Editando Espectros de RMN com o Software MestReNova: Um Guia Prático

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1 Artigo Editando Espectros de RMN com o Software MestReNova: Um Guia Prático Forezi, L. S. M.;a,* Castelo-Branco, F. S.b Rev. Virtual Quim., 2017, 9 (6), Data de publicação na Web: 13 de novembro de Editing NMR Spectra with MestReNova Software: A Practical Guide Abstract: The Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is a technique that has many applications in chemistry, biochemistry and medical sciences. Within the chemistry, the NMR spectra allow elucidation and characterization from small molecules of synthetic or natural origin, to macromolecules and their interactions with ligands. However, in many cases, the edition of the spectra is restricted to proprietary software of workstations that are part of the NMR system, being performed by the operator of the equipment, which undoubtedly can delay the performance of new analyzes, as well as generate spectra that lacks some of the information that the user needs. Thus, independent editing by the users through spectral editing software, which can be installed on their personal computers, is highly useful, which can streamline the process, as well as allowing the user to extract all the relevant information of the 1 13 spectrum. Thus, this manuscript describes a practical guide to editing H NMR, COSY, C / APT, HSQC and HMBC NMR spectra from FID files through MestReNova 6.0 software, which is one of the most used in the world for this purpose. In addition to being intuitive and easy to operate, it offers a large variety of tools that can help students, professors and researchers in their NMR analysis Keywords: Spectroscopic techniques; H-RMN, C-APT-RMN; HSQC; HMBC; FID. Resumo A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma técnica que apresenta inúmeras aplicações, seja na química, bioquímica e ciências médicas. Dentro da química, os espectros de RMN possibilitam a elucidação e caracterização desde pequenas moléculas de origem sintética ou natural, até macromoléculas e suas interações com ligantes. No entanto, muitas vezes a edição dos espectros fica restrita à softwares proprietários exclusivos das estações de trabalho integrantes do sistema de RMN, sendo realizadas pelo próprio operador do equipamento, o que, sem dúvidas, pode atrasar a realização de novas análises, bem como não gerar espectros com todas as informações que o usuário necessita. Assim, a edição independente por parte do próprio usuário através de software de edição de espectros, que podem ser instalados em seu próprio computador, se mostra altamente útil, podendo agilizar o processo, além de permitir que o usuário extraia todas as informações que julgar pertinentes do espectro. Desta forma, este manuscrito descreve um guia prático de edições de espectros de RMN de 1 13 H, COSY, C/APT, HSQC e HMBC, a partir de arquivos FID, através do software MestReNova 6.0, que é um dos mais usados no mundo para este propósito e que, além de ser intuitivo e de fácil operação, apresenta inúmeras ferramentas que podem ajudar a alunos, professores e pesquisadores em suas análises por RMN Palavras-chave: Técnicas espectroscópcas; H-RMN, C-APT-RMN; HSQC; HMBC; FID. * Universidade Federal Fluminense, Departamento de Química Orgânica, Campus do Valonguinho, CEP , Niterói-RJ, Brasil. luanaforezi@hotmail.com DOI: /

2 Volume 9, Número 6 Novembro-Dezembro 2017 Revista Virtual de Química ISSN Editando Espectros de RMN com o Software MestReNova: um Guia Prático Luana S. M. Forezi,a,* Frederico S. Castelo-Brancob,* a Universidade Federal Fluminense, Departamento de Química Orgânica, Campus do Valonguinho, CEP , Niterói-RJ, Brasil. Fundação Oswaldo Cruz Fiocruz, Instituto de Tecnologia em Fármacos Farmanguinhos, Departamento de Síntese de Fármacos, Laboratório de Síntese 1, Manguinhos, , Rio de Janeiro-RJ, Brasil. b * luanaforezi@hotmail.com Recebido em 6 de novembro de Aceito para publicação em 12 de novembro de Introdução 2. Guia do Software MestreNova 2.1. RMN de Hidrogênio (1H) 2.2. Espectroscopia de Correlação (COSY) 2.3. RMN de Carbono 13 (13C)/APT 2.4. Espectroscopia Heteronuclear de Coerência de Quantum Simples (HSQC) 2.5. Espectroscopia hereronuclear de correlação entre múltiplas ligações (HMBC) 1. Introdução A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma técnica poderosa e versátil, largamente empregada na solução de problemas químicos, físicos e biológicos. Suas aplicações incluem: a caracterização de substâncias orgânicas de origem sintética ou natural, bem como a determinação de sua estrutura tridimensional, a localização dos sítios ativos de biomoléculas ou de moléculas adsorvidas na superfície de catalisadores e a interpretação de seus respectivos mecanismos de ação, entre muitas outras.1,2 A RMN passou por uma verdadeira revolução nos últimos anos Com o advento da informática, a partir dos anos 2000, a edição dos espectros de RMN foi popularizada e tornou-se uma ferramenta fundamental e indispensável para a elucidação e apresentação dos espectros de RMN nas teses, dissertações e publicações científicas a partir de softwares executáveis em computadores domésticos, não sendo mais restritos as estações de trabalhos anexas aos equipamentos de RMN. Os aparelhos atuais de RMN utilizam a técnica pulsada, na qual um campo magnético é aplicado aos núcleos analisados, através de pulsos de radiação de radiofrequência, o que os excita. Ao voltar ao estado fundamental, estes núcleos irradiam energia, a qual é detectada. A soma da energia irradiada por todos o núcleos é então

