Genes e Relógios Biológicos: Mario Pedrazzoli. Tese de Livre-Docência

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1 Genes e Relógios Biológicos: Implicações para evolução, saúde e organização social humana Mario Pedrazzoli Tese de Livre-Docência EACH/USP Setembro de 2010

2 Sumário Apresentação 1 Lista de estudos 2 1. Introdução 1.1 O dia exterior - o dia interior e as relações entre eles 1.2 Regulação da ritmicidade circadiana pelo sistema nervoso a partir da informação luminosa 1.3 Fenótipos de ritmo circadiano em humanos e sua repercussão social 1.4 Genética molecular da ritmicidade circadiana 1.5 O significado do relógio molecular na biologia circadiana em humanos 2. Objetivo 3. Considerações gerais sobre os métodos 3.1 Sujetios 3.2 Fenotipagem circadiana comportamental 3.3 Classifição Étnica 3.4 Genotipagem e manipulação molecular dos genes Tecidos e manipulação do DNA e RNA Região repetida no gene Per3 3.5 Aspectos Éticos 4. Resultados 4.1 Estudo Estudo Estudo Estudo Estudo Estudo Estudo Estudo 8 5. Discussão VNTR (Variable Number of Tandem Repeats)

3 5.1 Considerações finais

4 APRESENTAÇÃO Esta tese constitui um recorte de parte de minha produção científica em genética do sono e dos ritmos circadianos que se iniciou durante o meu pósdoutorado na Universidade de Stanford em Mais especificamente se refere à parte de minha pesquisa voltada ao estudo dos genes relógio, sua influência na determinação dos cronotipos ou no estabelecimento da Síndrome da Fase Atrasada de Sono, ao estudo da distribuição das freqüências alélicas destes genes em diferentes grupos étnicos e ao estudo do gene Per3 em primatas. A interpretação dos resultados dos nossos estudos nos últimos anos, seu significado teórico e complementaridade nos leva a uma nova visão da interação entre as relações astronômicas entre a Terra e o Sol e a expressão gênica necessária a adaptação dos seres vivos ao ciclo claro/escuro natural, visão esta que tem como corolário uma visão da evolução humana centrada no ponto de vista da adaptação às variações anuais do ciclo claro/escuro ao longo do clina latitudinal no nosso planeta e as consequências para a saúde humana na sociedade urbana moderna. A construção dessa visão que será apresentada neste texto é resultante da minha formação na pós-graduação no Departamento de Psicobiologia da Universidade Federal de São Paulo um departamento em essência multidisciplinar, das minhas relações e leituras científicas, das minhas idiossincrasias intelectuais e intuições, mas principalmente, e obviamente, dos resultados dos estudos feitos em conjunto com os meus alunos de pós-graduação. Vamos aos fatos.

5 Lista de Estudos A presente tese é baseada nos resultados do projeto PROSUL de Cronobiologia, alguns dos meus s artigos científicos e em tese de Doutorado sob minha orientação como segue: 1. Pereira DS, Tufik S, Pedrazzoli M. Timekeeping molecules: implications for circadian phenotypes. Rev Bras Psiquiatr. 2009; 31(1): Pereira DS, Tufik S, Louzada FM, Benedito-Silva AA, Lopez AR, Lemos NA, Korczak AL, D'Almeida V, Pedrazzoli M. Association of the length polymorphism in the human Per3 gene with the delayed sleep-phase syndrome: does latitude have an influence upon it? Sleep. 2005; 28(1): Pedrazzoli M, Louzada F, Araujo JF, Duartão L, Areas R, Menna-Barreto. Projeto PROSUL de Cronobiologia Humana: Distribuição de Cronotipos em Diferentes Latitudes na América Latina 4. Pedrazzoli M, Louzada FM, Pereira DS, Benedito-Silva AA, Lopez AR, Martynhak BJ, Korczak AL, Koike Bdel V, Barbosa AA, D'Almeida V, Tufik S. 5. Pereira DS, Pedrazzoli M, Koike Bdel V, Louzada FM, Benedito-Silva AA, Lopez AR, Tufik S. The G619A Aa-nat gene polymorphism does not contribute to sleep time variation in the Brazilian population. Behav Genet. 2007;37(4): Castro RM, Barbosa AA, Pedrazzoli M, Tufik S. Casein kinase I epsilon (CKI) N408 allele is very rare in the Brazilian population and is not involved in susceptibility to circadian rhythm sleep disorders. Behav Brain Res. 2008;193(1):156-7

6 7. Barbosa AA, Pedrazzoli M, Koike BD, Tufik S. Do Caucasian and Asian clocks tick differently? Braz J Med Biol Res. 2010; 43(1): Flavia Cal Sabino. Caracterização Molecular do Gene Relógio Per3 em primatas: foco no Sagui (Callithrix jacchus). Tese de Doutorado, Departamento de Psicobiologia da Universidade federal de São Paulo, 2010.

