Influência da fonte de carbono e da temperatura sobre a fermentação lática desenvolvida por cultura mista de bactérias láticas 1

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1 Influência da fonte de carbono e da temperatura sobre a fermentação lática desenvolvida por cultura mista de bactérias láticas 1 Rosicler BALDUINO 2, Antonio Sérgio de OLIVEIRA 2, Maria Celia de Oliveira HAULY 2,* RESUMO Bactérias ácido láticas vêm sendo aplicadas em produtos cárneos como culturas iniciadoras. A finalidade das culturas iniciadoras em produtos cárneos é reduzir o ph no início da fermentação O que contribui na inibição de microrganismos indesejáveis, melhorar as propriedades sensoriais, reduzir o tempo de maturação e reduzir nitratos e nitritos. A composição do meio, assim como as condições de cultivo, são importantes para o bom desenvolvimento da cultura iniciadora, sendo necessário conhecer a influência da fonte de carbono e da temperatura no processo fermentativo. O objetivo deste trabalho foi

2 estudar os efeitos da temperatura e de diferentes concentrações de glicose e lactose sobre a fermentação lática desenvolvida em caldo MRS (Man-Rogosa-Sharpe) pela cultura mista constituída de L. curvatus, L. plantarum, P. acidilactici e E. faecium. O caldo MRS foi suplementado com glicose e lactose, e as temperaturas de fermentação foram de 28ºC, 37ºC e 46ºC. Os ensaios foram delineados por desenho fatorial incompleto de 3 3. Através da Superfície de Resposta, o modelo matemático mostrou que o caldo MRS suplementado de glicose 4,5% (m/v) e lactose 0,5% (m/v) e temperatura de incubação de 46ºC foram as condições mais adequadas para obtenção de ácido lático. A fermentação lática desenvolvida pela cultura mista, durante 48 horas nestas condições, forneceu em média 4,78% de ácido lático sendo a viabilidade celular de 1x10 15 UFC/mL. Palavras-chave: bactérias ácido láticas, fonte de carbono, temperatura, cultura iniciadora, produto cárneo. SUMMARY Influence of the carbon source and temperature on the lactic acid fermentation developed by starter cultures. Lactic acid bacteria has been used in meat products as starter culture. The purpose of the starter culture in meat products is to reduce the ph in

3 the begining of fermentation in order to inhibit undesirable microorganisms, to improve sensorial properties, to reduce the time of maturation and to reduce nitrates and nitrites. The composition of the medium as well as the culture conditions are essential for good growth of the starter culture, being of fundamental importance to know the influence of the carbon source and the temperature in the fermentative process. This work evaluated the influence of temperature and different concentrations of glicose and lactose on the lactic fermentation in MRS (Man-Rogosa- Sharpe) broth by a starter culture mixture containing L. curvatus, L. plantarum, P. acidilactici and E. faecium. This mixture shows potential application as starter culture in meat products. The MRS medium was supplemented with glicose and lactose and the various treatments submitted to temperatures of 28ºC, 37ºC and 46ºC, according to Surface Response Methodology through an incomplete fatorial of 3 3 experimental design. The evaluated response was the lactic acid produced, determined by HPLC. Mathematical models have showed that 4.5% glicose, 0.5% lactose and 46ºC were the best conditions for lactic acid production. The lactic acid fermentation, carried out by the mixed culture in 48 hours under these conditions, produced, in average, 4.78% of lactic acid and cellular viability of 1x10 15 CFU/mL.