3 somada, gerando o decaimento de indução livre (FID, do inglês Free Induction Decay).3 Desta forma, os softwares de edição de espectros de RMN fazem o processamento dos arquivos contendo o FID e, após a transformada de Fourier (FT, do inglês Fourier Transform) é gerado o espectro tal qual conhecemos, e a edição poderá ser realizada. Assim, este artigo consiste em um guia prático para utilização do software MestReNova versão 6.0 (2009) de edição de espectros de RMN, visando a correta utilização de suas ferramentas por estudantes, professores e pesquisadores. Este Software é amplamente usado em todo mundo, sendo o mais conhecido e um dos mais completos para este propósito, além de ser intuitivo e de fácil operação.4 Assim, o usuário poderá fazer a edição de seus espectros de forma autônoma e independente, visualizando com mais detalhes as regiões de interesse do espectro, bem como apresentar as informações da forma mais pertinente, além de contar com todas as facilidades que o programa oferece. 2. Guia do Software MestReNova 2.1. RMN de Hidrogênio (1H) Abrir um FID Para abrir um determinado FID, com o MestreNova já aberto, segue-se os seguintes passos: - Clique em File Open Busque a pasta que contém o FID da amostra a ser analisar, dê um duplo clique no arquivo FID. Se o arquivo estiver zipado, basta dar um duplo click sobre ele. (*) Mesmo que o FID esteja compactado em arquivo zip, este também pode ser arrastado até a janela já aberta e soltado. Assim, aparecerá imediatamente o espectro. arrastar até essa janela - Aparecerá o espectro: 2652

4 Quando as páginas que estão do lado esquerdo da janela não estiverem visíveis, basta clicar em View Pages Corrigir a linha base Em alguns casos, ao abrir o espectro, a linha base encontra-se desalinhada. Este 2653 problema pede ser facilmente solucionado através da opção baseline correction, através do modo automático, bastando clicar neste botão.

5 Referenciar o espectro - Antes de iniciar a edição do espectro deve-se fazer a referência dos sinais. Esta poderá ser feita pelo tetrametilsilano (TMS), comumente usado em RMN como a referência do zero ppm, ou, na falta deste, poderá ser referenciado o solvente utilizado. - Clique no botão TMS e direcione o cursor para o pico a ser referenciado e clique sobre ele (o cursor estará com uma linha vermelha vertical). - Ao clicar aparecerá a seguinte imagem: 2654

6 Caso o sinal escolhido seja o do próprio TMS, após clicar em OK, este já ficará referenciado como zero. Caso a análise não tenha sido feita com a adição de TMS, poderá ser referenciado o solvente usado, conforme explicado abaixo: Clique em TMS, escolha o pico do solvente usado e clique sobre ele; - Clique em solventes e selecione o solvente usado na análise OK.

