OTIMIZAÇÃO MULTIVARIADA DA EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS CLOROGÊNICOS EM CAFÉ
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- Branca Flor Monteiro Barateiro
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1 OTIMIZAÇÃO MULTIVARIADA DA EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS CLOROGÊNICOS EM CAFÉ A.D. Meinhart 1, T.F.F. da Silveira 2, J. Teixeira-Filho 3, H.T. Godoy 4 1- Departamento de Ciência de Alimentos Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos CEP: Campinas SP Brasil, Telefone: +55 (19) Fax: +55 (19) (adrianadille@gmail.com) 2- Departamento de Ciência de Alimentos Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos CEP: Campinas SP Brasil, Telefone: +55 (19) Fax: +55 (19) (ferreira.tayse@gmail.com) 3- Faculdade de Engenharia Agrícola Universidade Estadual de Campinas CEP: Campinas SP Brasil, Telefone: +55 (19) Fax: +55 (19) (jose@feagri.unicamp.br) 4- Departamento de Ciência de Alimentos Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos CEP: Campinas SP Brasil, Telefone: +55 (19) Fax: +55 (19) (helenatg@unicamp.br) RESUMO O café é uma importante fonte de ácidos clorogênicos e neste trabalho foi realizado um estudo de otimização multivariada para verificar qual a melhor condição de extração destes compostos. Foi empregado um planejamento composto central 2 3, com pontos centrais e axiais e a função de Derringer e Suich para realizar a otimização. As análises foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência. As condições ótimas de extração encontradas são simples, de baixo custo, com análise rápida e sem a geração de resíduos tóxicos. ABSTRACT Coffee is a major source of chlorogenic acids and in this work we performed a multivariate optimization study to determine how best extraction condition of these compounds. It was used a central composite design 2 3, with central and axial points and Derringer and Suich function to perform optimization. The analyzes were conducted by high-performance liquid chromatography. The optimum extraction conditions found are simple, low cost, rapid analysis and without the generation of toxic waste. PALAVRAS-CHAVE: café; ácido clorogênico; extração; otimização. KEYWORDS: Coffee; chlorogenic acid; extraction; optimization. 1. INTRODUÇÃO Dentre os compostos bioativos presentes nos alimentos, se destacam os ácidos clorogênicos, compostos fenólicos considerados como importantes agentes antioxidantes que reduzem o risco de câncer, doenças neurogederativas e doenças cardiovasculares (LIU, 2003; RICE-EVANS, 1997; SCALBERT, 2005). O café é uma fonte em potencial destes compostos (CARDOSO JÚNIOR, 2007; CLIFFORD, 1990; DUARTE, 2011; FILIP, 2001; MARQUES, 2009; RIBANI, 2006; RISSO, 2007) e por isso, neste estudo, foram avaliadas as melhores condições de extração de ácidos clorogênicos nesta matriz.