4 Keywords: lactic acid bacteria, carbon source, temperature, starter culture, meat product. 1 INTRODUÇÃO As bactérias ácido láticas têm sido empregadas na indústria de produtos cárneos como culturas iniciadoras para acelerar o processo de maturação, visto que dominam o processo fermentativo fornecendo produtos com boa qualidade sanitária e características sensoriais adequadas [7]. As culturas iniciadoras podem produzir ácido lático logo no início da fermentação, o que diminui o valor de ph que pode inibir microrganismos indesejáveis como Salmonella spp., Yersínia enterocolítica, Escherichia coli enteropatogênica e Campylobacter jejuni, além de conferir o sabor ácido característico de produtos fermentados [14]. O ácido lático é muitas vezes utilizado como aditivo, nas formas de lactato de sódio ou potássio, sendo um agente acidulante e flavorizante [4]. Além disso, as bactérias ácido láticas, dependendo das condições de cultivo e da espécie, podem produzir substâncias antimicrobianas, como bacteriocinas [5, 8, 11], conferindo aos produtos maturados e frescais, melhor qualidade sanitária. Conforme descrito por TONI et al. [17] e ANJOS & RIBEIRO [1], a utilização de nitratos e nitritos em produtos cárneos para manter a cor vermelha e inibir o desenvolvimento de Clostridium botulinum pode levar à formação de nitrosaminas que são substâncias carcinogênicas. As bactérias ácido láticas podem atuar na redução destas substâncias até nitrogênio elementar [7], diminuindo assim a formação das nitrosaminas. As cepas utilizadas, as condições de cultivo e a formulação do

5 meio interferem no desenvolvimento da fermentação lática [2, 3, 12, 13]. Carboidratos fermentescíveis são por vezes adicionados à carne para diminuir rapidamente o valor de ph, sendo necessário conhecer a influência destes na fermentação desenvolvida pelas bactérias ácido láticas. Para o cultivo de Lactobacillus, normalmente se utiliza glicose ou sacarose como fontes de carbono. Entretanto, a lactose é igualmente adicionada como agente ligante da água para melhorar o processo de maturação e a textura de produtos cárneos fermentados [9, 16, 18]. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos das concentrações de glicose e lactose e das temperaturas de fermentação na produção de ácido lático pela cultura mista de L. curvatus, L. plantarum, P. acidilactici e E. faecium. 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Materiais Microrganismos Os microrganismos Lactobacillus plantarum e Pediococcus acidilactici foram obtidos da Fundação Tropical de Pesquisa e Tecnologia "André Tosello", Campinas SP. Lactobacillus curvatus foi isolado de silagem de milho por OLIVEIRA [10]. Enterococcus faecium foi isolado de embutido cárneo fermentado (salame) pela técnica de esgotamento em estrias em ágar MRS. O perfil bioquímico e idenficação a nível de espécie foi realizado pela Fundação Tropical de Pesquisa e Tecnologia "André Tosello", Campinas SP Meios de cultivo As culturas foram mantidas em leite em pó reconstituído em água na concentração de 11% (m/v).

6 caldo MRS (Man-Rogosa-Sharpe) foi suplementado com diferentes concentrações de glicose e lactose, conforme indicado pelo delineamento estatístico da Metodologia da Superfície de Resposta. 2.2 Métodos Processo fermentativo Os microrganismos foram ativados por meio de repiques sucessivos realizados a cada 24 horas em leite em pó reconstituído em água. As culturas de bactérias láticas L. curvatus, L. plantarum, P. acidilactici e E. faecium foram associadas na proporção de 1:1:1:1. O inóculo de 10% (v/v) foi transferido para o caldo MRS suplementado com glicose e lactose e incubado às temperaturas de 28ºC, 37 o C e 46ºC por 48 horas, sem agitação. O valor de ph inicial do meio foi ajustado para 6,2 com NaOH 1N. Após o desenvolvimento do processo fermentativo, o caldo fermentado foi centrifugado a 2000xg durante 10 minutos e submetido à determinação de ácido lático Viabilidade celular A viabilidade celular foi determinada através da técnica de semeadura em profundidade [6], utilizando-se ágar MRS. As placas foram mantidas em estufa a 37ºC durante 48 horas Dosagem de ácido lático O ácido lático foi extraído do caldo fermentado utilizando-se BaCl 2.2H 2 O 9,88%, NaOH 0,66N e ZnSO 4.7H 2 O, conforme SILVA [15]. O padrão utilizado para curva de referência foi o lactato de lítio 1% (m/v), extraído nas mesmas condições. Para determinação do ácido lático por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) utilizou-se uma coluna Aminex HPX - 87H (300mm x 7,8mm ), específica para análise de ácidos orgânicos e pré-coluna contendo a mesma resina de

