Ligação de O 2 a Mioglobina e a Hemoglobina

Transcrição

1 Ligação de O 2 a Mioglobina e a Hemoglobina

2 A Mioglobina possui 1 sítio de ligação para o O 2 ** 8 α-helical segments ** contains one heme ** MW 16,700 ** Single O 2 binding site ** reversible protein-ligand interaction ** Oxygen storage

3 A Hemoglobina possui 4 sítios de ligação ao O 2 - Estrutura Quaternária 2 unidades α e 2 unidades β -Interação forte entre as subunidades α e β.

4 A Comparison of The Structure of Myoglobin and The β-subunit of Hemoglobin

5 1. Reversible Binding of Proteins to a Ligand: Oxygen Binding Proteins Heme : contain iron. Anéis pirrólicos Porfirina Protophorphyrin IX

6 A Histidina 93 coordena com o Ferro e auxilia a sua ligação ao O 2 Distal histidine Fe 2+ (His 93 ) Proximal histidine

7 O grupo heme visto de lado Coordination bond Molecular oxygen Globin molecule

8 Brahimi-Horn, M. C. & Pouysségur, J. (2007) Oxygen, a source of life and stress. FEBS Letters 581, Fig. 1. Physiological and pathophysiological oxygen partial pressures (po2). The po2 of inspired air drops progressively as oxygen passes from the lungs into the circulation, which irrigates the tissues of major organs, and then in the venous system before re-oxygenation in the lungs. The po2 of solid tumours (insert) is generally low compared to that of non-malignant tissues.

9 Ligação de O 2 à Mioglobina Tecidos Pulmão

10 A ligação de O 2 altera a conformação das subunidades da hemoglobina TENSO DEOXI-Hb RELAXADO OXI-Hb

11 Ligação de O 2 a Hemoglobina R T

12 O grupo Heme em seu ambiente na cadeia da Hb humana sem Ligante

13 A ligação de O 2 altera a conformação local da cadeia peptídica... Azul forma T Rosa forma R

14 .resultando na alteração da conformação total do tetrâmero Fig. 5-10

15 Cooperatividade entre as subunidades resulta numa curva de ligação de O 2 sigmoidal R-state DesoxiHb (T) capta O 2 no pulmão, convertendo-se para o estado R, o qual por sua vez, capta mais O 2 T-state OxiHb (R) volta aos tecidos onde a pressão de O 2 é baixa e inicia a liberação de O 2, promovendo a conversão da Hb em desoxihb (T)

16 2,3-BisFosfoGlicerato (BFG) liga-se a Hb reduzindo a sua afinidade por O 2 Hb pura libera apenas 8 % do O 2 Hb + 2,3-BFG libera 66 % do O 2 2,3-BFG é um efetor alostérico (allos=outro; stereo=estrutura) 2,3-BFG estabiliza a estrutura T (desoxi) da Hb

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18 Efeito do ph na ligação da Hb ao O 2 (Efeito Bohr, Christian Bohr 1904) A diminuição do ph afeta a ionização de Histidinas... No ph menor a His 146 está protonada, estabilizando a estrutura T da Hb A diminuição do ph aumenta a liberação de O 2 nos tecidos

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21 Endergônico Exergônico

22 Vias Metabólicas Séries de reações consecutivas catalisadas enzimaticamente, que produzem produtos específicos (metabólitos). Note que: as vias são interconectadas Pontos importantes: (pontos de cruzamento). - conhecer as principais avenidas (vias), - os cruzamentos mais importantes (intermediários comuns) e - como o fluxo nessas vias são controladas (regulação)...

