupo foram selecionadas 76 amostras sendo assim distribuídas: 1999 (n=3), 2000 (n=9), 2005 (n=17), 2006 (n=26), 2007 (n=14) e 2008 (n=7). As amostras foram recebidas no LPV-UFMT em solução formalina e deste total, 9 amostras de encéfalos foram encaminhadas contendo também fragmentos refrigerados e congelados. Preferencialmente selecionaram-se fragmentos de regiões do córtex telencefálico, corpo estriado, tálamo e mesencéfalo para análise molecular, principalmente de áreas que tinham lesões microscópicas mais evidentes. Algumas amostras (16) continham apenas medula oblonga e cerebelo. As amostras de encéfalo enviadas foram processadas por métodos convencionais para análise histológica e coradas pela hematoxilina-eosina. As amostras foram classificadas em dois grupos distintos: Grupo 1. Amostras classificadas como meningoencefalite necrosante e não purulenta associadas com BoHV-5, sendo caracterizadas pela presença de infiltrado inflamatório mononuclear meningeano e perivascular, áreas multifocais de malácia com gliose, células gitter e corpúsculos de inclusão intranuclear em astrócitos e/ou neurônios (em 9 amostras), representando 22,5% dos casos ou amostras com lesões sugestivas de Meningoencefalite por BoHV-5, com lesões características sem que se tenha encontrado corpúsculos de inclusão. Grupo 2. Amostras classificadas como encefalite não purulenta inespecífica, quando havia apenas variável intensidade de infiltrado inflamatório mononuclear perivascular, freqüentemente focal ou multifocal, e por vezes com infiltrado meningeano discreto. As amostras de encéfalo pertencentes a estes 2 grupos foram submetidas a reação em cadeia pela polimerase (PCR) para BoHV-1 e BoHV-5 (CLAUS et al. 2005). A extração de DNA foi obtida de amostras inclusas em parafina ou material fresco congelado, por método fenol-clorofórmio (SAMBROOK et al. 1989) modificado. Os primers utilizados foram B1, específico para BoHV-1 (5-CAA CCG AGA CGG AAA GCT CC-3 nt ), B5, para BoHV-5 (5-CGG ACG AGA CGC CCT TGG-3nt ) e Bcon, primer consenso [5-AGT GCA CGT ACA GCG GCT CG 3nt (BoHV-1) e nt (BoHV-5)]. A leitura foi feita por eletroforese em gel de agarose 2,0%, corados com brometo de etídeo e analisadas em transluminador (UV-

32 31 300nm). Controles negativos e positivos para BoHV1 e BHV5 foram inseridos em cada PCR. Além disso, testou-se 30 amostras de encéfalo bovino, aparentemente sadios, sem alterações macro e microscópicas significativas. Estas amostras foram obtidas em abatedouro com Inspeção Federal (SIF 585) mantendo-se fragmentos de encéfalo sobre refrigeração e em solução de formalina 10% e após 30 dias foram processados por técnicas rotineiras para estudo histológico. Adicionalmente, de 11 bovinos deste grupo, coletaram-se amostras dos gânglios de Gasser, que foram divididos, sendo que parte foi refrigerada e parte foi mantida em solução de formalina 10%. Para controle positivo da reação foi utilizado DNA provenientes dos isolados SV-56/90 de BoHV-1 e SV-507/99 de BoHV-5 (SILVA et al. 2007a) obtidas no Setor de Virologia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria. 4 RESULTADOS De 402 amostras de encéfalo de bovino, que foram testadas negativas para raiva bovina nos anos 1999 e 2000, 2005 a 2008, encaminhadas para o LPV- UFMT, 76 (18,90%) foram classificadas dentro dos dois Grupos de estudo propostos para esse trabalho. Destas, 40 (52,63%) tinham lesões características ou sugestivas de infecção por BoHV-5 (Grupo 1) e 36 (47,36%) tinham encefalite não purulenta inespecífica (Grupo 2). Neste estudo não houve amplificação de BoHV-1 em amostras inclusas em parafina ou congeladas. Identificou-se DNA de BoHV-5 em material incluso em parafina em 40% (16/40) das amostras do Grupo 1 e em 33,33% (12/36) do Grupo 2 (Figuras 1 e 2). Do total de 76 amostras enquadradas dentro dos dois grupos de estudo, 67 amostras possuíam apenas material incluso em parafina, que ficou por diferentes períodos em solução de formol a 10%. Algumas amostras foram deixadas por períodos longos de fixação, variando de menos de um mês até

33 32 pouco mais de um ano. Houve diminuição crescente de positividade principalmente nas amostras que permaneciam fixadas por 50 dias ou mais. Outras nove amostras tinham materiais de encéfalo em parafina e conservados sob congelamento, seis pertencentes ao Grupo 1, e três ao Grupo 2. Identificou-se DNA de BoHV-5 em quatro das 6 amostras do Grupo 1 e em duas das 3 amostras do Grupo 2. Dessas mesmas amostras em parafina, apenas duas do Grupo 1 e uma do Grupo 2 foram positivas, havendo um decréscimo em 50% de positividade das mesmas amostras quando a análise foi realizada utilizando-se o material encaminhado em formalina e incluso em parafina. Dos materiais obtidos em frigorífico, uma amostra de gânglio Gasser amplificou DNA de BoHV-5 em material congelado, as demais foram negativas tanto para BoHV-5 como BoHV-1. 5 DISCUSSÃO Nesse trabalho, detectou-se DNA de Herpesvírus Bovino tipo 5 (BoHV-5) através da técnica de PCR em 40% das amostras do Grupo 1 e em 33,33% das amostras do Grupo 2. FERRARI et al. (2007) encontraram 75% de positividade na PCR para BoHV-5 em amostras de encéfalos com meningoencefalite necrosante que permaneceram por uma semana ou mais em formalina tamponada a 10%. Nos estudos retrospectivos realizados por ELY et al. (1996), demonstraram que em 32 casos de meningoencefalite não supurativa, 7 (21,87%) amostras foram detectadas como positivas para BoHV-5 e 1 (3,25%) detectado como BoHV-1, através das técnicas PCR e imunoperoxidase em amostras inclusas em parafina, as outras 24 amostras permaneceram sem diagnóstico. Em nosso estudo as amostras ficaram por períodos variáveis em solução de formalina, de poucos dias a mais de um ano. O tempo de fixação causa degradação do DNA e compromete o resultado da análise (KARLSEN et al. 1994). Nos estudos de GARMATZ et al. (2004), em 6 bovinos com diagnóstico histopatológico de febre catarral maligna (FCM) resultaram negativos no teste da PCR, atribuindo-se ao

