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1 Ensaios Biológicos Multivariados Prof. Carlos Leite Universidade Federal da Paraíba Departamento de Estatística CCEN

2 Ensaios Biológicos Ensaios Biológicos é uma área de aplicação da ESTATÍSTICA pouco conhecida! Objetivo: Estimar a dose (potência) adequada de uma substância para produzir um determinado efeito nos organismos biológicos.

3 Ensaios Biológicos Variável latente; Univariados Planejamento de Experimentos; Modelos de regressão tipo dose- resposta; Anova; Teorema de Fieller.

4 Ensaios Biológicos Variável latente; Multivariados Planejamento de Experimentos; Modelos de regressão multivariada tipo dose-resposta resposta; MANOVA; Teorema de Fieller Multivariado; Testes adicionais.

5 Estrutura de um ensaio Biológico Estímulo (hormônio, inseticida, dose de uma substância); Unidade Experimental (organismos bio- lógicos: animais, humanos voluntários); Resposta ao estímulo (medição de uma ou mais características de interesse: reação ou inibição do organismo biológico).

6 Importância dos Ensaios Farmacologia; Endocrinologia; Biologia; Química; Ecologia; Medicina; Biológicos Controle de Qualidade de medicamen- tos.

7 Importância dos Ensaios Biológicos Determinação da potência de uma substância teste em relação a uma substância padrão. Determinação da potência adequada do principio ativo de um medicamento para combater os sintomas de uma doença e avaliar a intensidade de seus efeitos (contra-indicações e reações adversas).

8 Importância dos Ensaios Biológicos Multivariados Geralmente, na avaliação do efeito de um medicamento em um material biológico temos interesse em mais de uma variável resposta, que são medidas na mesma unidade experimental. Em problemas desse tipo, utiliza-se dados multivariados que são avaliados em função dos níveis de dose administrados.

9 Suposições para Validade dos Ensaios Biológicos Relação dose-resposta monótona; Us=Fs(zs) e Ut=Ft(zt), onde z é a dose. Considerando E(Us)=E(U )=E(Ut), ), a Potência relativa é definida por:ρ=zs/zt,ρ>0. Similaridade das preparações teste e padrão (define relação de proporciona- lidade entre as substâncias); Similaridade Ft(zt)= )=Fs(ρzt).

10 Modelos de Regressão para Ensaios Biológicos Pode-se considerar a relação entre dose e resposta linear ou não linear. Transformação na dose: x=log log(z) (z). Geralmente é utilizada a abordagem univariada ao invés da multivariada. Modelos lineares mais utilizados são: Linhas Paralelas; Razão das Inclinações.

11 Modelos Univariados para Ensaios Biológicos No Planejamento do EB, as doses podem estar distribuídas na região que produz respostas: Fracas EB Razão das Inclinações Moderadas EB Linhas Paralelas Fortes - EB Razão das Inclinações.

12 EB Linhas Paralelas Y s =α s +β s log(z s ), onde z s =ρz t Similaridade F t (z)=f s (ρz) Y t =α s +β s log(ρz t ) =α s +β s (µ+x t ), onde µ=log logρex t =log z t Neste Modelo: β s =β t =β α t =α s +β s µ, donde µ=(α t -α s )/β. Estimação pode ser feita por MQO.

13 EB Razão das Inclinações Y s =α s +β s z sλ, onde z s =ρz t Similarilade F t (z)=f s (ρz) Y λ t =α s +β s (ρz t ) =α s +β s ρ λ x t, onde x t =zλ t Neste Modelo: α t =α s =α; β t =β s ρ λ, dondeρ=( =(β t /β s ) 1/ λ. Estimação pode ser feita por MQO.

14 Testes de Validade Intervalo de Confiança para a Potência Relativa - Teorema de Fieller Similar ao teste H 0 :µ=µ 0 x H 1 :µ µ 0 O Teorema de Fieller proporciona I.C. para a razão entre v.a. normais. Quando µ 0 =0, os limites de confiança possibilitam o teste de que as substâncias apresentam a mesma potência.

15 Testes de Validade Normalidade; homocedasticidade; line- aridade; homogeneidade de variâncias; similaridade. Análise de variância para verificar as seguintes suposições: Regressão significativa; Similaridade entre as preparações S e T; Diferença não significativa entre as preparações; Desvios de linearidade.

16 Testes de Validade Na ANOVA, cada nível de dose é considerado como um tratamento; A soma de quadrados entre os trata- mentos é decomposta em 4 somas de quadrados: Das regressão; Da preparações; Da linearidade; E da similaridade.