7 Expandir o espectro - Para expandir uma determinada região do espectro, basta clicar no botão de lupa e com o mouse, segurando o botão esquerdo, selecionar a área desejada e soltar o botão. - Para retornar ao modo de visualização total do espectro, clique no botão Full Spectrum (*) Para criar uma expansão adicional na mesma folha do espectro, clique em Expansion e selecione a região que deseja expandir (vide imagem abaixo). Para apagá-la basta selecionar a expansão e deletar. (**) Esses ícones estão localizados na parte superior da janela conforme mostrado na Figura abaixo: Ajustar as fases Após a expansão do espectro, podemos ver com detalhes a forma dos sinais apresentados. Em alguns casos, as fases destes encontram-se desajustadas, tornandoos distorcidos. Desta forma, será necessário realizar o ajuste de fases. Este processo poderá ser feito de forma automática, clicando no botão Automatic Phase Correction, porém, muitas vezes o resultado ainda não é satisfatório. Por isso, a correção manual poderá ser realizada. Para selecionar o ajuste manual, clique em Manual Correction na seta para baixo ao lado do ícone do Automatic Phase Correction. Uma caixa irá abrir e clicando com o botão esquerdo e arrastando para cima e para baixo, no local indicado, é corrigida a fase 0 e com o botão esquerdo corrige-se a fase

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9 Proceder a integração (*) Recomendável que se expanda a região para facilitar a integração dos sinais. Integração manual - A referência do programa para a primeira integral é 1,0 e todas as outras serão feitas com base nela. Para modificá-la dê um clique com o botão direito em cima do - Clique no botão Integration e selecione manual. Direcione o mouse até a extremidade esquerda da base do sinal e pressione o botão esquerdo do mouse e arraste-o até a extremidade direita do mesmo sinal e solte. marcador da integral (cor verde), click em Edit integral e digite o valor novo na caixa normalized. Veja nas figuras abaixo o enunciado. 2658

10 - Para apagar uma determinada integral clique em Integration e Delete Manually. Direcione o cursor para o sinal contendo a integral a ser apagada e selecione a região pressionando o botão esquerdo e arrastando-o até a extremidade direita e solte. no espectro clique com o botão direito Properties Integrals e desmarque Curve OK. Na mesma janela se pode mudar a cor da integral e o tamanho/cor/fonte do valor da integral (aparece na parte inferior do espectro abaixo de cada sinal). - Para apagar todas as integrais clique em Atribuir os deslocamentos químicos Integration e Delete All. - Para que a curva de integral não apareça 2659

11 - Se desejar atribuir os valores em um pico de cada vez clique em Peak Picking Peak by peak. Clicar sobre cada pico e o deslocamento aparecerá na parte superior. Se desejar atribuir os deslocamentos de uma única vez clique em Peak Picking Manual Threshold. Com o botão esquerdo pressionado, arraste o cursor até passar com a linha horizontal vermelha por todos os sinais desejados e solte. Esta é a opção mais prática e que apresenta os melhores resultados. - Para aumentar ou diminuir as casas decimais dos valores dos deslocamentos químicos clique no espectro com o botão direito Properties Peaks Decimals Editar a intensidade dos picos -Para aumentar ou diminuir a altura dos picos, clique no ícone ou. Também se pode utilizar a roda (scroll) do mouse para frente (para aumentar a intensidade) e para trás (para diminuir a intensidade) Mudar a aparência do espectro cores do espectro, tamanho e fonte das scales, integrals e peaks. - Para retirar o quadriculado do espectro clique em Properties Scales Grid desmarque as caixas show horizontal e show vertical OK. (*) Show frame pode deixar marcado, pois é a borda do espectro Melhorar qualidade do espectro a resolução e a Muitas vezes, dada a resolução do espectrômetro de RMN, os sinais têm multiplicidade difícil de se determinar. Em alguns casos, as técnicas de processamento do MestreNova podem melhorar a resolução dos sinais, auxiliando a sua atribuição. Uma das técnicas é a apodização, que pode ser aplicada por diferentes métodos. Para selecioná-la, basta clicar em Apodization e, em seguida, selecionar um dos diferentes métodos. De forma geral, o método sine bell costuma apresentar bons resultados e, após aplicação, necessita de reajuste na intensidade do sinal. No exemplo a seguir, após a apodização, pode-se notar a multiplicidade de forma mais fácil do que antes da técnica, quando o sinal, que é um tripleto de dupletos, poderia ser confundido com um quarteto. - Clique no espectro com o botão direito Properties. Lá se pode modificar as 2660

12 Uma outra forma de melhorar a qualidade do espectro é a suavização dos sinais. Para tal, basta selecionar a opção smoothing Diversas são as opções e intensidades de suavização, porém, o método Satizsky-Golay costuma apresentar os melhores resultados.