34 33 tempo prolongado de fixação em formol a discordância entre achados histopatológicos característicos e os resultados do teste da PCR. Nos estudos de CRAWFORD et al. (1999) a PCR para FCM, em períodos de fixação superiores a 45 dias produziram resultados negativos ou fraco positivos. A influência do tempo de fixação também pôde ser avaliada em relação às amostras testadas fixadas em formalina e congeladas. Do total de 6 amostras positivas na PCR realizada em fragmentos de tecido congelado, a positividade caiu em 50% quando realizada a PCR do mesmo material incluso em parafina. Dentre as amostras com tecido congelado do Grupo 1, duas foram negativas no PCR tanto em material fresco quanto incluso em parafina. Quantidades insuficientes de DNA viral no tecido, quantidade escassa de amostra e falhas na extração do DNA são as principais causas que podem levar a ocorrência de resultados negativos, assim como ausência do DNA. Encefalite não-purulenta inespecífica é frequentemente encontrada em bovinos em nosso laboratório (UBIALI et al. 2008), aparenta uma condição inflamatória no encéfalo mas sem caracteristicas morfológicas compatíveis com etiológicas conhecidas. Esta lesão é por vezes encontrada em bovinos sem manifestação clínica neurológica, incluindo amostras obtidas em frigoríficos. No presente estudo, todas as amostras do Grupo 2 eram de bovinos que tinham no histórico sinais clínicos de distúrbios no sistema nervoso central e em 33,3% das amostras havia DNA de BoHV-5, o que caracteriza nestas amostras a infecção pelo Herpesvírus Bovino tipo 5 como determinante do quadro clínicopatológico. Sabe-se que nem todos os casos de meningoencefalite por herpes apresentam a característica evidente de malácia. Nos estudos de RISSI et al. (2006), em um estudo de 19 casos, todos os bovinos apresentavam como principal característica a meningoencefalie não-supurativa, sendo apenas alguns casos destes com malácia, variando quanto à localização e intensidade. Há também estudos de cepas de BoHV-5 com neurovirulência diferentes, o que poderia determinar padrões morfológicos distintos (FLORES et al. 2009). Para determinar a importância deste achado, a ausência de amplificação de BoHV-5 em 77% das amostras pode ter ocorrido devido as amostras serem negativas ou falso-negativas relacionadas ao local de coleta. A coleta e encaminhamento de amostras de locais pertinentes são importantes para confiabilidade diagnóstica dos resultados. Trabalhos em bovinos infectados

35 34 experimentalmente por BoHV-5 relatam que o vírus encontra-se na maioria dos casos presente no córtex frontal, gânglio de Gasser, mesencéfalo e tálamo (VOGUEL et al. 2003). Dentre as 36 amostras do Grupo 2, doze foram encaminhadas ao laboratório, sem partes pertinentes principais, impedindo análise histológica de locais onde as lesões são mais constantes, ou diferenciação entre outras patologias que causam lesões histológicas semelhantes. Também é necessário diferenciar a infecção do BoHV com outras infecções virais que acomete bovinos, principalmente pela infecção pelos vírus da raiva e febre catarral maligna. Neste estudo, as amostras foram testadas para Raiva pelos métodos de imunofluorescência direta e prova biológica, resultando negativas. Sabe-se que em alguns casos de raiva podem ocorrer resultados discrepantes entre as duas provas laboratoriais de eleição (PEIXOTO et al. 2000, LEMOS 2005) e, dependendo da localização das lesões e das amostras analisadas, ambos diagnósticos podem ser negativos (SILVA et al. 1974). A vasculite é a principal alteração em casos de febre catarral maligna, porém infiltrado perivascular mononuclear são achados no encéfalo de bovinos com esta patologia. A intensidade dessas lesões varia no sistema nervoso central (SNC) de acordo com a região anatômica afetada. As lesões mais proeminentes são encontradas nos vasos da rete mirabile carotídea, leptomeninge, espaços de Virchow-Robin e lesões menos graves no parênquima, especialmente na substância branca (GARMATZ 2004). Dentre o Grupo de amostras obtidas em frigorífico uma amostra amplificou BoHV-5, possivelmente associada característica do herpesvírus em estabelecer latência em gânglios sensoriais após infecção aguda (VOGUEL et al. 2003) e indicando a importância de associar as técnicas de caracterização etiológica com a observação de alterações morfológicas para complementação diagnóstica. Neste estudo trabalhamos também com amostras de encéfalo de bovinos com polioencefalomalacia (COLODEL, 2009 dados não publicados). BoHV-5 e BoHV-1 têm sido isolados de casos onde não se observam lesões inflamatórias significativas da infecção viral (RISSI et al. 2008, SILVA et al. 2007b). BoHV-5 pode ser detectado através do isolamento viral em caso caracterizado histologicamente como PEM (COLODEL et al. 2002). Realizamos PCR para BoHV-1 e BoHV-5 em 27 amostras inclusas em parafina, originárias de bovinos