17 Testes de Validade Regressão significativa indica que o modelo é adequado e assegura a relação entre a dose e a resposta que pode ser utilizada p/estimar a potência; Diferença não significativa entre preparações padrão e teste, pois as doses S e T devem produzir a mesma resposta esperada; Linearidade da regressão. Um desvio significativo da linearidade indica que o uso de uma relação dose-resposta linear não é apropriado; Similaridade entre as preparações indica uma relação de proporcionalidade entre S e T. No mod. L.P. essa suposição é equivalente ao paralelismo entre as retas S e T, enquanto que no mod. R.I., similaridade implica que as retas possuem interceptos iguais.

18 X N µ σ 2 (, ) Aplicação de EB Vamos comparar 2 substâncias sintetizadas a partir de um produto natural com o interesse de determinar qual dessas drogas potencializa o efeito de baixar a PAD. Modelo Estimado: S Lasbio363 x T-Lasbio364 α = 28, 07, β = 21,82, µ =-0,025, ρ=0,97 y y s t = 28, 02 21,87 x = 27,51 21,82 x t s ( ) Limites de Confiança para µ : P 0,41 < µ < 0, 46 = 0,95

19 X N µ σ 2 (, ) Aplicação de EB Fonte de Variação S Lasbio363 x T-Lasbio364 GL SQ F c Preparação 1 5,56 0,014 Regressão ,29 Paralelismo ,05 Linearidade ,82 Entre ,36 Dentro Total As drogas possuem aproximadamente a mesma potência e os testes de validade indicam que o modelo é adequado. A regressão foi significativa indicando que β 0 e que o desvio de linearidade foi rejeitado. A similaridade entre S e T foi aceita e o teste indica que as preparações estão atuando na mesma amplitude de respostas.

20 Ensaios Biológicos Multivariados O EB multivariado é uma extensão dos variável ensaios univariados, resposta é um onde a vetor r- dimensional (r 2) e a variável dose é unidimensional. Dessa forma, o gráfico da relação dose-resposta é uma espaço de dimensão (r+1). curva no

21 Ensaios Biológicos Multivariados Na aplicação anterior, há interesse que a droga baixe não apenas a PAD, mas também a PAS e a FC da cobaia. Essas 3 variáveis compõem uma variável resposta multivariada de dimensão três e como foram medidas na mesma unidade experimental, provavelmente são correlacionadas.

22 Ensaios Biológicos Multivariados Em geral, a análise é conduzida utilizando a média das variáveis respostas ou as variáveis são analisadas separadamente. Daí, a importância das técnicas multivariadas na estimação da potência relativa comum, pois essas diferentes variáveis medidas na mesma unidade amostral estão correlacionadas e representam um indicador de uma resposta fisiológica geral do organismo.

23 Ensaios Biológicos Multivariados Considerando as variáveis independentes, o erro tipo I fixado em 0,0505 p/cada variável e quebrando a unidade amostral, o erro tipo I cometido é igual aα=1 (1-α i ) p. Para o caso em que temo p=5 variáveis independentes, o erro tipo I cometido é 0,2262. Caso as variáveis sejam analisadas sem quebrar a unidade amostral de dimensão p=5, o erro tipo I seria 0,05.

24 E.B. Multivariados Rao (1954) explorou o problema do E.B. multivariado para o caso de 2 variáveis; Armitage, Bennett e Finney (1976) utilizaram testes da RV para combinação de E.B.; Vφlund (1980) estendeu a análise para o caso de r variáveis correlacionadas; Hui e Rosenberg (1985) analisam o EB multivariado da Razão das Inclinações baseado na técnica GMANOVA; Laska at al. (1985) estimam µ s/requererσsobsob Hs; Srivastava (1986) estima µ baseado autovalor/vetor de uma matriz 2x2; Hanuz (1995) analisa E.B. aplicado a unidades heterogêneas.

25 E.B. Multivariados Abordagens utilizam estratégias para análise dos E.B. que envolvem técnicas multivariadas usuais como testes multivariados, MANOVA, Regressão Multivariada, adaptados as restrições e suposições dos modelos p/ Enasios Biológicos de Linhas Paralelas e Razão das Inclinações.

26 E.B. Multivariados Os EB multivariados tem quase 30 anos e são pouco utilizados por falta de conhecimento dos pesquisadores da área e ferramentas específicas para tratar os EB s. Por curiosidade, recentemente procurei no R e só encontrei packages para EB univariados e não lineares.