13 Determinar a constante acoplamento (J) e análise de multipletos de - Para se medir a constante de acoplamento clique em Multiplets Analysis Manual. Direcione o cursor para o sinal desejado e selecione a região pressionando o botão esquerdo e arrastando-o até a extremidade direita e solte. Faça o mesmo processo para todos os sinais que deseja determinar a constante de acoplamento J. Na parte superior de cada sinal aparecerá uma pequena caixa com o valor do deslocamento químico do sinal e sua multiplicidade. 2662

14 - Após esse passo clique em Multiplets Analysis report. Os valores dos J aparecerão para cada sinal, em texto colado no próprio espectro. Os valores de J já são apresentados em Hz. No report da análise de multipletos também é reportada a frequência do aparelho utilizado na análise, o número de hidrogênios, os valores dos deslocamentos químicos, bem como a multiplicidade de cada sinal, além de discriminar o solvente empregado na análise. Uma opção ainda mais útil é a de poder copiar o texto da análise de multipletos e colá-lo diretamente em um documento, tal como um relatório, artigo ou tese. Para tal, basta fazer a análise de multipletos para todos os sinais e em seguida clicar em 2663

15 Multiplets Analysis copy. O texto com todas as informações do espectro poderá ser colado onde o usuário desejar Retirar o texto do espectro Simular um espectro teórico - Desenhe a estrutura desejada no ChemDraw copie e cole-a em uma nova página do MestreNova selecione a estrutura e clique em Molecule Predict 1 H Spectrum. - Para retirar a caixa de texto com as informações da análise, clique com o botão direito Properties Spectrum clique em Common e desmarque a caixa title OK. A caixa fica localizada no canto superior esquerdo. Em Prediction Options pode-se mudar diversos parêmetros de predição, tal como a frequência do aparelho simulado (300 MHz, 500 Mhz etc.) e o solvente. Vale ressaltar que o espectro simulado poderá ser editado da mesma forma que um espectro experimental (real). 2664

16 (*) Para criar uma nova página em branco clique em Edit Create new page. Também pode-se usar o atalho ctrl+m. texto Espectroscopia de Correlação (COSY) Colar o espectro Abrir um FID de COSY Para colar um espectro no Word, PowerPoint etc, clique uma vez no espectro com o botão direito, copie e em seguida cole no lugar de destino Adicionar figuras e estruturas ao espectro - Para adicionar figuras ou estruturas ao espectro basta copiar e colar no espectro. (*) Recomenda-se copiar o espectro do MestreNova e colar o mesmo no arquivo Word desejado e em seguida anexar a estrutura sobre a imagem em uma caixa de Clique em File Open Busque a pasta que contém o FID que deseja analisar, dê um duplo clique no arquivo FID. Se o arquivo estiver zipado, basta dar um duplo click sobre ele. (*) Repare que a pasta é a cosy.fid e não H.fid. 1 (**) Se o FID estiver zipada também podese arrastar até a janela já aberta e soltar. Assim aparecerá imediatamente o espectro COSY. - O espectro COSY aparecerá da seguinte forma:

17 - Clique em Processing Symmetrize COSY. O espectro aparecerá de forma simétrica, entretanto sem os espectros de 1H na horizontal e vertical. - Para adicionar os espectros na horizontal e na vertical do COSY, clique em Show traces Setup. - Ao clicar em setup aparecerá a seguinte tela: A 1H.Fid precisa estar aberta 2666

18 - Selecione o FID do hidrogênio na caixa Available 1D Spectra e de OK para Horizontal Trace e Vertical Trace (*) A 1H.Fid precisa estar aberta. - A forma do espectro está representado a seguir: OK RMN de Carbono 13 (13C)/APT As técnicas de processamento e edição aplicadas ao RMN de 1H, poderão ser também utilizadas no RMN de 13C, respeitando-se as particularidades da análise deste núcleo. Abaixo são listados alguns procedimentos básicos Abrir um FID Clique em File Open Busque a pasta que contém o FID que deseja analisar, dê um duplo clique no arquivo FID. Se o arquivo estiver zipado, basta dar um duplo click sobre ele. (*) Repare que a pasta é a APT.fid ou 13C.Fid. (**) Se o FID estiver zipada também podese arrastar até a janela já aberta e soltar. Assim aparecerá imediatamente o espectro 13C ou 13C/APT.

