AVALIAÇÃO DE DIFERENTES MEIOS DE CULTIVO NO CRESCIMENTO CELULAR DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS

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1 AVALIAÇÃO DE DIFERENTES MEIOS DE CULTIVO NO CRESCIMENTO CELULAR DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS F.W. Bordini 1, M.D.R. Rosolen 2, T. G. Silva, 3 W.P. Silva 4, A. M. Fiorentini 5, S. Pieniz 6 1- Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Pelotas CEP: Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) (fernandawbordini@gmail.com) 2- Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Pelotas CEP: Pelotas -RS Brasil, Telefone: 55 (53) (michele.dutra@gmail.com) 3 - Departamento de Nutrição Universidade Federal de Pelotas CEP: Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) (ta.ici@hotmail.com) 4 Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Pelotas CEP: Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) (wladimir.padilha2011@gmail.com) 5 Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Pelotas CEP: Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) (angelafiore@gmail.com) 6 - Departamento de Nutrição Universidade Federal de Pelotas CEP: Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) (nutrisimone@yahoo.com.br) RESUMO Bactérias ácido lácticas (BAL) fazem parte de um grupo considerado geralmente seguros para o uso, dentre elas estão o Lactococcus lactis subsp. lactis e o Pediococcus pentosaceus. Para conhecer o metabolismo e comportamento de ambos a construção da curva de crescimento é necessária. Para isto diferentes meios de cultivo alternativos vêm sendo testados, como por exemplo, o soro de queijo. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi construir a curva de crescimento de Lactococcus lactis subsp. lactis e o Pediococcus pentosaceus em dois meios de cultivo distintos, Man Rogosa and Sharp (MRS) e soro de queijo. Por meio dos resultados obtidos observou-se que o soro de queijo proporcionou um aumento de 2 Log no número de células viáveis de ambos microorganismos quando comparados ao meio de cultivo MRS. Conclui-se que meios alternativos podem ser uma boa escolha tanto para o crescimento bacteriano, como para a reutilização de subprodutos da indústria. ABSTRACT Lactic acid bacteria (LAB) are part of a group considered generally safe for use, among them are Lactococcus lactis subsp. lactis and Pediococcus pentosaceus. To know the metabolism and behavior of both the growth curve construction is necessary. For this, different alternative culture media have been tested, such as whey cheese. Thus, the objective of this work was to construct the growth curve of Lactococcus lactis subsp. lactis and Pediococcus pentosaceus in two distinct culture media, Man Rogosa and Sharp (MRS) and cheese serum. By means of the results obtained it was observed that the cheese serum provided a 2 Log increase in the number of viable cells of both microorganisms when compared to the MRS culture medium. We conclude that alternative media may be a good choice for both bacterial growth and reuse of by-products in the industry. PALAVRAS-CHAVE: Pediococcus pentosaceus; Lactococcus lactis subsp. lactis; soro de queijo; KEYWORDS: Pediococcus pentosaceus; Lactococcus lactis subsp. lactis; whey cheese;

2 1. INTRODUÇÃO Bactérias ácido lácticas (BAL) fazem parte de um grupo de bactérias consideradas Gram postiva, catalase negativa, podem ter formato de cocos ou bacilos, e são geralmente seguros para o uso (Lopes, 2008; Sá, 2017). Algumas possuem características probióticas, ou seja, quando administradas em quantidade suficiente são capazes de colonizar o intestino, agregando benefícios ao seu hospedeiro (FDA, 2002). Fermentam açúcares, podendo ser heterofermentativa ou homofermentaviva e seu principal produto é o ácido láctico, originado na degradação de carboidratos. A indústria de alimentos utiliza algumas estirpes de BAL para fermentação de diversos produtos, principalmente de origem láctea, visto que muitas são isoladas de alimentos com este carácter, o que facilita sua aplicação nos mesmos (SIRO, 2008). Seu uso agrega características ao alimento, como sabor, aroma, cor e aspecto visual. Dentro deste grupo encontram-se o Lactococcus lactis subsp. lactis e o Pediococcus pentosaceus (FAO, 2002; Pereira, 2012). Para o conhecimento do metabolismo dos micro-organismos, a construção de sua curva de crescimento se faz necessária. Nesta é possível identificar as fases de adaptação ao meio de cultura; fase exponencial, onde as células estão se multiplicando rapidamente; fase estacionária em que o número de células em multiplicação e apoptose são iguais; e por fim a fase de morte celular. Estes dados são importantes para, por exemplo, a produção de compostos bioativos, pois conhecendo sobre o mesmo é possível determinar o tempo de cultivo adequado para avaliar o melhor nível de produção (Eckert, 2016; Tortora, 2016). Para o cultivo de micro-organismos existem meios comerciais adequados para cada grupo, no caso das BAL, o meio de cultivo comumente utilizado é o Man Rogosa and Sharp (MRS) (Lourens-Hattingh & Viljoen, 2001; Pereira, 2012). Porém, há estudos utilizando diferentes fontes alternativas para o cultivo de tais bactérias, como soro de leite, melaço de cana de açúcar, entre outros, avaliando a otimização do crescimento celular em tempo e viabilidade (Oliveira, 2000; Panesar, 2010; Hauly, 2003). O soro de queijo é um subproduto da indústria de lacticínios, para produzir 1 kg de queijo, sobram 9 litros de soro, gerando uma grande quantidade de subproduto, a qual as indústrias precisam reaproveitar ou gerenciar, visto que é altamente poluente, pois necessita de grande oxigenação (Machado, 2002). Este soro retém cerca de 55% dos nutrientes do leite, sendo os principais componentes as proteínas solúveis, lactose e lipídios. A lactose é responsável pela maior demanda de oxigênio do soro, e altamente utilizada pelas BAL para fermentação e produção de ácido láctico. A disponibilidade destes nutrientes se torna propicio para o desenvolvimento das BAL, fornecendo componentes necessários para o metabolismo microbiano e a produção de compostos (Panesar, 2010; Taleghani, 2016). De acordo com o exposto acima, o objetivo deste estudo foi construir a curva de crescimento de Lactococcus lactis subsp. lactis e Pediococcus pentosaceus em dois meios de cultivo distintos. 2. MATERIAL E MÉTODOS Os micro-organismos utilizados neste estudo foram Lactococcus lactis subsp. lactis e Pediococcus pentosaceus, os quais fazem parte do acervo de BAL isoladas de queijo ricota e presunto

