ESTUDO SOBRE A EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DOS FRUTOS DE VITEX (Vitex Agnus Castus L.)
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1 ESTUDO SOBRE A EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DOS FRUTOS DE VITEX (Vitex Agnus Castus L.) M.A. Echalar-Barrientos 1, J.M. Koketsu-Maeda 1, M. Thomazini 1, C.E.C. Rodrigues 1, C.S. Favaro-Trindade 1 1-Departamento de Engenharia de Alimentos - Universidade de São Paulo, Faculdade de Engenharia de Alimentos CEP: Pirassununga SP Brasil, Telefone: 55 (19) (carmenft@usp.br). RESUMO Vitex (Vitex agnus castus L.) é um fruto cujo extrato é utilizado como fitoterápico para atenuar os sintomas da tensão pré-menstrual, dentre os seus compostos ativos estão os compostos fenólicos. Considerando que frequentemente as mulheres preferem utilizar medicina complementar para tratar esses sintomas, a aplicação do extrato dos frutos de vitex como ingrediente funcional é promissora. Assim, o objetivo deste trabalho foi estabelecer as melhores condições de extração de compostos fenólicos totais do fruto de vitex e a caracterização do extrato. Diferentes concentrações de etanol em solução aquosa e binômios tempo-temperatura foram avaliados quanto à capacidade de extração de fenólicos totais de amostras de frutos de vitex. A quantificação dos compostos fenólicos totais foi realizada segundo metodologia Folin-Ciocalteu e o extrato obtido foi caracterizado em relação à umidade, sólidos totais, ph. A condição escolhida foi solvente 60 % de etanol, com maceração por 12 h a 60 o C. ABSTRACT Vitex (Vitex agnus castus L.) is a fruit used as raw material for tinctures and pills used to alleviate the symptoms of premenstrual syndrome, part of the herbal activity depends on its content of phenolic compounds. Whereas women often prefer to use complementary medicine to treat these symptoms, the application of the extract of vitex fruit as a functional ingredient is promising. Thus, the aim of this study was to establish the best conditions for the extraction of phenolic compounds of vitex berry and characterization of it. Different concentrations of ethanol solution and binomial time-temperature were evaluated for the extraction capacity of total phenolic vitex fruit samples. The quantification of total phenolic compounds was performed according to Folin-Ciocalteu method and the obtained extract was characterized for moisture, total solids and ph. The best extraction conditions were solvent 60% ethanol and maceration for 12 hours at 60 ᵒC. PALAVRAS-CHAVE: pimenta do monge; tensão pré-menstrual; binômio tempo-temperatura. KEYWORDS: Monk s pepper; Chasteberry; Premenstrual syndrome; binomial time-temperature. 1. INTRODUÇÃO Os frutos de vitex (Vitex agnus castus L.) foram utilizados na antiguidade como remédio para problemas femininos (Maia et al., 2001). Atualmente, o extrato dos frutos é utilizado como matéria prima de tinturas e pílulas, sendo o seu principal propósito atenuar os sintomas da tensão pré-
2 menstrual (TPM) (EMA, 2011). Parte da atividade fitoterápica dos extratos destes frutos contra os sintomas da TPM depende do seu teor de compostos fenólicos (Chen et al., 2011). Considerando que frequentemente as mulheres preferem utilizar medicina complementar para tratar os problemas femininos (Fugh-Berman e Kronenberg, 2003) e que o mercado de alimentos funcionais tem um alto potencial de crescimento e diversificação (Abad et al., 2010), a aplicação do extrato dos frutos de vitex como ingrediente funcional é promissora. A etapa de extração é fundamental para a isolação e purificação dos compostos bioativos de plantas, sendo que sua eficiência depende de vários fatores, tais como a temperatura, o tipo de solvente, o tempo de contato entre o sólido e solvente, entre outros (Cujic et al., 2016). Assim, o objetivo deste trabalho foi estabelecer as melhores condições de extração, e posterior caracterização do extrato obtido, em termos de concentração de etanol em soluções hidroalcoólicas e binômio tempo-temperatura para a extração de compostos fenólicos dos frutos de vitex utilizando-se a técnica por maceração, visando a posterior utilização do extrato como ingrediente funcional. 