36 35 com PEM no Estado de Mato Grosso e do Mato Grosso do Sul. Dentre estas, 9 amostras amplificaram DNA de BoHV-5, sugerindo que o vírus poderia estar se replicando em conseqüência de fatores relacionados com o desenvolvimento de PEM, ou que estava em estado de latência (DAVID et al. 2007). A importância do BoHV-1 na ocorrência de doenças de bovinos no Estado de Mato Grosso é desconhecida. Meningoencefalite associada ao BoHV-1 foi observada por SILVA et al. (2007a) em diferentes Estados; dentre 26 amostras isoladas de doença neurológica, cinco (19,3%) eram por BoHV-1. A utilização de um método molecular para detectar simultaneamente BOHV- 1 e BoHV-5 facilita este levantamento. No presente estudo, todas as amostras testadas foram negativas para BoHV-1. 6 CONCLUSÃO A importância do BoHV-1 na ocorrência de doenças de bovinos no Estado de Mato Grosso é desconhecida. A utilização de um método molecular para detectar simultaneamente BOHV- 1 e BoHV-5 facilita este levantamento. No presente estudo, todas as amostras testadas obtiveram resultado negativo para BoHV1. Nos quatro grupos avaliados neste trabalho detectou-se DNA de Herpesvírus Bovino tipo 5 (BoHV-5) através da técnica de PCR. Existem diversos métodos de detecção de BoHV-5. Dentre eles, os mais usados são imuno-histoquímica, PCR e isolamento viral. Entretanto, fatores como intensidade e distribuição de lesões, autólise e tempo de fixação em formol são variáveis importantes a serem levadas em consideração para que se tenha sucesso no diagnóstico (ELY et al. 1996; KARLSEN et al. 1994). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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44 43 ROEHE P.M., TEIXEIRA M.F.B. & ALMEIDA R.S Situação do BHV-1 e BHV-5 no Brasil, p In: Anais Simpósio Internacional sobre Herpesvírus Bovino (Tipo 1 e 5) e Vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV), Santa Maria. Pallotti, Santa Maria, RS. ROIZMAN, B., DESROSIERS R.C., FLECKENSTEIN B., LOPEZ C., MINSON A.C. & STUDDERT M.J The family herpesviridae: An update. Archives of Virology, 28(1):1-7. SALVADOR, C.S., LEMOS R.A.A., RIET-CORREA F., ROEHE P.M. & OSÓRIO A.L.A.R Meningoencefalite em bovinos causada por herpesvírus bovino-5 no Mato Grosso do Sul e São Paulo. Pesquisa Veterinária Brasileira, 18(2): SAMBROOK, J., FRITCSH, E.F., MANIATIS, T. Molecular cloning: A laboratory manual ed. New York : Cold Spring Harbor Laboratory,. 3v. 3104p. SANCHES A.W.D., LANGOHR I.M., STIGGER A.L. & BARROS C.S.L Doenças do sistema nervoso central em bovinos no sul do Brasil. Pesq. Vet. Bras. 20: SCHILD, A.L., RIET-CORREA, F., FERREIRA, J.L.M Doenças diagnosticadas pelo Laboratório Regional de Diagnóstico em Bol Lab Reg Diagnóstico, Pelotas, v.14, p SILVA M.S., BRUM M.C.S., WEIBLEN R. & FLORES E.F Identificação e diferenciação de herpesvírus bovino tipos 1 e 5 isolados de amostras clínicas no Centro-Sul do Brasil, Argentina e Uruguai ( ). Pesq. Vet. Bras. 27(10): SILVA M.S., BRUM M.C.S., LORETO E.L., WEIBLEN R. & FLORES E.F. 2007b. Molecular and antigenic characterization of Brazilian bovine herpesvirus type 1 isolates recovered from the brain of cattle with neurological disease. Virus Res. 129: SILVA R.A., SILVA N.M. & MENESES P.R.V Ocorrência do vírus da raiva na medula e bulbo de eqüinos na doença natural e sua ausência nas diferentes regiões do sistema nervosos central e outros tecidos. Pesq. Agropeq. Bras., Sér.Vet., 9: SOUZA V.F., MELO S.V., ESTEVES P.A., SCHMIDT C.S., GONÇALVES D.A., SCHAEFER R., SILVA T.C., ALMEIDA R.S., VICENTINI F., FRANCO A.C., OLIVEIRA E.A., SPILKI F.R., WEIBLEN R., FLORES E.F., LEMOS R.A.,

45 44 ALFIERI A.A., PITUCO E.M. & ROEHE P.M Caracterização de herpesvírus bovinos tipos 1 (BHV-1) e 5 (BHV-5) com anticorpos monoclonais. Pesq. Vet. Bras. 22: STEVENS J.G., Overview of herpesvirus latency. Semin. Virol. 5: TEIXEIRA M.F.B., ESTEVES P.A., SCHMIDT C.S.R., DOTTA M.A. & ROEHE P.M ELISA de bloqueio monoclonal para o diagnóstico sorológico de infecções pelo herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1). Pesq. Vet. Bras. 21(1): UBIALI D.G., CALDEIRA F.H.B., MORAES L.G., NETO W.S.P., ANTONIASSI N.A.B., ARRUDA L.P., SOUZA, M.A., COLODEL E.M Causas de enfermidades com sinais clínicos nervosos em bovinos no Estado de Mato Grosso entre Janeiro de 2005 e Abril de 2008 diagnosticadas no LPV-UFMT. In: Anais do Encontro Nacional de Diagnóstico Veterinário. Campo Grande, MS. (resumo). VOGEL F.S.F., FLORES E.F., WEIBLEN R. & KUNRATH C.F Atividade neutralizante anti-herpesvírus bovino tipos 1 (BHV-1) e 5 (BHV-5) no soro de bovines imunizados com vacinas contra o BHV-1. Ciência Rural, Santa Maria, 32: VOGUEL, F.S., F, CARON, L., FLORES, E.F., WEIBEN, R., WINKELMANN, E.R., MAYER, S.V., BASTOS, R.G., Distribution of Bovine Herpesvirus type 5 DNA in the central nervous systems of latently experimentally infected calves. J. Clin. Microbiol. 41, WEIBLEN, R., BARROS, C.S.L., CANABARRO, T.F Bovine meningoencephalitis from IBR virus. Vet. Rec. v.124, p WELLENBERG G.J., MARS M.H., OIRSCHOT J.T.V Antibodies against bovine herpesvirus (BHV) 5 may be differentiated from antibodies against BHV1 in a BHV1 glycoprotein E blocking ELISA. Veterinary Microbiology 78:

46 45 APÊNDICE A- Artigo submetido para a revista Pesquisa Veterinária Brasileira Detecção molecular de Herpesvírus Bovino tipo 1 e 5 (BoHV 1 e BoHV5) em amostras de encéfalo de bovinos com doenças neurológicas no Estado de Mato Grosso conservadas em formol e infiltradas em parafina 1 Laura P. Arruda 2, Luciano Nakazato 3, Valéria Dutra 3, Ricardo A. A. Lemos 4, Ana P.A. Nogueira 4, Danielle A. das Neves 5, Veronique M.C.L. Cortada 5, Raquel A.S. Cruz 3, Caroline A. Pescador 3, Edson M. Colodel 3 ABSTRACT.- Arruda, L.P., Nakazato, L., Dutra, V., Lemos, R.A.A., Nogueira, A.P.A., Das Neves, D.A., Cortada, V.M.C.L.,Cruz, R.A.S., Pescador, C.A. & Colodel, E.M [Molecular detection of Bovine Herpesvirus type 1 and 5 (BoHV) in formalin fixed and paraffin-embedded samples of neurological diseases in cattle of Mato Grosso State, Brazil]. Detecção molecular do Herpesvírus Bovino (BoHV) em amostras de encéfalo de bovinos com doenças neurológicas no Estado de Mato Grosso conservadas em formol e infiltradas em parafina. Pesquisa Veterinária Brasileira. Departamento de Clínica Médica Veterinária, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Av. Fernando Corrêa da Costa s/n, Bairro Coxipó, Cuiabá, MT , Brazil. moleta@ufmt.br Herpesvirus is one of the main causes of neurological diseases of cattle in the Midwest Region of Brazil. The application of molecular diagnostic techniques represents an important contribution for herpesvirus study. This report describes the detection of BoHV-5 and BoHV-1 by a specific multiplex PCR 1 Aceito em 2 Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT) Av. Fernando Corrêa da Costa s/n, Bairro Coxipó, Cuiabá, MT Departamento de Clinica Médica Veterinária, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Av. Fernando Corrêa da Costa s/n, Bairro Coxipó, Cuiabá, MT moleta@ufmt.br 4 Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Cx. Postal 649, Campo Grande, MS Agência Estadual de Defesa Sanitária Animal e Vegetal de MS, Laboratório de Diagnóstico de Doenças Animais e Análises de Alimentos. R: Senador Filinto Muller, Campo Grande, MS

47 46 assay in seventy-six central nervous system (CNS) samples including paraffinembedded, and in nine samples those both in fresh frozen and paraffinembedded. The samples were divided in 2 groups according to histological features: Group 1-necrotizing meningoencephalitis characteristic of BoHV infecction (40 samples), Group 2- mononuclear encephalitis nonspecific (36 samples). The positive case for BoHV-5 in paraffin-embebbed tissues in each group was 40% and 33,3%, respectively. BoHV-1 was negative in all samples tested. 6 Index terms: Bovine herpesvirus, PCR, BoHV-1, BoHV-5, Mato Grosso. RESUMO Infecção por Herpesvirus é uma das principais causas de doença do sistema nervoso em bovinos na região Centro-Oeste do Brasil. O uso de técnicas moleculares para caracterização diagnóstica representa uma contribuição importante para o estudo dessa doença. Relatamos o uso de técnica específica de PCR multiplex para identificar o herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) e tipo 1 (BoHV-1) em 76 amostras de encéfalo de bovinos fixados em formol e incluídos em parafina, com 9 destas em duplicidade para tecidos congelados. Com base nas alterações histológicas as amostras foram separadas em 2 grupos. Dentre 40 amostras de meningoencefalite necrosante com características histológicas de infecção por BoHV houve amplificação de DNA de BoHV-5 em 16 amostras e em 36 amostras com lesões histológicas classificadas como encefalite não purulenta inespecífica ocorreu amplificação do DNA de BoHV-5 em 12 amostras. Não houve amplificação de BoHV-1 nos encéfalo estudadas. Termos de indexação: Herpesvírus bovino, PCR, BoHV-1, BoHV-5, Mato Grosso. INTRODUÇÃO

48 47 Os distúrbios do sistema nervoso central (SNC) em bovinos abrangem um grupo de enfermidades importantes que incluem principalmente as doenças infecciosas e degenerativas (Riet-Correa et al. 2002). A identificação, em meados da década de 1980, da encefalopatia espongiforme bovina (BSE) e a relação com a variante da doença humana Creutzfeldt-Jakob (vcjd) realçou a importância socio-econômica e de saúde pública das doenças que acometem o SNC (Barros et al. 2006). As principais enfermidades que afetam o SNC de bovinos são causadas por vírus, destacando-se a raiva, meningoencefalite por BoHV-5 e febre catarral maligna (Barros et al. 2006; Sanches et al. 2000, Mendonça et al. 2008). A ocorrência de meningoencefalite por herpesvirus em bovino foi relatada no Estado de Mato Grosso (Colodel et al. 2002) sendo a doença neurológica inflamatória mais importante para bovinos no Estado, depois da raiva bovina (Ubiali et al. 2008) e tem sido relatada em vários outros Estados, como Rio Grande do Sul (Rissi et al. 2006), Rio de Janeiro (Silva et al. 2007), São Paulo, Mato Grosso do Sul (Salvador et al. 1998), Goiás (Paula et al. 2005), Pará (Riet-Correa et al. 2006), Paraná e Minas Gerais (Claus et al. 2007; Gomes et al. 2002). A infecção pelo BoHV-5 em bovinos determina um quadro neurológico que inclui diversos sinais clínicos. Entretanto, estudos demonstram que tanto o BoHV-1 como o BoHV-5 podem não estar estritamente associados às suas respectivas síndromes clínicas e estarem envolvidos em casos clínicos classicamente atribuídos ao outro vírus (Silva et al. 2007a). Diversos estudos têm proposto a utilização de técnicas moleculares na rotina de diagnóstico do BoHV-5 e diferenciação do BoHV-1, como a PCR e nested-pcr (Silva et al. 2007a; Claus et al. 2005, Ashbaugh et al. 1997; Ely et al. 1996) sendo estas específicas e práticas, além de outras técnicas existentes, a imunohistoquímica (Hübner et al. 2005, Voguel et al. 2003, Meyer et al. 2001), cultivo celular (Souza et al. 2002) e análise de restrição enzimática (D arce et al. 2002). Métodos que permitam detecção viral em materiais inclusos em parafina auxiliam a expansão do conhecimento a respeito dos herpevírus bovinos em amostras negativas para raiva, bem como em qualquer amostra arquivada em laboratórios de rotina histopatológica, permitindo estudos retrospectivos de