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24 Visão Geral do Catabolismo

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26 1. Introdução: Enzimas 1. Duas condições fundamentais para a vida : (1) capacidade de se autoreplicar (2) capacidade de catalisar reações químicas eficiente e seletivamente Ex. : Açúcar pode ser estocado por anos, mas no organismo ele libera energia química em segundos catálise Energia 2. Catalisadores em sistema biológico: AS ENZIMAS..Proteínas altamente especializadas que possuem eficiência catalítica extraordinária alto grau de especificidade aceleram as reações químicas

27 Enzimas são catalisadores extraordinários e altamente específicos!

28 A maior parte da História da Bioquímica coincide com a História das Enzimas 1850 Louis Pasteur..Fermentação em células vivas ( força vital, vitalismo) 1878 Fredrich Wilhelm Kuhne Enzima (en=no e zyme=levedura) 1897 Eduard Buchner Extrato de levedura livre de células capaz de realizar a fermentação 1894 Emil Fischer Hipótese chave-fechadura 1926 James Sumner. Cristalização da Urease do Feijão Preto Demonstrou que enzimas são proteinas J.B.S. Haldane Interações Enzima-Substrato (Escreveu um tratado sobre Enzimas)

29 Atividade catalítica depende da conformação proteica Se a Enzima é desnaturada ou dissociada em subunidades ela perde a atividade catalítica!! Glucose

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37 Isomerização: aldose cetose

38 Enzima alostérica

39 Clivagem da frutose 1,6-bifosfato

40 Grupo Prostético - Componente químico adicional requerido por certas enzimas - Estão firmemente ligados às enzimas Cofatores : compostos inorgânicos Fe 2+, Mg 2+, Mn 2+, Zn 2+ Coenzimas : compostos orgânicos. Normalmente derivado de vitaminas Holoenzima = Apoenzima (porção proteica) + coenzima ou cofator

41 Cofatores : compostos inorgânicos (Fe 2+, Mg 2+, Mn 2+, Zn 2+ ) Coenzimas : compostos orgânicos. (Normalmente derivado de vitaminas)

42 Classificação São classificadas de acordo com o tipo de reação que catalisam Código para Enzimas : EC ATP glicose fosfotransferase Classe Transferase Subclasse Fosfotransferase

43 2. Como as enzimas trabalham? A função termodinâmica denominada de energia livre (G) é importante para compreender como as enzimas trabalham. Parâmetros termodinâmicos que deve-se considerar: 1) A variação de energia livre ( G) entre produtos e reagentes 2) A energia necessária (energia de ativação) para iniciar a conversão dos reagentes em produtos G: indica a espontaneidade da reação Energia de ativação: determina a velocidade da reação As enzimas afeta apenas a energia de ativação!

44 Sob condições de temperatura e pressão constantes... ΔG = ΔH -TΔS ΔH - que reflete os tipos e o número de ligações químicas e interações não-covalentes quebrados e formados ΔS que reflete a variação da desordem do sistema

45 ΔG = ΔH -TΔS ΔG<0 (negativo) : Reações espontâneas > produtos têm menos energia livre que os reagentes, a qual pode ser utilizada para realizar trabalho são reações exergônicas. ΔG >0 (positivo): Pecisam que seja fornecida energia são reações endergônicas.

46 ΔG o negativo ΔG o positivo G reagentes > G produtos Reação ocorre espontaneamente sob condições padrão. G reagentes < G produtos Reação ocorre no sentido reverso, caso seja iniciada com a concentração 1 M (condições padrão) Lembrem-se todas as reações químicas tendem a ocorrer no sentido que resulta na diminuição de energia livre do sistema.

47 Energia Livre de Ativação

48 No interior das células as reações químicas ocorrem devido à presença de enzimas Enzimas: catalisadores capazes de aumentar enormemente a velocidade de reações químicas específicas sem serem consumidos no processo. Elas dimimuem a energia de ativação. Energia de ativação (ΔG*): energia extra necessária para que a reação ocorra.