19 Referenciar o espectro - Antes de iniciar a edição do espectro deve-se referenciar o solvente utilizado clicando no botão TMS, assim como na edição do espectro de RMN de 1H. Direcione o cursor para o pico a ser referenciado e clique sobre ele (o cursor estará com uma linha vermelha vertical). -Click em solventes e selecione o solvente usado na análise OK Atribuir os deslocamentos químicos - Se desejar atribuir os valores em um pico de cada vez clique em Peak Picking Peak by peak. Clicar sobre cada pico e o deslocamento aparecerá na parte superior. Se desejar atribuir os deslocamentos de uma única vez clique em Peak Picking Manual Threshold. Com o botão esquerdo pressionado, arraste o cursor até passar com a linha horizontal vermelha por todos os sinais desejados e solte. 2668

20 Simular um espectro teórico click sobre ele. (*)Repare que a pasta é a HSQC.fid. - Desenhe no ChemDraw copie a estrutura e cole em uma nova pagina do MestreNova selecione a estrutura e clique em Molecule Predict 13C Spectrum Espectroscopia Heteronuclear de Coerência de Quantum Simples (HSQC) Esta técnica correlaciona dois espectros com núcleos distintos, tal como 1H e 13C, conforme mostrado no exemplo a seguir. (**) Se o FID estiver zipada também podese arrastar até a janela já aberta e soltar. Assim aparecerá imediatamente o espectro do HSQC. - Para adicionar os espectros na horizontal e na vertical do HSQC, clique em Show traces Setup Selecione o FID do hidrogênio na caixa Available 1D Spectra e de OK para Horizontal Trace e selecione o FID do carbono na caixa Available 1D Spectra e de OK Vertical Trace Abrir um FID de HSQC - Clique em File Open Busque a pasta que contém o FID que deseja analisar, dê um duplo clique no arquivo fid. Se o arquivo estiver zipado, basta dar um duplo 2669 OK. (*) As 1H.Fid e 13C.Fid (ou APT.Fid) precisam estar abertas. - A forma do espectro de HSQC está representada a seguir:

21 Expansão 2.5. Espectroscopia hereronuclear de correlação entre múltiplas ligações (HMBC) Nesta técnica de correlação heteronuclear bidimensional, os núcleos de 1H e 13C podem ser correlacionados em distâncias de até 4 ligações Abrir um FID de HMBC - Clique em File Open Busque a pasta que contém o FID que deseja analisar, dê um duplo clique no arquivo fid. Se o arquivo estiver zipado, basta dar um duplo click sobre ele. (**) Se o FID estiver zipado também podese arrastar até a janela já aberta e soltar. Assim aparecerá imediatamente o espectro do HMBC. - Para adicionar os espectros na horizontal e na vertical do HMBC, clique em Show traces Setup Selecione o FID do hidrogênio na caixa Available 1D Spectra e de OK para Horizontal Trace e selecione o FID do carbono na caixa Available 1D Spectra e de OK Vertical Trace OK. (*) As 1H.Fid e 13C.Fid (ou APT.Fid) precisam estar abertas. - A forma do espectro está representada a seguir: (*) Repare que a pasta é a HMBC.fid. 2670

22 Referências Bibliográficas 1 Ross, B.; Tran, T.; Bhattacharya, P.; Watterson, D. M.; Sailasuta, N. Application of NMR spectroscopy in medicinal chemistry and drug discovery. Current Topics in 2671 Medicinal Chemistry 2011, 11, 93. [CrossRef] [PubMed] 2 Castelo-Branco, F. S.; Silva, B. V.; do Rio, G. F.; Santana, M. J.; Queiroz-Júnior, H. K.; Pinto, A. C.; Boechat, N.; Lião, L. M. Ressonância Magnética Nuclear de Substâncias Organofluoradas: um Desafio no Ensino de

23 Espectroscopia. Química Nova 2015, 38, [CrossRef] 3 Silverstein, R. M.; Webster, F. X.; Kiemle, D. J.; Identificação espectrofotométrica de compostos orgânicos, 7a. ed., LTC: Rio de Janeiro, 2006 Willcott, M. R. MestRe Nova. Journal of The American Chemical Society 2009, 131, [CrossRef]