49 48 prevalência do Bohv-5, já que a similaridade entre os dois vírus e a dificuldade em diferenciação sorológica não permitiam boa documentação da prevalência do BoHV-5 no Brasil e no mundo (Roehe et al. 1998). Este trabalho tem por objetivo detectar o Herpesvírus Bovino 5 (BoHV-5) e o Herpesvírus Bovino 1 (BoHV-1) em encéfalos de bovinos testados negativos para Raiva e característicos de meningoencefalite por BoHV-5, além de bovinos diagnosticados com meningoencefalite não purulenta inespecífica, em amostras conservadas em formol e inclusas em parafina, ocorridos nos anos 1999 a 2008 no Estado de Mato Grosso. MATERIAL E MÉTODOS Nos anos 1999 a 2008, um total de 402 amostras de encéfalo de bovinos com quadro clínico neurológico, foram coletadas por veterinários autônomos e veterinários do Instituto de Defesa e Agropecuária do Mato Grosso (INDEA-MT) e encaminhadas ao Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT). Estas amostras foram negativas no teste de imunofluorescência direta e prova biológica que caracterizam o diagnóstico de infecção pelo vírus da raiva. Deste grupo foram selecionadas 76 amostras sendo assim distribuídas: 1999 (n=3), 2000 (n=9), 2005 (n=17), 2006 (n=26), 2007 (n=14) e 2008 (n=7). As amostras foram recebidas no LPV-UFMT em solução formalina e deste total, 9 amostras de encéfalos foram encaminhadas contendo também fragmentos refrigerados e congelados. Preferencialmente selecionaram-se fragmentos de regiões do córtex telencefálico, corpo estriado, tálamo e mesencéfalo para análise molecular, principalmente de áreas que tinham lesões microscópicas mais evidentes. Algumas amostras (16) continham apenas medula oblonga e cerebelo. As amostras de encéfalo enviadas foram processadas por métodos convencionais para análise histológica e coradas pela hematoxilina-eosina. As amostras foram classificadas em dois grupos distintos: Grupo 1. Amostras classificadas como meningoencefalite necrosante e não purulenta associadas com BoHV-5, sendo caracterizadas pela presença de infiltrado inflamatório mononuclear meningeano e perivascular, áreas multifocais de malácia com

50 49 gliose, células gitter e corpúsculos de inclusão intranuclear em astrócitos e/ou neurônios (em 9 amostras), representando 22,5% dos casos ou amostras com lesões sugestivas de Meningoencefalite por BoHV-5, com lesões características sem que se tenha encontrado corpúsculos de inclusão (Figuras 1 e 2). Grupo 2. Amostras classificadas como encefalite não purulenta inespecífica, quando havia apenas variável intensidade de infiltrado inflamatório mononuclear perivascular, freqüentemente focal ou multifocal, e por vezes com infiltrado meningeano discreto. As amostras de encéfalo pertencentes a estes 2 grupos foram submetidas a reação em cadeia pela polimerase (PCR) para BoHV-1 e BoHV-5 (Claus et al. 2005). A extração de DNA foi obtida de amostras inclusas em parafina ou material fresco congelado, por método fenol-clorofórmio (Sambrook et al. 1989) modificado. Os primers utilizados foram B1, específico para BoHV- 1 (5-CAA CCG AGA CGG AAA GCT CC-3 nt ), B5, para BoHV-5 (5- CGG ACG AGA CGC CCT TGG-3nt ) e Bcon, primer consenso [5- AGT GCA CGT ACA GCG GCT CG 3nt (BoHV-1) e nt (BoHV-5)]. A leitura foi feita por eletroforese em gel de agarose 2,0%, corados com brometo de etídeo e analisadas em transluminador (UV-300nm). Controles negativos e positivos para BoHV1 e BHV5 foram inseridos em cada PCR. Além disso, testou-se 30 amostras de encéfalo bovino, aparentemente sadios, sem alterações macro e microscópicas significativas. Estas amostras foram obtidas em abatedouro com Inspeção Federal (SIF 585) mantendo-se fragmentos de encéfalo sobre refrigeração e em solução de formalina 10% e após 30 dias foram processados por técnicas rotineiras para estudo histológico. Adicionalmente, de 11 bovinos deste grupo, coletaram-se amostras dos gânglios de Gasser, que foram divididos, sendo que parte foi refrigerada e parte foi mantida em solução de formalina 10%. Para controle positivo da reação foi utilizado DNA provenientes dos isolados SV-56/90 de BoHV-1 e SV-507/99 de BoHV-5 (Silva et al. 2007a) obtidas no Setor de Virologia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria. RESULTADOS

51 50 De 402 amostras de encéfalo de bovino, que foram testadas negativas para raiva bovina nos anos 1999 e 2000, 2005 a 2008, encaminhadas para o LPV-UFMT, 76 (18,90%) foram classificadas dentro dos dois Grupos de estudo propostos para esse trabalho. Destas, 40 (52,63%) tinham lesões características ou sugestivas de infecção por BoHV-5 (Grupo 1) e 36 (47,36%) tinham encefalite não purulenta inespecífica (Grupo 2). Neste estudo não houve amplificação de BoHV-1 em amostras inclusas em parafina ou congeladas. Identificou-se DNA de BoHV-5 em material incluso em parafina em 40% (16/40) das amostras do Grupo 1 e em 33,33% (12/36) do Grupo 2 (Figuras 3 e 4). Do total de 76 amostras enquadradas dentro dos dois grupos de estudo, 67 amostras possuíam apenas material incluso em parafina, que ficou por diferentes períodos em solução de formol a 10%. Algumas amostras foram deixadas por períodos longos de fixação, variando de menos de um mês até pouco mais de um ano. Houve diminuição crescente de positividade principalmente nas amostras que permaneciam fixadas por 50 dias ou mais. Outras nove amostras tinham materiais de encéfalo em parafina e conservados sob congelamento, seis pertencentes ao Grupo 1, e três ao Grupo 2. Identificou-se DNA de BoHV-5 em quatro das 6 amostras do Grupo 1 e em duas das 3 amostras do Grupo 2. Dessas mesmas amostras em parafina, apenas duas do Grupo 1 e uma do Grupo 2 foram positivas, havendo um decréscimo em 50% de positividade das mesmas amostras quando a análise foi realizada utilizando-se o material encaminhado em formalina e incluso em parafina. Dos materiais obtidos em frigorífico, uma amostra de gânglio Gasser amplificou DNA de BoHV-5 em material congelado, as demais foram negativas tanto para BoHV-5 como BoHV-1. DISCUSSÃO Nesse trabalho, detectou-se DNA de Herpesvírus Bovino tipo 5 (BoHV-5) através da técnica de PCR em 40% das amostras do Grupo 1 e em 33,33% das amostras do Grupo 2.