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50 Enzimas afetam a velocidade mas não o equilíbrio químico Reação Química : S P 1. Catalisador não afeta a posição e nem a direção do equilíbrio 2. Um equilíbrio favorável não significa que a conversão de S P ocorra em uma velocidade mensurável 3. A velocidade depende da Energia de Ativação: energia necessária para o alinhamento dos grupos químicos reagentes, formação de cargas transientes, rearranjos de ligações e outras transformações necessária para que a reação ocorra em uma das direções

51 O equilíbrio da reação está relacionado à variação de energia livre padrão Um grande valor negativo de ΔG o indica um equilíbrio de reação favorável á formação dos produtos, mas não significa que ela ocorra a uma velocidade considerável.

52 2. Como as enzimas trabalham? As enzimas fornecem um ambiente específico (SÍTIO ATIVO) onde uma dada reação é energeticamente mais fovorável. SÍTIO ATIVO SUBSTRATO (ligante) Tamanho: Enzima >>> Substrato Quimotripsina

53 Enzimas afetam a velocidade mas não o equilíbrio químico Estado de transição Reação Química : S P Energia de Ativação Variação de Energia Livre Padrão Bioquímico Estado Fundamental Ponto de Partida para a reação de ida ou de volta.

54 Enzimas aceleram a velocidade da reação diminuindo a energia de ativação (A enzima não é gasta no processo e não afeta o ponto de equilíbrio) E + S ES EP E + P ENERGIA DE ATIVAÇÃO

55 Complexo Enzima Substrato Formas complementares de um Substrato e seu Sítio Ativo (Chave-Fechadura, Emil Fischer) Diidrofolato Redutase NADP + liga-se a uma cavidade complementar à sua forma e propriedades iônicas. NADP + Tetraidrofolato Conceito chave-fechadura sugere um encaixe perfeito entre E e S. O que resultaria numa enzima pouco eficiente!!

56 Enzima imaginária ( bastonase ) projetada para catalisar a quebra de um bastão de metal Modelo Chave-Fechadura A cavidade complementar ao substrato estabiliza-o mas não o quebra. O substrato estabiliza o estado de transição do complexo ES, diminuindo a energia de ativação. Algumas interações fracas são formadas no complexo ES, mas a totalidade das interações fracas é estabelecida apenas no estado de transição.

57 O papel da energia de ligação para a catálise 1. A energia de ligação confere especificidade e catálise. 2. E + S ES: A interações fracas formadas entre E e S fornecem a maior parte da energia necessária para a catálise. Energia de ligação

58 3. Cinética Enzimática Estuda o mecanismo de reações catalisadas enzimaticamente através do estudo da velocidade da reação enzimática e como ela se altera em função de mudanças nos parâmetros experimentais

59 1913: Teoria geral da ação das enzimas 1 2 E + S ES E + P 1. Inicialmente a enzima se combina reversivelmente com o substrato para formar o complexo ES, um passo relativamente rápido;

60 A concentração do substrato afeta a velocidade das reações catalisadas enzimaticamente E + S ES E + P Enzima está saturada com S (todas as enzimas econtramse complexadas com o substrato) 1. Velocidade Inicial ( V 0 ) : velocidade no tempo inicial quando a [S] >>> [E] 2. Velocidade máxima ( V max ) : ponto em que não ocorre variações em V 0 com o aumento da [S]. [S] << [E]: Grande quantidade de enzimas livres.

61 Equação de Michaelis-Menten Equação que relaciona [S] e a Vmax de forma quantitativa. Michaelis-Mentem derivaram a reação partindo da hipótese de que o passo limitante da reação é a quebra do complexo ES. E + S ES E + P 1. E + S ES reversível e relativamente rápida 2. ES E + P, Quebra do complexo ES é LENTA! 3. Velocidade total é dependente da [ES] 4. Quando [S] a maioria de E está na forma livre mas quando [S], a maoria de E está complexada.. Enzima está saturada Onde: V o : velocidade no tempo inicial quando a [S] >>> [E] V max : V máximo [S]: concentração do substrato K m : constante de Michaelis