27 Procedimento para Análise de EB Multivariado Testes para verificar a adequacidade das suposições do modelo: normalidade multivariada, homocedasticidade das matrizes de covariância das preparações S e T, e similaridade. Teste para paralelismo das curvas dose-resposta S e T; Teste para regressão; linearidade da relação dose-resposta Teste de significância dos vetores de parâmetros da regressão; Teste para seleção de variáveis resposta p/verificar se uma variável adicional proporciona informação relevante p/estimação da potência relativa; Teste da potência relativa comum; Determinação dos limites de confiança p/potência relativa. na

28 Modelo de Linhas Paralelas Multivariado ys = αs + βs xs, xs = log zs yt = αt + βt xt, xt = log zt ys, yt são vetores resposta de dimensão r; α s, α t são os interceptos (vetores coluna de dimensão r); βs, βt são as inclinações (vetores coluna de dimensão r); x, x são escalares definidos como logaritmo da dose. s t Como ρ = z z, ρ 0, temos que y = α + β log ρ z ys = αs + β s log ρ + log z t µ xt ( ) s t s s s t

29 Modelo de Linhas Paralelas Multivariado Similaridade requer relação de proporcionalidade entre S e T: Ut ( z) = U s ( ρ z) e ys = αs + β sµ + βs xt, αt = αs + β sµ e βs = βt = β, donde δ = βµ = αt α s e ys = yt, quando xs = µ + xt. Procedimento de teste da hipótese similaridade: 1)Teste de Similaridade Marginal H m : β s =β t. Em caso de rejeição da hipótese, deve-se optar pelo ensaio da razão das inclinações; 2) Teste da potência relativa comum H s :ρ 1 =ρ 2 =......=ρ r, pois numa resposta múltipla, as variáveis são indicadores de uma resposta fisiológica geral.

30 E.B. Multivariados Técnicas multivariadas clássicas adaptadas às restrições e suposições dos Ensaios Biológicos permitem a estimação do modelo. O teste de paralelismo marginal H m : β s =β t pode ser testada através da estatística T 2 de Hotelling.

31 E.B. Multivariados Caso a hip. H m seja aceita, devemos testar H s :ρ 1 =ρ 2 =......=ρ r. Estimativas de MV deβeµsão obtidas para compor o teste da RV assintótico para hipótese H s. Σ β e Σ δ são calculados a partir da matriz de covariâncias S. Caso a hipótese H s seja aceita, então o EMV para potência relativa comum é obtido por invariância como: ρ = exp µ

32 E.B. Multivariados Implementação e Aplicação das abordagens Estimação do Modelo baseado no MMV; Os principais resultados: Estimação da potência relativa; Intervalo de Confiança para potência (baseado no teorema de Fieller multivariado); Testes de validade do EB.

33 E.B. Multivariados Exemplo de aplicação: refere-se a análise de duas novas drogas que foram sintetizadas a partir de um produto natural e diferem apenas por um átomo na estrutura molecular de carbono e nitrogênio. Como as drogas se encontram em fase de estudo receberam o nome Lasbio363 e Lasbio364. O objetivo na administração dessas drogas é obter uma diminuição na PAD, PAS e FC. Essas 3 variáveis compõem uma resposta multivariada de dimensão 3.

34 E.B. Multivariados As drogas são administradas a ratos com peso médio de 280g em 6 níveis de dose num experimento completamente aleatorizado com 6 repetições. Como resultado do EB observou-se que a potência relativa comum estimada é 1,1818 indicando que uma unidade de lasbio364 equivale a 1,1818 unidades de lasbio363. Sendo assim, lasbio364 é um pouco mais potente em produzir um efeito de diminuir a PAD, PAS e FC.

35 E.B. Multivariados Os testes de validade indicam que as hipótese de paralelismo e de potência relativa comum foram aceitas, indicando que a suposição de similaridade é válida e existe uma relação de proporcionalidade entre as substâncias S e T. O intervalo de 95% de confiança para a potência relativa µ foi obtido através do teorema de Fieller multivariado e é dado por: (-0,56; 0,19)

36 E.B. Multivariados Abordagens multivariadas proporcionam: Abordagem unificada para estimar a potência relativa; Teste de Paralelismo: teste T 2 de hotelling para combinações lineares de interesse; Teste de similaridade; Teste da potência relativa comum; Intervalo de confiança para a potência baseado no teorema de Fieller multivariado;

37 E.B. Multivariados Devido a escassez de programas para a análise dos ensaios multivariados e completo desconhe- cimento por parte de seus usuários, das técnicas multivariadas, esses profissionais optam por quebrar a unidade amostral ou combinam as respostas de maneira arbitrária, obtendo assim, estimativas menos aperfeiçoadas. Daí a importância da produção de programas para análise dos ensaios multivariados e divulgação da existência dessas técnicas na farmacopéia para uma análise mais eficiente dos experimentos biológicos.