52 51 Ferrari et al. (2007) encontraram 75% de positividade na PCR para BoHV-5 em amostras de encéfalos com meningoencefalite necrosante que permaneceram por uma semana ou mais em formalina tamponada a 10%. Nos estudos retrospectivos realizados por Ely et al. (1996), demonstraram que em 32 casos de meningoencefalite não supurativa, 7 (21,87%) amostras foram detectadas como positivas para BoHV-5 e 1 (3,25%) detectado como BoHV-1, através das técnicas PCR e imunoperoxidase em amostras inclusas em parafina, as outras 24 amostras permaneceram sem diagnóstico. Em nosso estudo as amostras ficaram por períodos variáveis em solução de formalina, de poucos dias a mais de um ano. O tempo de fixação causa degradação do DNA e compromete o resultado da análise (Karlsen et al. 1994). Nos estudos de Garmatz et al. (2004), em 6 bovinos com diagnóstico histopatológico de febre catarral maligna (FCM) resultaram negativos no teste da PCR, atribuindo-se ao tempo prolongado de fixação em formol a discordância entre achados histopatológicos característicos e os resultados do teste da PCR. Nos estudos de Crawford et al. (1999) a PCR para FCM, em períodos de fixação superiores a 45 dias produziram resultados negativos ou fraco positivos. A influência do tempo de fixação também pôde ser avaliada em relação às amostras testadas fixadas em formalina e congeladas. Do total de 6 amostras positivas na PCR realizada em fragmentos de tecido congelado, a positividade caiu em 50% quando realizada a PCR do mesmo material incluso em parafina. Dentre as amostras com tecido congelado do Grupo 1, duas foram negativas no PCR tanto em material fresco quanto incluso em parafina. Quantidades insuficientes de DNA viral no tecido, quantidade escassa de amostra e falhas na extração do DNA são as principais causas que podem levar a ocorrência de resultados negativos, assim como ausência do DNA. Encefalite não-purulenta inespecífica é frequentemente encontrada em bovinos em nosso laboratório (Ubiali et al. 2008), aparenta uma condição inflamatória no encéfalo mas sem caracteristicas morfológicas compatíveis com etiológicas conhecidas. Esta lesão é por vezes encontrada em bovinos sem manifestação clínica neurológica, incluindo amostras obtidas em frigoríficos. No presente estudo, todas as amostras do Grupo 2 eram de bovinos que tinham no histórico sinais clínicos de distúrbios no sistema nervoso central e em 33,3% das amostras havia DNA de BoHV-5, o que caracteriza nestas amostras a

53 52 infecção pelo Herpesvírus Bovino tipo 5 como determinante do quadro clínicopatológico. Sabe-se que nem todos os casos de meningoencefalite por herpes apresentam a característica evidente de malácia. Nos estudos de Rissi et al. (2006), em um estudo de 19 casos, todos os bovinos apresentavam como principal característica a meningoencefalie não-supurativa, sendo apenas alguns casos destes com malácia, variando quanto à localização e intensidade. Há também estudos de cepas de BoHV-5 com neurovirulência diferentes, o que poderia determinar padrões morfológicos distintos (Flores et al. 2009). Para determinar a importância deste achado, a ausência de amplificação de BoHV-5 em 77% das amostras pode ter ocorrido devido as amostras serem negativas ou falso-negativas relacionadas ao local de coleta. A coleta e encaminhamento de amostras de locais pertinentes são importantes para confiabilidade diagnóstica dos resultados. Trabalhos em bovinos infectados experimentalmente por BoHV-5 relatam que o vírus encontra-se na maioria dos casos presente no córtex frontal, gânglio de Gasser, mesencéfalo e tálamo (Vogel et al. 2003). Dentre as 36 amostras do Grupo 2, doze foram encaminhadas ao laboratório, sem partes pertinentes principais, impedindo análise histológica de locais onde as lesões são mais constantes, ou diferenciação entre outras patologias que causam lesões histológicas semelhantes. Também é necessário diferenciar a infecção do BoHV com outras infecções virais que acomete bovinos, principalmente pela infecção pelos vírus da raiva e febre catarral maligna. Neste estudo, as amostras foram testadas para Raiva pelos métodos de imunofluorescência direta e prova biológica, resultando negativas. Sabe-se que em alguns casos de raiva podem ocorrer resultados discrepantes entre as duas provas laboratoriais de eleição (Peixoto et al. 2000, Lemos 2005) e, dependendo da localização das lesões e das amostras analisadas, ambos diagnósticos podem ser negativos (Silva et al. 1974). A vasculite é a principal alteração em casos de febre catarral maligna, porém infiltrado perivascular mononuclear são achados no encéfalo de bovinos com esta patologia. A intensidade dessas lesões varia no sistema nervoso central (SNC) de acordo com a região anatômica afetada. As lesões mais proeminentes são encontradas nos vasos da rete mirabile carotídea, leptomeninge, espaços de Virchow-Robin e lesões menos graves no parênquima, especialmente na substância branca (Garmatz 2004).