2 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Materiais O café do tipo torrado e moído foi fornecido por uma indústria de localizada no estado de São Paulo. Os padrões dos ácidos 4-CQ, 5-CQ, 3,4-DQ, 3,5-DQ e 4,5-DQ foram adquiridos da Biopurify (Chengdu, China). O padrão de 3-CQ não foi possível adquirir já que nenhum fornecedor tinha disponibilidade de entrega por isso foi purificado no laboratório. O metanol foi adquirido da J.T. Baker (Brasil), ácido fórmico da Synt (Brasil) e etanol P.A. da Synt (Brasil). 2.2 Otimização multivariada A otimização da extração foi realizada de forma multivariada, utilizando um planejamento composto central 2 3, com pontos centrais e axiais. Todos os ensaios foram realizados em duplicatas aleatórias, com o ponto central em triplicata. As variáveis investigadas foram o tempo de agitação, o volume da solução extratora para 0,5 grama de amostra e o percentual de etanol da solução extratora. Os níveis estudados variaram de 5 a 60 minutos de tempo de agitação, 5 a 15 ml de volume de solução extratora e 0 a 100% de etanol na solução (valores que correspondem aos níveis codificados do planejamento multivariado -1,68 e +1,68, respectivamente). As amostras de café torrado e moído foram homogeneizadas e pesadas (0,5 g) em tubo de ensaio com tampa de 50 ml. Então foi adicionada a solução extratora, cujos volumes e percentuais de etanol:água foram determinados pela matriz de planejamento dos ensaios multivariados (Tabela1). O os tubos foram levados a agitação (240 rotações por minuto), durante o tempo determinado pelo planejamento, em banho-maria, sob temperatura constante de 60ºC. Os dados foram analisados com o auxílio do software Design Expert 6.0, através da análise de variância para a construção dos modelos. Para a otimização simultânea das respostas foi empregada a ferramenta de otimização desenvolvida por Derringer e Suich (Derringer, 1980). 2.3 Método de análise As análises dos extratos obtidos em cada condição experimental foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência, empregando um cromatógrafo Agilent 1260 (Alemanha), com bomba quaternária, amostrador automático, forno de coluna controlado em 30ºC, coluna C18, com 100 mm de comprimento, 4,6 mm de diâmetro interno e 3,5 µm de tamanho de partícula (Agilent, Alemanha). A fase móvel foi composta de metanol e água acidificada com ácido fórmico (0,1%, ph 2,4), com gradiente linear iniciado com 13,9% de metanol e 86,1% água acidificada, com aumento linear até 35% de metanol e 65% de água acidificada aos 7,5 minutos, a partir deste tempo até o final da corrida a composição da fase móvel foi mantida constante até os 19 minutos. O tempo de reequilíbrio da coluna foi de 3 minutos. A vazão foi de 1,2 ml.min -1 e o volume de injeção de 30 ul. A identificação dos compostos foi realizada por comparação com padrões e através do espectro de absorção do DAD a 325 nm. O método foi validado e apresentou figuras de mérito de acordo com as normas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Brasil, 2003).
3 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na tabela 1 estão apresentadas as variáveis estudadas, os níveis e os resultados médios obtidos em cada experimento do planejamento composto central. Tabela 1: Resultados obtidos no estudo de otimização para extração de ácidos clorogênicos em café Variáveis codificadas e níveis (A) Tempo (B) Volume (C) %Etanol Concentração (mg.100 g -1 de café) 3-CQ 5-CQ 4-CQ 3.4-DC 3.5-DC 4.5-DC Soma ,7 360,75 305,25 34,5 12,2 31,05 906, ,45 376,05 318,4 35,7 12,6 31,1 946, ,6 361,9 41,45 14,7 39, , ,7 361,2 304,95 34,35 12,55 32,4 910, ,6 392,95 332,95 37, , ,4 422,1 358,45 39,6 13,85 39, , ,65 417,15 352,95 41,65 15,15 38, , ,75 361,7 304,95 35,6 12,7 32,25 910, ,4 393,7 331,3 38,9 14,3 39,5 995, ,4 423,9 357,4 41,5 14,9 40, , ,9 434,6 365, ,4 41, ,80-1, ,7 310,15 35,85 13,6 35,2 924,5 1, ,85 374,65 315, ,25 35,2 944,2 0-1, ,1 413,45 348,8 41,55 15,05 38, ,35 0 1, ,35 423,3 355,45 41,8 15,3 38, , ,68 174,4 371,4 316,55 32,95 11,35 28,1 934, ,68 146,3 314,85 268,05 28,6 10,85 24,4 793,05 5-CQ = ácido 5-cafeoilquínico; 4-CQ = ácido 5-cafeoilquínico; 3-CQ = ácido 3-cafeoilquínico, 3,4DQ = ácido 3,4-dicafeoilquínico; 3,5DQ = ácido 3,5-dicafeoilquínico; 4,5DQ = ácido 4,5-dicafeoilquínico Os modelos matemáticos gerados não apresentaram falta de ajuste (com 95% de confiança) já que os valores de p foram maiores que 0,05 e tiveram a regressão quadrática significativa já que os valores de p foram menores que 0,05. As variáveis A e B, individualmente, não apresentaram efeito significativo sobre a extração dos compostos. No entanto, a interação entre A e B, bem como a interação entre B e C foram significativas. A variável C foi a que apresentou maior efeito sobre a extração. Através do uso da ferramenta desenvolvida por Derringer e Suich (Derringer, 1980), foi possível realizar o estudo das condições ótimas de extração para todos os compostos simultaneamente atribuindo como critério de desejabilidade a obtenção do máximo da concentração de cada um dos compostos, com pesos iguais para todos os compostos. A melhor condição de extração encontrada foi agitação durante 22 minutos, empregando 14,9 ml de solução extratora contendo 32,5% de etanol. Na figura 1 está apresentado o cromatograma da condição ótima de extração.