62 Significado do K m K M = [S] quando v o = 1/2 Vmax. Em geral, quanto menor o K M, mais forte é ligação do substrato pela enzima. K M é usado como uma medida da afinidade da enzima pelo substrato

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64 Transformação da equação de Michaelis e Mentem Gráfico do Duplo-Recíproco (Equação de Lineweaver- Burk)

65 Enzimas estão sujeitas à inibição 1. Importância Farmacêutica do estudo da inibição enzimática Inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem na catálise, diminuindo ou acelerando a velocidade da reação esse é o mecanismo de ação da grande maioria de agentes farmacêuticos. Ex. : Aspirina Inibidor da síntese de Prostaglandinas Antiinflamatório 2. Classificação: 1) Inibição Reversível: Inibição Competitiva Inibição Não-Competitiva

66 As especificidades das fosfolipases

67 Arachidonic acid an some eicosanoid derivatives (response to hormonal signals)

68 Aspirin, acetaminophen,... Inhibiting the enzyme cyclooxygenase

69 Inibição competitiva

70 Inibição competitiva (I liga-se somente a E) Cinética na presença de [I] cresce Ki: constante de dissociação do inibidor Ki=[E][I]/[EI] Qto < Ki, mais potente é a inibição. 1. Vmax não se altera

71 1 K M (1 + I/K i ) = x v V M S V M K M aumenta; V max igual

72 Inibição competitiva Exemplo: Intoxicação por Metanol Desidrogenase alcoolica converte metanol em formaldeído (tóxico!) que pode resultar em cegueira. Tratamento: ETANOL O etanol compete com o metanol pelo sítio ativo da enzima

73 Inibição Não-Competitiva Inibidor liga-se a enzima em um sítio diferente a do sítio ativo do substrato.

74 Inibição Não-Competitiva (I liga-se a E ou ES) 1. Vmax diminui

75 1 K M = x v V M / (1 + I/K i ) S V M / (1 + I/K i ) K M igual; V max diminui

76 Inibição Irreversível Inibidores irreversíveis combinam-se com um grupo funcional na molécula da enzima ou o destroem ou ainda formam uma associação covalente bastante estável. São úteis como ferramentas no estudo de mecanismo de reação, principalmente para a identificação de aminoácidos importantes para a catálise no sítio ativo. Quimotripsina Diisopropylfluorophosphate Forma permanentemente inativa

77 5. Enzimas Alostéricas Enzimas reguladas pela ligação não-covalente de compostos reguladores chamados, moduladores alostéricos. A regulação enzimática envolve alterações conformacionais similares a da Hemoglobina

78 Enzimas Regulatórias

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80 5. Enzimas Alostéricas São proteínas compostas de subunidades (Estrutura Quaternária) e exibe cooperatividade Possuem sítios distintos de ligação: Sítio regulatório e sítio catalítico (ativo). Sítio regulatório localiza-se em um sítio distinto do sítio ativo. Esses sítios podem estar localizados em uma mesma subunidade ou em subunidades distintas.

81 5. Enzimas Alostéricas Em muitas enzimas alostéricas o sítio de ligação do substrato e o(s) sítio(s) de ligação do substrato estão em subunidades diferentes. O modulador pode ser Estimulatório ou Inibitório Ligação do modulador causa MUDANÇAS na CONFORMAÇÃO.