54 53 Dentre o Grupo de amostras obtidas em frigorífico uma amostra amplificou BoHV-5, possivelmente associada característica do herpesvírus em estabelecer latência em gânglios sensoriais após infecção aguda (Voguel et al. 2003) e indicando a importância de associar as técnicas de caracterização etiológica com a observação de alterações morfológicas para complementação diagnóstica. Neste estudo trabalhamos também com amostras de encéfalo de bovinos com polioencefalomalacia (Colodel, 2009 dados não publicados). BoHV-5 e BoHV-1 têm sido isolados de casos onde não se observam lesões inflamatórias significativas da infecção viral (Rissi et al. 2008, David et al. 2007). BoHV-5 pode ser detectado através do isolamento viral em caso caracterizado histologicamente como PEM (Colodel et al. 2002). Realizamos PCR para BoHV-1 e BoHV-5 em 27 amostras inclusas em parafina, originárias de bovinos com PEM no Estado de Mato Grosso e do Mato Grosso do Sul. Dentre estas, 9 amostras amplificaram DNA de BoHV-5, sugerindo que o vírus poderia estar se replicando em conseqüência de fatores relacionados com o desenvolvimento de PEM, ou que estava em estado de latência (David et al. 2007). A importância do BoHV-1 na ocorrência de doenças de bovinos no Estado de Mato Grosso é desconhecida. Meningoencefalite associada ao BoHV-1 foi observada por Silva et al. (2007a) em diferentes Estados; dentre 26 amostras isoladas de doença neurológica, cinco (19,3%) eram por BoHV-1. A utilização de um método molecular para detectar simultaneamente BOHV- 1 e BoHV-5 facilita este levantamento. No presente estudo, todas as amostras testadas foram negativas para BoHV-1. Existem diversos métodos de detecção de BoHV-5. Dentre eles, os mais usados são imuno-histoquímica, PCR e isolamento viral. Entretanto, fatores como intensidade e distribuição de lesões, autólise e tempo de fixação em formol são variáveis importantes a serem levadas em consideração para que se tenha sucesso no diagnóstico (Ely et al. 1996; Karlsen et al. 1994). Agradecimentos: Ao Prof. Dr. Rudi Weiblen e Mariana Sá e Silva, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Setor de Virologia, pela disponibilização de isolados virais controles positivos para BoHV-1 e BoHV-5 utilizados (SV-56/90 e SV-507/99). Ao Indea-MT e Laboratório de Apoio à Saúde Animal

55 54 (LASA), pelo encaminhamento de amostras negativas para raiva, para este estudo. Ao Prof. Dr. David Driemeier, do Departamento de Patologia Clínica Veterinária, UFRGS, Porto Alegre, pela disponibilização de amostras de Mato Grosso pertencentes ao Programa Nacional de Vigilância de Encefalopatia Espongiformes transmissíveis. Referências: Ashbaugh S.E., Thompson K.E., Belknap E.B., Schultheiss P.C., Chowdhury S. & Collins J.K Specific detection of shedding and latency of bovine herpesvirus 1 and 5 using a nested polymerase chain reaction. J. Vet. Diagn. Invest. 9: Barros C.S.L., Driemeier D., Dutra I.S., Lemos R.A.A Doenças do Sistema Nervoso de Novinos no Brasil. 1 ª Ed. Vallée, Montes Claros, MG. Claus M. P., Alfieri A. F., Flatschart A. V. F, Wosiacki S. R., Medici K. C., Alfieri A. A Rapid detection and differentiation of bovine herpesvirus 1 and 5 glycoprotein C gene in clinical specimens by multiplex-pcr. J. of Virological Methods 128: Claus M. P., Alfieri A,F., Médici K. C., Lunardi M., Alfieri A. A Bovine herpesvirus 5 detection by virus isolation in cell culture and multiplex-pcr in central nervous system from cattle with neurological disease in brazilian herds. Braz. J. of Microbiology 38: Colodel, E.M. Nakazato L., Weiblen R., Mello R.M., Silva R.R.P., Souza M.A., Oliveira J.A.F., Caron L Meningoencefalite necrosante causada por herpesvírus bovino no Estado de Mato Grosso, Brasil. Ciência Rural, 32 (2): Crawford T.B., Li H. & O Toole D Diagnosis of malignant catarrhal fever by PCR using formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Vet. Diagn. Invest. 11: D Arce R.C.F., Almeida R.S., Silva T.C., Franco A.C., Spilki F., Roehe P.M. & Arns C.W Restriction endonuclease and monoclonal antibodies analysis of Brazilian isolates of bovine herpesvirus types 1 and 5. Vet. Microbiol. 88: David N., Hubner S.O., Riet-Correa F., Halfen D. & Lemos R.A Reactivation of latent bovine herpesvirus type 5 in cattle with polioencephalomalacia induced by ammonium sulphate. Pesq Vet. Bras. 27(10): Ely R.W., d Offay J.M., Ruefer A.H. & Cash C.Y Bovine herpesviral encephalitis: a retrospective study on archived formalin-fixed, paraffin embedded brain tissue. J. Vet. Diagn. Invest. 8:

56 55 Ferrari H.F; Luvizotto M.C.R.; Rahal P.; Cardoso T.C Detection of bovine Herpesvirus type 5 in formalin-fixed, paraffin-embedded bovine brain by PCR: a useful adjunct to conventional tissue-based diagnostic test of bovine encephalitis. Journal of Virological Methods 146: Flores E.F., Weiblen R, Vogel F.S.F., Dezengrini R., Almeida S.R., Spilki F.R. & Roehe P.M Neuropatogênese experimental da infecção pelo herpesvírus bovino tipo 5 em coelhos. Pesq. Vet. Bras. 29(1):1-16. Garmatz S.L., Irigoyen L.F., Rech R.R., Brown C.C., Zhang J. & Barros C.S.L Febre catarral maligna em bovinos no Rio Grande do Sul: transmissão experimental para bovinos e caracterização do agente etiológico. Pesq. Vet. Bras. 24(2): Garmatz S.L Febre catarral maligna em bovinos no Rio Grande do Sul. Dissertação de mestrado, Universidade Federal de Santa Maria,RS, 151p. Gomes L.I., Rocha M.A., Costa E.A., Lobato Z.I.P., Mendes L.C.N., Borges A.S., Leite R.C., Barbosa-Stancioli E.F Detecção de herpesvírus bovino 5 (BoHV-5) em bovinos do Sudeste Brasileiro. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 54 (2): Hübner S.O., Pescador C., Corbellini L.G., Driemeier D., Spilki F.R., Roehe P.M Otimização da imunoistoquímica para detecção de herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) em tecidos do sistema nervoso central fixados com formaldeído. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., (57)(1):1-6. Karlsen F, Kalantari M, Chitemerere M, Johansson B, Hagmar B Modifications of human and viral deoxyribonucleic acid by formaldehyde fixation. Lab Invest. 71(4): Lemos R.A.A Enfermidades do sistema nervoso de bovinos de corte das regiões centro-oeste e sudeste do Brasil. Tese de Doutorado, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal. 155p. Mendonça F.S., Dória R.G.S., Schein F.B., Freitas S.H., Nakazato L., Boabaid F.M., Paula D.A.J., Dutra V. & Colodel E.M Febre catarral maligna em bovinos no Estado de Mato Grosso. Pesq. Vet. Bras. 28(3): Meyer G, Lemaire M.; Ros C., Belak K., Gabriel A., Cassart D., Coignoul F., Belak S. & Thiry E Comparative pathogenesis of acute and latent infections of calves with bovine herpesvirus types 1 and 5. Arch Virol 146: Paula, R.; Souza, M. A. ; Colodel, E.M ; Hübner, S.O ; Brum, K.B. ; Jorge, P. H. C. ; Damasceno, A.D Meningomieloencefalite causada pelo BHV-5 em um bovino no Estado de Goiás. Arq. Bras. Med. Vet. e Zootec., Belo Horizonte - MG, 57(1): 2. Peixoto Z.M.P., Cunha E.M.S., Sacramento D.R.V., Conceição M., Souza A.M., da Silva L.H.Q., Germano P.L., Kroeff S.S. & Kotait I Rabies laboratory diagnosis: peculiar features of samples from equine origen. Braz. J. Microb. 31 (1):72-75.