4 A condição ótima foi testada quanto a precisão da extração (n=10) e recuperação em 3 níveis (n=3 para cada nível) onde apresentou resultados de coeficiente de variação menor que 10% para a precisão e recuperação entre 92 e 106%. mau DAD1 A, Sig=325,4 Ref=off (TAYSE\FAT D) 1 Area: Area: Area: Area: Area: Area: min Figura 1: Cromatograma das condições ótimas de extração de ácidos clorogênicos em café torrado e moído. Compostos 1: 3-CQ, 2: 4-CQ, 3: 5-CQ, 4: 3,4-DQ, 5: 3,5-DQ, 6: 4,5-DQ. 4. CONCLUSÃO A otimização das condições de extração utilizando um planejamento multivariado permitiu realizar o estudo com poucos experimentos e avaliar os efeitos das variáveis investigadas, o que permitiu encontrar um método simples, econômico, rápido e sem geração de resíduos tóxicos. A condição ótima de extração foi obtida utilizando 0,5 grama de amostra e 14,9 ml de solução extratora com 32,5% de etanol, seguido de agitação por 22 minutos à 60ºC. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. (2003). Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Resolução 899, de 29 de maio de 2003 (revoga a resolução RE 475, de 19 de março de 2002). Diário Oficial da República Federativa do Brasil. CARDOSO JÚNIOR, E. L.; FERRARESE- FILHO, O.; CARDOSO FILHO, L.;FERRARE, M. L. L.; DERRINGER, G.; SUICH, R. (1980). Simultaneous optimization of several response variables. Journal of Quality Technology, 12, 214. DONADUZZI, C. M.; STURION, J. A. (1999). Methylxanthines and phenolic compounds in mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) progenies grown in Brazil. Journal of Food Composition and Analysis, 20,
5 CLIFFORD, M.N. (1999). Chlorogenic acids and other cinnamates nature, occurrence and dietary burden. Journal of the Science of Food and Agriculture, 79, DUARTE, G.S.; FARAH, A. (2011). Effect of simultaneous consumption of milk and coffee on chlorogenic acids bioavailability in humans. Journal of agricultural and food chemistry, 59, FILIP, R. LOPÉZ, P.; GIBERTI, G.; COUSSIO, J.; FERRARO, G. (2001). Phenolic compounds in seven South American Ilex species. Fitoterapia, 72, LIU, R.H. (2003). Health benefits of fruit and vegetables are from additive and synergistic combinations of phytochemicals. American journal of clinical nutrition, 78, 517S-520S. MARQUES, V.; FARAH, A. (2009). Chlorogenic acids and related compounds in medicinal plants and infusions. Food Chemistry, 113, RIBANI, R.M. (2006). Compostos fenólicos em erva-mate e frutas (Tese de Doutorado). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), RICE-EVANS, C.A.; MILLER, N.J.; PAGANGA, G. (1997). Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends in plant science. 2(4), RISSO, E. M.; PERES, R. G., AMAYA-FARFAN, J. (2007). Determination of phenolic acids in coffee by micellar electrokinetic chromatography. Analytical, Nutritional and Clinical Methods. Food Chemistry, 105, SCALBERT, A.; MANACH, C.; MORAND, C.; REMESY, C. (2005). Dietary polyphenols and the prevention of diseases. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 45,
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