7 exclusão iônica. A fase móvel constituída de H 2 SO 4 5x10-3 mol L -1 foi mantida sob o fluxo de 0,6mL min-1. A temperatura do sistema foi mantida a 35ºC e a pressão foi de 52mmHg. Para injeção no cromatógrafo, o extrato obtido conforme SILVA [15] foi filtrado em membrana Millipore 0,45 µm. O volume de injeção foi de 20µL. O comprimento de onda de 210nm foi utilizado para o detector UV-Vis. O padrão interno constituía-se de uma mistura de ácidos orgânicos, como ácido oxálico, acético, cítrico, málico, succínico e fórmico. Padrões de ácido lático nas concentrações de 2,08x10-2 mol L -1 ; 4,17x10-2 mol L -1 ; 6,25x10-2 mol L -1 foram utilizados na curva de referência para cálculo da concentração das amostras Metodologia da Superfície de Resposta. Para melhorar a produção de ácido lático pela cultura lática mista através da Metodologia da Superfície de Resposta, foram investigadas a temperatura de fermentação e duas fontes de carbono, glicose e lactose. As 3 variáveis independentes, temperatura, glicose e lactose, representados por X 1, X 2 e X 3, respectivamente, foram avaliadas em três níveis eqüidistantes de variação, através do desenho fatorial incompleto de 3 3. A resposta avaliada foi a produção de ácido lático, variável dependente. A Tabela 1 mostra as variáveis independentes e os níveis de variação.

8 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO A Tabela 2 mostra o delineamento estatístico utilizado e a produção de ácido lático pela cultura lática mista cultivada nas diferentes condições. O melhor resultado experimental, 3,55% de ácido lático foi obtido no tratamento nº 6: temperatura de 46ºC; 2,5% (m/v) de glicose e 0,5% (m/v) de lactose. A condição menos adequada para produção de ácido lático foi obtida no tratamento nº 9: temperatura de 37ºC, 0,5% (m/v) de glicose e 0,5% (m/v) de lactose. Os resultados estão de acordo com SAMOYLENKO et al. [13], que afirmou que a composição do meio de cultivo com relação à natureza química da fonte de carbono, bem como a concentração e a temperatura de fermentação, são importantes para a produção de ácido lático.

9 A Tabela 3 mostra os coeficientes de regressão para as respostas polinomiais ajustadas para a produção de ácido lático. Os resultados mostram que o intercepto foi significativo, ao nível de 0,01%, demonstrando que o ponto central foi escolhido adequadamente. O parâmetro estimado (0, ), relativo ao efeito linear da glicose, mostrou-se significativo ao nível de 0,01%, indicando a relevância desta variável na obtenção de ácido lático. Sugere-se utilizar o valor mais próximo do limite superior para a glicose, indicado na Tabela 1.

10 O parâmetro estimado para BC (Tabela 3) foi significativo ao nível de 0,02%. Portanto, sugere-se utilizar a mistura glicose e lactose como fontes de carbono para produção de ácido lático pela cultura lática mista. Na prática, a utilização de lactose pode diminuir o custo da fermentação, uma vez que pode ser utilizado o soro de leite, resíduo da indústria de laticínios, que

11 contém lactose. Entretanto, a Tabela 3 mostra que o parâmetro estimado, pelo modelo, para glicose e lactose (BC) foi negativo. Portanto, sugere-se usar lactose em baixa concentração, ou seja, a mais próxima possível do limite inferior, indicado na Tabela 1, em associação à glicose para boa produção de ácido lático. O uso da lactose em produtos cárneos maturados pode ser vantajoso, visto que auxilia na textura e serve como substrato para fermentação desenvolvida pelas culturas iniciadoras [9], além de diminuir os custos, já que faz parte da composição do soro de leite que é um resíduo agroindustrial. O parâmetro estimado para AB (Tabela 3) foi significativo ao nível de 3,8% indicando que o uso da temperatura no valor mais próximo do limite superior mostrado na Tabela 1, associada a mais alta concentração de glicose, poderá melhorar a produção de ácido lático. A análise de variância dos resultados da fermentação lática desenvolvida pela cultura lática mista está indicada na Tabela 4. Para a resposta avaliada, ácido lático em %, observa-se que a regressão não foi significativa a nível de 5%. A falta de ajuste também não foi significativa, o que permite a utilização do modelo matemático, equação de regressão fornecida pela Metodologia da Superfície de Resposta.