57 56 Riet-Correa G., Duarte M.D., Barbosa J.D., Oliveira C.M.C., Cerqueira V.D., Brito M.F & Riet-Correa F Meningoencefalite e polioencefalomalacia causadas por Herpesvirus bovino-5 no Estado do Pará. Pesq. Vet. Bras. 26(1): Rissi D.R., Oliveira F.N., Rech R.R., Pierezan F., Lemos R.A.A. & Barros C.S.L Epidemiologia, sinais clínicos e distribuição das lesões encefálicas em bovinos afetados por meningoencefalite por herpesvírus bovino-5. Pesq. Vet. Bras. 26: Rissi D.R., Pierezan F., Silva M.S., Flores E.F. & Barros C.S.L Neurological disease in cattle in southern Brazil associated with bovine herpesvirus infection. J. Vet. Diagn. Invest. 20: Roehe P.M., Teixeira M.F.B. & Almeida R.S Situação do BHV-1 e BHV-5 no Brasil, p In: Anais Simpósio Internacional sobre Herpesvírus Bovino (Tipo 1 e 5) e Vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV), Santa Maria. Pallotti, Santa Maria, RS. Salvador, C.S., Lemos R.A.A., Riet-Correa F., Roehe P.M. & Osório A.L.A.R Meningoencefalite em bovinos causada por herpesvírus bovino-5 no Mato Grosso do Sul e São Paulo. Pesquisa Veterinária Brasileira, 18(2): Sambrook, J., Fritcsh, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual ed. New York : Cold Spring Harbor Laboratory,. 3v. 3104p.. Sanches A.W.D., Langohr I.M., Stigger A.L. & Barros C.S.L Doenças do sistema nervoso central em bovinos no sul do Brasil. Pesq. Vet. Bras. 20: Silva M.S., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F Identificação e diferenciação de herpesvírus bovino tipos 1 e 5 isolados de amostras clínicas no Centro-Sul do Brasil, Argentina e Uruguai ( ). Pesq. Vet. Bras. 27(10): Silva M.S., Brum M.C.S., Loreto E.L., Weiblen R. & Flores E.F. 2007b. Molecular and antigenic characterization of Brazilian bovine herpesvirus type 1 isolates recovered from the brain of cattle with neurological disease. Virus Res. 129: Silva R.A., Silva N.M. & Meneses P.R.V Ocorrência do vírus da raiva na medula e bulbo de eqüinos na doença natural e sua ausência nas diferentes regiões do sistema nervosos central e outros tecidos. Pesq. Agropeq. Bras., Sér.Vet., 9: Souza V.F., Melo S.V., Esteves P.A., Schmidt C.S., Gonçalves D.A., Schaefer R., Silva T.C., Almeida R.S., Vicentini F., Franco A.C., Oliveira E.A., Spilki F.R., Weiblen R., Flores E.F., Lemos R.A., Alfieri A.A., Pituco E.M. & Roehe P.M Caracterização de herpesvírus bovinos tipos 1 (BHV-1) e 5 (BHV-5) com anticorpos monoclonais. Pesq. Vet. Bras. 22: Ubiali D.G., Caldeira F.H.B., Moraes L.G., Neto W.S.P., Antoniassi N.A.B., Arruda L.P., Souza, M.A., Colodel E.M Causas de enfermidades com

58 sinais clínicos nervosos em bovinos no Estado de Mato Grosso entre Janeiro de 2005 e Abril de 2008 diagnosticadas no LPV-UFMT. In: Anais do Endivet. Campo Grande, MS. (resumo). Voguel, F.S., F, Caron, L., Flores, E.F., Weiben, R., Winkelmann, E.R., Mayer, S.V., Bastos, R.G., Distribution of Bovine Herpesvirus type 5 DNA in the central nervous systems of latently experimentally infected calves. J. Clin. Microbiol. 41,

59 Figura 3.- PCR multiplex para detecção BoHV-1 e BoHV-5 em bovinos com doença neurológica. Eletroforese em gel de agarose a 2%. Canaleta 1: marcador; canaleta 2: controle negativo; canaleta 3: controle positivo para BoHV-1; canaleta 4: controle positivo para BoHV-5; canaleta 5 e 6: amostras de tecido em parafina positivas para BoHV-5; canaleta7: amostra negativa para BoHV Figura 4. PCR multiplex para detecção BoHV-1 e BoHV-5. Eletroforese em gel de agarose a 2%. Canaleta 1: marcador; canaleta 2: controle negativo; canaleta 3: controle positivo para BoHV-1; canaleta 4: controle positivo para BoHV-5; canaleta 7: amostra de tecido congelado positiva para BoHV-5; canaletas 5,6,8,9 e 10: amostras negativas para BoHV.