3 cozido comercial, respectivamente, estando sob responsabilidade do Laboratório de Nutrifisiogênomica da Faculdade de Nutrição UFPel e do laboratório de Microbiologia do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos -UFPel, respectivamente. Ambas foram mantidas congeladas em ultrafrezer a -80 ºC com 20% de glicerol. No momento do uso foram inoculadas em caldo MRS, à 37 ºC por 24 horas, à 120 rpm. Posteriormente estriadas até esgotamento em ágar MRS, para obtenção de culturas puras. O soro de queijo comercial (RELAT laticínios) foi reconstituído a 6% em água destilada estéril, e após homogeneização foi pasteurizado a 66 ºC por 30 minutos, a fim de eliminar quaisquer interferentes. O MRS foi preparado de acordo com o rótulo do fabricante (KASVI). Para realizar o estudo foi utilizada a metodologia de Eckert (2016), com algumas modificações. Ambos micro-organismos foram reativados em soro de queijo e caldo MRS em banho a 37 ºC com agitação de 120 rpm por 24 horas. No terceiro dia foi adicionada uma concentração de 3% deste inóculo reativado em 50 ml de soro de queijo e de MRS. Nos tempos 0, 2, 4, 6, 9, 12 e 24 horas, alíquotas foram coletadas, diluídas em série em peptona bacteriológica 0,1%, plaqueadas em ágar MRS e, então, incubadas sob anaerobiose por 48 horas a 37 ºC. As contagens foram determinadas por meio da multiplicação do número de colônias pelo inverso da diluição, sendo o resultado expresso em Log UFC. Os resultados das análises de todos os experimentos foram calculados a partir da média de experimentos independentes. Os dados foram analisados utilizando a análise de variância (ANOVA) com auxílio do programa GraphPad Prism 7.0, tomando como base os níveis de significância maiores que 95% (p< 0,05). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Embora os dois micro-organismos em estudo pertençam ao mesmo grupo (BAL), estes possuem comportamento distintos quanto as fases de crescimento, como pode-se observar na Figura 1. Em relação ao delineamento das fases, tanto em soro de queijo quanto em caldo MRS, o Lactococcus lactis subsp. lactis (b) apresenta as fases melhor delimitadas, sendo possível observar o início e o fim de cada fase, diferentemente do Pediococcus pentosaceus (a). Quanto a fase de adaptação ao meio de cultura, Lactococcus lactis subsp. lactis (b) demonstrou necessidade de um tempo maior em relação ao Pediococcus pentosaceus (a), porém apesar de ambos atingirem seu pico exponencial em 12 horas, o Lactococcus lactis subsp. lactis se multiplica de forma mais rápida, se analisado o tempo desta fase exponencial. Quando comparados ambos os micro-organismos em relação aos dois meios de cultivos testados, de modo geral, se percebe um padrão semelhante de crescimento, porém em soro de queijo o número de células viáveis apresentou um aumento de 2 log UFC.mL 1 para ambos, o que em termos de estudo e da própria indústria de alimentos é favorável, já que o número de células está diretamente ligada a produção dos compostos desejados, sejam eles compostos majoritários como o ácido láctico ou compostos bioativos que são produzidos em menor escala.