12 O modelo matemático indica que para melhor produção de ácido lático pela cultura lática mista, a fermentação deve ser realizada utilizando-se valores máximos para temperatura e concentração de glicose e o mínimo de lactose ou seja, 46ºC; glicose 4,5% (m/v) e lactose 0,5% (m/v). A fermentação lática desenvolvida nestas condições produziu, em média, 4,78% de ácido lático, indicando que o modelo foi adequado. A viabilidade celular é um parâmetro importante quando se pretende utilizar a cultura lática como cultura iniciadora. Nas condições indicadas pelo modelo matemático, obteve-se 1x10 15 UFC/mL demonstrando o potencial de aplicação da cultura lática mista como cultura iniciadora. A Figura 1 mostra o mapa da Superfície de Resposta obtido pela equação do modelo ajustado, fixando-se a variável X 3 no nível 1, correspondente a lactose 0,5% (m/v). Observa-se na Figura 1 que alto teor de ácido lático (> 4,8%), pode ser

13 obtido utilizando-se glicose (X 2 ) e temperatura (X 1 ) nos níveis máximos, ou seja, glicose 4,5% (m/v) e 46 ºC. 4 CONCLUSÃO O modelo matemático obtido pela Metodologia da Superfície de Resposta indicou que a temperatura de 46ºC, glicose 4,5% (m/v) e lactose 0,5% (m/v) são as condições mais adequadas para produção de ácido lático pela cultura lática mista em caldo MRS, durante 48 horas. A fermentação realizada nestas condições produziu 4,78% de ácido lático mostrando que o modelo foi adequado para estimar a produção de ácido lático. A

14 viabilidade celular,sob estas condições, foi de 1x10 15 UFC/mL. 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] ANJOS, A. C.; RIBEIRO, P. O Nitrito em Carnes Curadas: Vantagens, Desvantagens e Recursos Tecnológicos para Reduzir os Níveis de Nitrosaminas no Bacon. Higiene Alimentar, v. 8, n. 29, p. 8-13, fev [2] CHAGAS, S. S.; TERRA, N. N.; VALENTE, C. R.; COSTA, C. M. Influência dos Microelementos Manganês e Magnésio na Estimulação da Fermentação Cárnea. Revista Nacional da Carne, n. 251, p , jan., [3] COVENTRY, J.; HICKEY, M. W. Growth Characteristics of Meat Starter Cultures. Meat Science, v. 30, p , [4] DAVIDSON, P. M.; JUNEJA, V. K. Antimicrobial Agents. In: BRANEN, A. L.; DAVIDSON, P. M.; SALMINEN, S. Food Additives. New York: Marcel Dekker, Cap. 4, p [5] HURST, A.; HOOVER, D. G. Nisin. In: DAVIDSON, P. M.; BRANEN, A. L. Antimicrobials in Foods. 2. ed. New York: Marcel Dekker, Cap. 10, p [6] LANARA (Laboratório Nacional de Referência Animal). Métodos Analíticos Oficiais para Controle de Produtos de Origem Animal e seus Ingredientes. Brasília:Mistério da Agricultura,1981. v. 1, Métodos Microbiológicos. [7] LIEPE, H-U. Starter Cultures in Meat Production. In: REHM, H. J.; REED, G. Biotechnology. Flórida: Verlagchemie, v. 5. Cap. 8, p [8] MARTINIS, E. C. P.; FRANCO, B. D. G. M. Inhibition of Foodborne Pathogens by Bacteriocin-Producing Leuconostoc sp and Lactobacillus sake Isolated from "Lingüiça Frescal". Revista de Microbiologia, v. 28, p , 1997.

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