2. MATERIAL E MÉTODOS Os frutos maduros e secos de vitex foram obtidos da empresa Chá & Cia - Ervas Medicinais (São Paulo, Brasil). O reagente Folin Ciocalteu e o etanol absoluto foram obtidos da empresa Dinâmica (Diadema, Brasil) e o padrão de ácido gálico da Acros Organics (New Jersey, Estados Unidos) Otimização da Extração dos Compostos Fenólicos Os ensaios foram feitos utilizando-se uma proporção de sólido (frutos maduros, secos e triturados de Vitex agnus castus L.):solvente de 1,5:10, em massa. Primeiro foi realizado um estudo variando a concentração de etanol no solvente, utilizando o binômio tempo-temperatura de 45 o C por 1 hora. Uma vez escolhido o solvente, foi realizado outro estudo variando o binômio tempo e temperatura de contato entre o soluto e o solvente, a Tabela 1 mostra as variáveis de extração estudadas. Todas as condições foram testadas em triplicata, sendo as médias do teor de compostos fenólicos apresentadas. Tabela 1 - Variáveis e condições estudadas na extração de fenólicos dos frutos de vitex. Variável Condições estudadas Concentração de etanol no solvente (% m/m de etanol) 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 99,5 Temperatura ( o C) 25, 45 e 60 Tempo de contato (horas) 2, 6, 12 e 24 Fonte: própria autoria 2.2. Obtenção do Extrato O extrato otimizado foi preparado da seguinte forma: Razão sólido-solvente 1,5:10; solvente: solução etanólica 60 % (m/m) e binômio tempo-temperatura de 12h-60 o C sob agitação mecânica constante. Após a extração, a mistura foi centrifugada a 4 o C por 5 min a 2935 g e o sobrenadante (extrato etanólico) foi coletado. O extrato etanólico foi concentrado em rota-evaporador a 42 o C até a evaporação total do etanol (redução de 60% do volume inicial). Mesmo após essa primeira etapa de concentração,o teor de sólidos totais presentes no extrato aquoso ainda era baixo, desta forma, a fim de aumentar o teor de
3 compostos fenólicos, o extrato foi concentrado novamente a 45 o C até reduzir 50% do volume, em outras palavras 20% do extrato etanólico Caracterização do Extrato O extrato otimizado (etanólico, aquoso e concentrado) foi caracterizado em relação a umidade (em estufa ), ph (em potenciômetro) e teor de compostos fenólicos segundo metodologia proposta por metodologia proposta por Singleton et al. (1999). Ainda foi avaliada a atividade antibacteriana dos extratos concentrado, etanólico e seco por liofilização. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Determinação das Melhores Condições de Extração Os extratos dos frutos de vitex obtidos a partir da maceração com solventes com diferentes concentrações de etanol são mostrados na Figura 1. Figura 1 - Extratos do fruto de Vitex obtidos com solventes hidroalcoólicos com 10-99,5 % de etanol. Fonte: própria autoria. Os extratos apresentaram coloração castanho-esverdeada com diferentes tons dependendo do solvente utilizado. Os resultados da quantificação de compostos fenólicos totais para cada solvente estão apresentados na Tabela 2. Tabela 2 - Teor de compostos fenólicos dos extratos com solventes hidroalcoólicos com 10-99,5 % de etanol. Solvente (% etanol) Média (mg EAG/mL extrato) ,40 c 9,45 b,c 9,85 a,b 11,15 a 50 10,85 a,b 60 10,30 a,b 70 9,60 b,c 80 8,15 c 90 6,20 d 99,5 4,30 e Fonte: própria autoria. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente (p<0,05) entre si. Observa-se que houve aumento no teor de compostos fenólicos nos extratos à medida que a concentração de etanol aumentava, até quantidades intermediárias (40%), após isso, havia diminuição no teor dos compostos fenólicos. As soluções aquosas de etanol em concentrações intermediárias entre 30 e 60 % de etanol, apresentaram os maiores valores de teor de compostos fenólicos totais e não diferiram estatisticamente entre si pelo teste de médias de Tukey (p<0,05).