4 Figura 1: Curva de crescimento de Pediococcus pentosaceus (a) e Lactococcus lactis subsp. lactis (b) em MRS e soro de queijo. Este aumento da viabilidade celular em soro de queijo quando comparado ao MRS em ambos micro-organismos pode ser explicado devido a sua natureza láctea, onde o cultivo em soro de queijo não alteraria bruscamente o seu habitat natural e forneceria, de forma natural, os compostos necessários para sua multiplicação. Abreu (2014) avaliou o potencial bioativo de soro de queijo após fermentação láctica, o crescimento de algumas BAL e evolução do ph, incluindo o Lactococcus lactis em três diferentes soros de queijos, produzidos com leite de vaca ou de cabra ou de ovelha, no qual um dos resultados encontrados foi concentrações de 10 8 UFC.mL -1. Outro estudo avaliou a influência da concentração de soro, de frutooligossacarídeos (FOS) e de açúcar no crescimento de Streptococcus thermophilus e concluíram que quanto maior a concentração de soro e FOS, melhor foi o crescimento, porém as diferentes concentrações de açúcar não interferiam no crescimento (Thamer; Penna, 2005). O crescimento de Pediococcus pentosaceus em caldo MRS e melaço de cana-de-açúcar puro e com adição de outros substratos, foi avaliado por Angel (1999), o qual encontrou como resultado um número de células viáveis maior em caldo MRS, quando comparado ao caldo de cana-de-açúcar puro. Isolados bacterianos, apesar da semelhança e de serem categorizados como similares, podem apresentar comportamentos distintos, devido as condições onde cada isolado é encontrado, dentre elas temperatura, substrato, clima, ambiente, entre outros fatores. 4.CONCLUSÃO A partir do exposto é possível concluir que o soro de queijo teve efeito positivo no crescimento destas duas BAL, quando comparada ao meio de cultivo comercial MRS. Isto pode ocorrer devido a sua origem láctea, com características favoráveis a bactérias pertencentes a este grupo, fornecendo substratos que promovem seu melhor crescimento e desenvolvimento. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

5 Abreu, M. C. de. (2014). O potencial bioativo do soro de queijo após fermentação lática.(dissertação de mestrado). Universidade de Lisboa, Lisboa. Eckert, C. (2016) Bactérias láticas: avaliação da resistência ao trato gastrintestinal simulado e encapsulamento com soros lácteos.(dissertação de mestrado). Centro Universitário Univates, Lajeado. FAO/WHO (Food and Agriculture Organization/World Health Organization). Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. Londres, Ontario, Canada: FAO/WHO, p. Hauly, M. C. de O., Oliveira, A. R. de., Oliveira, A. S. de. (2003) Produção de ácido lático por Lactobacillus curvatus em melaço de cana-de-açúcar. Semina: Ciências Agrárias, 24(1), Lourens-Hattingh, A.; Viljoen,B.C. (2001) Yogurt as probiotic carrier food. International. Dairy Journal. 11(1), Machado, R.M.G; Freire, V.H.; Silva, P.C.; Figueiredo, D.V.; Ferreira, P.E. Controle ambiental nas pequenas e médias indústrias de laticínios. Projeto Minas ambiente. SEGRAC, p.223, Oliveira, A.R., Buzato, J. B., Oliveira, A. S., Hauly, M. C. O. (2000) Produção de ácido lático por Lactobacillus curvatus, em fermentação contínua, utilizando melaço de cana-de-açúcar previamente tratado com invertase. UNOPAR Científica. Ciências Biológicas e da Saúde. 2(1), Panesar, P. S., Kennedy, J. F., Knill, C. J., Kosseva, M. (2010). Production of L(+) Lactic Acid using Lactobacillus casei from Whey. Brazilian Archives of Biology and Technology, 53(1), Pereira, S. P. (2012). Seleção de meio de cultura para determinação da viabilidade de bifidobactérias durante a vida de prateleira de bebida láctea fermentada com soro de leite nanofiltrado. (Dissertação de Mestrado). Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte. Sá, S. A. C. A., Júnior, S. P. O., Dores, M. T., Visôtto, L. E., Silva, C. R. (2017) Avaliação das condições de aeração do pré- inóculo utilizado no cultivo de bactérias ácido láticas (BAL) em meio líquido. The Journal of Engineering and Exact Sciences JCEC, 3(6), Thamer, K. G., Penna, A. L. B., (2005). Efeito do teor de soro, açúcar e de frutooligossacarídeos sobre a população de bactérias lácticas probióticas em bebidas fermentadas. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, 41(3), Taleghani, H. G., Najafpour, G. D., Ghoreyshi, A. A. (2016) A study on the effect of parameters on lactic acid production from whey. Polish Journal of Chemical Technology, 18(1), Tortora, G. J., Funke, B. R., Case, C. L. (2016). Microbiologia (12.ed.). Artmed. Villavencio, A. R. N., Sant Anna, E. S., Tôrres, R. C. O. (1999) Produção de Lactobacillus plantarum em Melaço de Cana-de-açúcar. Brazilian Archives of Biology and Technology, 42(2).