82 5. Enzimas Alostéricas As propriedades cinéticas das enzimas alostéricas divergem do comportamento de Michaelis-Mentem 1. As enzimas alostéricas apresentam relações entre V o e S que diferem da cinética de Michaelis-Menten. 2. Curva sigmoidal em vez de hiperbólica. 3. Ao invés de K m tem-se um K 0,5

83 5. Enzimas Alostéricas Efeitos de um modulador positivo e negativo sobre a enzima alostérica Positive modulator Negative modulator

84 Glicólise

85 Exemplo de enzima alostérica Fosfofrutoquinase Tetrâmero Substratos F6P ATP Efetores Alostéricos PEP, ATP (negativo) ADP (positivo) Sítio Ativo ADP Monômero

86 5. Enzimas Alostéricas Fosfofrutoquinase é regulada alostericamente por ATP Modulador negativo

87 Regulação Alostérica Lembrar dos estados T e R da Hemoglobina Inibidores alostéricos favorecem o estado T (menor afinidade) Ativadores alostéricos favorecem o estado R (maior afinidade)

88 2 modelos de Cooperatividade Concerted Symmetry driven- all R or All T. Substrate stabilizes R. Sequential Ligand induced neighboring unoccupied subunits are variably affected

89 Modificação Covalente

90 Glicogênio fosforilase

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92 Atividade de uma enzima Habilidade catalítica em converter S em P. Medida: Unidades de Atividade. 1U=1µmole produto/min. (em condições ótimas) Atividade específica: atividade enzimática quantidade de enzimas Expresso em: unidades/mg proteína

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94 Catálise Enzimática A catálise é um processo que aumenta a velocidade com o qual a reação chega ao equilíbrio. Duas propriedades importantes para a catálise: 1. Especificidade pela ligação ao substrato 2. Organização otimizada dos grupos catalíticos

95 Mecanismos de catálise 1) Catálise ácido-base 2) Catálise Covalente 3) Catálise por Íons Metálicos

96 Catálise ácido-base A reação não-catalisada ocorre lentamente devido à alta energia do estado de transição. Na catálise ácida-geral, a transferência de um próton, diminui a energia do estado de transição. Na catálise básica-geral, a abstração de um próton por uma base, ajuda a estabilizar o estado de transição.

97 N NH Não-ionizado" Catalisador Básico" (proton 'sink')" +H -H N H NH Ionizado" Catalisador ácido" (proton source)"

98 Reação não-catalisada Formação de um carbânion no estado de transição

99 Reação não-catalisada Catálise ácida (transferência de prótons para o estado de transição) A doação de um próton ao átomo de oxigênio, reduz o caráter de carbânion do estado de transição, diminuindo a energia de ativação e acelerando a reação.

100 Reação não-catalisada Catálise básica (remoção de prótons por uma Base) A remoção parcial de um próton por uma base diminui a energia do estado de transição. Algumas reações são simultaneamente sujeitas a catálise ácida e básica

101 Exemplo: Reação da RNAse A - Catálise ácido-básica geral Catálise Básica Geral Catálise Ácida Geral

102 Exemplo: Reação da RNAse A - Catálise ácido-básica geral Catálise Ácida Geral Catálise Básica Geral

103 Catálise Covalente Formação transitória de uma ligação covalente entre o catalisador e o substrato. H 2 O A-B A + B A-B + :X A-X + B H 2 O A + B + :X

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105 Exemplo: Descarboxilação do Acetoacetato

106 Exemplo: Descarboxilação do Acetoacetato

107 Exemplo: Descarboxilação do Acetoacetato

108 Exemplo: Descarboxilação do Acetoacetato

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110 Catálise por Íons Metálicos Cerca de 1/3 de todas as enzimas conhecidas necessita de íons metálicos para que tenha atividade catalítica Metais ligam-se a substratos de modo a orientá-los de forma apropriada para a reação Metais promovem reações de oxi-redução Metais conferem estabilização de cargas

111 Enolase

112 Enolase

113 Enolase 2 íon de Mg 2+ coordenam com a carboxila Estabilização da forma enólica pelos Mg 2+ Extração de um próton (catálise básica geral)

114 Enolase Eliminação de hidróxido por catálise ácida geral

115 Catálise Eletrostática A ligação de um substrato normalmente exclui água do sítio ativo Grupos carregados no sítio ativo da enzima que tem constante dielétrica baixa organizam-se de maneira a estabilizarem o complexo de transição.