4 Teor de compostos fenolicos (mg EAG/ ml extrato) Comportamento similar ao obtido para os compostos fenólicos dos frutos de vitex foi observado no estudo de Cacace e Mazza (2003) para a extração de compostos fenólicos extraídos de groselha preta. Os autores observaram que o coeficiente de difusão e, portanto, a difusividade dos compostos fenólicos, aumentou com o aumento da concentração de etanol no intervalo de 39 até 67%, no entanto, quando a concentração de etanol foi mais elevada (67 95%) foi observada uma diminuição. De maneira geral, pode-se considerar que o processo de extração de um soluto de uma matriz sólida por meio de solventes se dá através de duas etapas, uma etapa inicial e rápida de lavagem, através da qual os solutos superficiais são removidos, seguida de uma etapa mais lenta na qual predomina o processo de difusão, atingindo a situação de equilíbrio na qual o máximo rendimento de extração nas condições de processo é obtido. A etapa difusional, considerando-se os compostos fenólicos é dependente da solubilidade destes compostos no solvente, que é consequência da polaridade do mesmo e, também, da viscosidade do solvente e da solução extrato. A variação na quantidade de etanol nos solventes hidroalcoólicos implica em uma variação na polaridade do mesmo, sendo observada uma diminuição da polaridade à medida que a % de etanol aumenta. Desta forma, pode-se inferir que soluções hidroalcoólicas com 30 a 60% de etanol apresentam polaridade e propriedades físicas, em termos de viscosidade, densidade e tensão superficial que maximizam a extração de compostos fenólicos. Normalmente decide-se trabalhar com o solvente com menor concentração de etanol por razões econômicas e de rendimento, no entanto, a Agência de Medicina Europeia (EMA) (2010) estabeleceu que os fitoterápicos dos frutos de vitex devem ser extraídos a partir de solvente hidroalcoólicos com 60 % (m/m) etanol, assim, com a finalidade de que o extrato preparado estivesse dentro do estabelecido pela EMA, optou-se por utilizar o solvente com 60 % etanol (m/m) o qual, de acordo com a Tabela 2, apresenta um teor de 10,30 mg EAG/mL extrato. Uma vez determinado o solvente, foram avaliados diferentes binômios tempo e temperatura, sendo os resultados estão apresentados na Figura 2. Figura 2 - Cinética de extração de compostos fenólicos dos frutos de vitex Tempo (horas) Fonte: própria autoria. Com base nos resultados apresentados na Figura 3, em relação ao efeito da temperatura, sabe-se que a solubilidade das substâncias geralmente aumenta com o aumento deste parâmetro. Assim, quanto maior a temperatura de extração, menor a viscosidade do solvente de extração, fazendo com que o coeficiente de difusão aumente, ou seja, maior a transferência de massa dos compostos fenólicos do interior das partículas à solução. Observa-se que, de maneira geral para as três condições de temperatura avaliadas, a condição de equilíbrio foi alcançada após 12 horas de extração. Assim,
5 determinou-se que a condição ótima para obtenção de extratos mais concentrados em compostos fenólicos foi de 60 C por 12 horas. Não foi encontrado nenhum estudo de otimização de extração dos frutos de vitex na literatura, no entanto, o estudo de Latoui et al. (2012) analisou a extração por maceração com metanol e etanol como solventes ( minutos, a temperatura ambiente) dos compostos fenólicos das folhas, sementes e raízes de vitex; como não analisaram do fruto de vitex não foi possível uma comparação. Já o estudo de Cujic et al. (2016) otimizou a extração dos compostos fenólicos dos frutos da arônia (Aronia melanocarpa L.) por maceração, neste caso foi estudado apenas o tempo (0,25-18h) sendo observado que a condição de equilíbrio foi alcançada com 1,3h. Já no estudo de Dvorackova et al. (2015) foi otimizada a extração dos compostos fenólicos da canela, sendo estudada a influência da temperatura (50, 80 e 110 ᵒC). Neste caso, a menor temperatura (50 ᵒC) mostrou ser a mais efetiva, sendo esta observação decorrente de uma possível degradação dos compostos fenólicos a temperaturas elevadas Caracterização dos Extratos Os resultados do teor de compostos fenólicos, umidade, sólidos totais e ph do extrato etanólico, extrato aquoso (obtido após a retirada do etanol) e do extrato concentrado (concentrado 50 % do extrato aquoso) estão apresentadas na Tabela 3. Tabela 3 - Caracterização dos extratos produzidos em relação ao teor de fenólicos, umidade, sólidos totais, sólidos soluveis e ph. Extrato Teor de fenólicos totais Umidade Sólidos Totais ph (mg EAG/ ml extrato) (g/ 100g) (% m/m) Etanólico 20 ± 1 98,6 ± 0,4 1,4 N.A. Aquoso 38 ± 1 96,7 ± 0,5 3,3 4,95 Concentrado 65 ± 2 92,7± 0,9 7,3 4,93 Fonte: própria autoria. Onde N.A = Não se aplica. Como esperado, o teor de sólidos totais aumentou à medida que o extrato foi concentrado, tendo uma correlação direta com o aumento do teor de fenólicos totais, no entanto o teor destes compostos foi menor que o esperado devido a possíveis perdas durante o processo de concentração. Assim, observa-se que do extrato etanólico para o extrato aquoso o teor de fenólicos totais quase dobrou, já o extrato concentrado apresentou maior teor de fenólicos totais, tal como esperado. Não foi possível encontrar na literatura estudos que avaliaram o teor de compostos fenólicos totais nas mesmas condições de extração empregadas, para efeito de comparação. No estudo de Sarikurkcu et al. (2009), quantificou-se o teor de fenólicos dos extratos obtidos a partir dos frutos de vitex, porém, como solventes foram empregados água e metanol, e os resultados foram 112,46 ± 1,22 e 46,50 ± 1,39 mg EAG/ g extrato em base seca, respectivamente. No entanto, este estudo trabalhou com uma extração por Soxhlet e não com maceração, impossibilitando a sua comparação. 4. CONCLUSÕES Através deste estudo foi possível determinar condições favoráveis para a extração dos compostos fenólicos dos frutos de vitex, otimizando assim a extração pela técnica de maceração. Ainda foram caracterizados os extratos obtidos em relação ao teor de compostos fenólicos, umidade e ph. Assim, a melhor condição foi estabelecida para o solvente 60% de etanol, com maceração por 12 h a 60 o C, com teor de fenólicos totais de 10,30 mg EAG/ ml de extrato.
6 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Capes pela bolsa de mestrado de M.A. Echalar-Barrientos. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abad, M. J., Bedoya, L. M., & Bermejo, P. (2010). An update on drug interactions with the herbal medicine Ginkgo biloba. Current drug metabolism, 11(2), Cacace, J. E., & Mazza, G. (2003). Mass transfer process during extraction of phenolic compounds from milled berries. Journal of Food Engineering, 59(4), Chen, S. N., Friesen, J. B., Webster, D., Nikolic, D., van Breemen, R. B., Wang, Z. J., Fong, H. H. S., Farnsworth, N. R., & Pauli, G. A. (2011). Phytoconstituents from Vitex agnus-castus fruits. Fitoterapia, 82(4), Cujic, N., Savikin, K., Jankovic, T., Pljevljakusic, D., Zdunic, G, & Ibric, S. (2016). Optimization of polyphenols extraction from dried chokeberry using maceration as traditional technique. Food chemistry, 194, Dvorackova, E., Snoblova, M., Chromcova, L., & Hrdlicka, P. (2015). Effects of extraction methods on the phenolic compounds contents and antioxidant capacities of cinnamon extracts. Food Science and Biotechnology, 24(4), European Medicines Agency. (2010). Community herbal monograph on Vitex agnus-castus L., fructus. Disponível em _Community_herbal_monograph/2011/01/WC pdf Fugh-Berman, A., & Kronenberg, F. (2003). Complementary and alternative medicine (CAM) in reproductive-age women: a review of randomized controlled trials. Reproductive toxicology, 17(2), Latoui, M., Aliakbarian, B., Casazza, A. A., Seffen, M., Converti, A., & Perego, P. (2012). Extraction of phenolic compounds from Vitex agnus-castus L. Food and Bioproducts. Processing, 90(4), Maia, A. C. C. M., Soares, F. C. C., & Junior, M. H. B. (2001). Vitex agnus castus L. : Um Estudo Etnobotânico e Etnofarmacológico. Revista Virtual de Iniciação Acadêmica da UFPA, 1(2), Sarikurkcu, C., Arisoy, K., Tepe, B., Cakir, A., Abali, G., & Mete, E. (2009). Studies on the antioxidant activity of essential oil and different solvent extracts of Vitex agnus castus L. fruits from Turkey. Food and Chemical Toxicology, 47(10), Singleton, V. L., Orthofer, R., & Lamuela-Raventos, R. M. (1999). Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-ciocalteu reagente. Methods of Enzymology, 299,
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