7 INTRODUÇÃO A Terra, em sua rota pelo espaço, faz um movimento de rotação ao redor do seu próprio eixo norte-sul, no sentido anti-horário. O tempo que leva para girar 360º em relação ao Sol, é de aproximadamente 24h, tempo o qual consideramos a duração de um dia. Além deste movimento a Terra realiza também o movimento de translação que consiste no avanço ao longo de uma trajetória levemente elíptica ao redor do Sol. O plano perpendicular ao eixo de rotação da Terra faz um ângulo de aproximadamente 23º relativo ao plano do equador solar. Da composição destes dois movimentos e do eixo inclinado do planeta deriva o padrão dia e noite sob o qual vivem os seres vivos no nosso planeta. Embora pareça uma informação geográfica trivial, na verdade quando analisados cuidadosamente, estes fatos trazem explicação e significado para as estações climáticas ou a quase ausência delas, a duração do dia e da noite ao longo do ano e o momento do nascer e do pôr do sol ao longo do eixo norte/sul durante o ano e algo menos trivial; a evolução, na matéria viva, de um sistema oscilatório com duração periódica de aproximadamente 24h com capacidade de antecipação dos ciclos ambientais associados a posição da terra no sistema solar. Por causa da inclinação do eixo da Terra, a quantidade e duração da recepção da luz do sol num período de 24h está em função da latitude. Enquanto na região equatorial, latitude 0º, o dia e a noite duram sempre 12h cada durante todo ano, na latitude 60º norte, em janeiro, o dia dura aproximadamente 5,5h sendo as 18,5h remanescentes, noite. Em julho esta situação se inverte, o dia tem a duração próxima a 18,5h enquanto a noite dura 5,5h. Estes fatos deixam claro o quanto são diferentes

8 as condições de luminosidade às quais os seres vivos estão submetidos ao longo do clina latitudinal da Terra. Um fato curioso que deriva dai, mas não tão fácil de entender, é que o dia nem sempre dura exatamente 24h, se considerarmos que os seres vivos na superfície do planeta sentem a passagem do tempo não pela rotação da terra, mas sim pela informação claro/escuro emanante desta rotação. Não é conhecido nenhum sistema sensorial em qualquer animal que tenha a capacidade de captar a rotação da Terra, portanto esta informação é captada principalmente através da visão que é sensível a duração do dia ou da noite ou o nascer e pôr do Sol. O período de um dia para um observador da luminosidade se dá, por exemplo, a partir do tempo decorrente entre dois nasceres do sol. Devido ao eixo inclinado da Terra e posição no espaço em relação ao Sol, os horários do nascer do sol acontecem em horários diferentes dia a dia em função da latitude e da época do ano, de forma que, deste ponto de vista os dias podem ser ligeiramente maiores ou menores do que 24h dependendo da época do ano. Uma área da biologia está intimamente ligada às relações astronômicas entre o Sol e a Terra e os parâmetros de luminosidade com periodicidade próxima a 24h que ocorrem no nosso planeta derivados destas relações, é a Cronobiologia. 1.1 O DIA EXTERIOR - O DIA INTERIOR E AS RELAÇÕES ENTRE ELES A Cronobiologia tem como uma de suas metas centrais estudar os aspectos temporais rítmicos da matéria viva, em todos os seus níveis de organização; molecular, bioquímico, fisiológico, comportamental e social.

9 Os ritmos ditos biológicos se expressam em uma grande variedade de períodos, mas uma faixa de período em especial é bem evidente por estar claramente associado ao ciclo geofísico dado pela rotação da Terra, a faixa circadiana. Os ritmos circadianos, do latim circa diem que significa cerca de um dia, são ritmos cujo período varia entre 20 e 28h, de acordo com a espécie estudada. De fato os ritmos circadianos expressam uma temporalidade que poderíamos chamar de dia interior. Nos humanos, em condições experimentais controladas, o período circadiano do ciclo sono/vigília, da secreção de melatonina e do cortisol e da temperatura corporal central é em média 24,2h (Duffy e cols., 2001; Czeisler e cols, 1999). Denomina-se este período endógeno próximo às 24h, tau (τ). Existe uma forte relação entre a periodicidade circadiana das condições de luminosidade ambiental e as expressões metabólicas, fisiológicas e comportamentais nos seres vivos. A repetição e alternância de eventos na natureza de forma temporal organizada cíclica contribuiu para que evoluíssem, nos seres vivos, mecanismos de resposta eficiente e antecipatória as mudanças do clima, das horas do dia e das estações do ano. A alternância rítmica de expressão de um fenômeno implica numa oscilação na qual cada momento tem um valor específico até se completar um ciclo, momento a partir do qual os valores vão se repetir até completar o próximo ciclo, tal valor momentâneo é denominado fase. Em cronobiolgia algumas fases específicas são usadas mais comumente para expressar relações temporais entre eventos ou relações de fase. Por exemplo, acrofase, o momento (ajustado pelo cosinor) de maior valor ou batifase de menor valor, ou ainda horários de início ou final do sono ou ainda o

10 nascer e o pôr do sol podem ser usadas como referencial de fase do ritmo claro/escuro embiental. O fator cíclico ambiental que age como pista temporal para os seres vivos é denominado zeitgeber (do idioma alemão, doador de tempo) e ao processo de ajuste do ritmo biológico ao zeitgeber conceitua-se arrastamento, finalizado o processo de arrastamento diz-se que o ritmo foi sincronizado (Marques N e Menna-Barreto L, 2003). Por meio do arrastamento, ritmos circadianos endógenos ligeiramente maiores ou menores que 24h são ajustados ao ritmo ambiental de forma a se expressarem com período idêntico ao ambiental, momento a partir do qual os dois ritmos passam a ter uma relação de fase razoavelmente estável. Muitos parâmetros fisiológicos nos seres vivos se repetem a cada 24h e mantém uma relação temporal razoavelmente estável, ou seja, sincronizada, com o ciclo claro/escuro natural o que poderíamos denominar organização temporal externa (Menna-Barreto, 2008). A vida no planeta se adaptou a essa periodicidade circadiana dada pela incidência rítmica da luz do sol no nosso planeta. Embora a primeira vista se tenha a sensação que essa sincronização seja simplesmente uma resposta do organismo ao meio oscilante, não se trata só disso, mas também de um ajuste entre ritmos de periodicidade circadiana. Os seres vivos ao longo do processo evolutivo desenvolveram um mecanismo de oscilação endógeno com periodicidade circadiana que não depende de informação do meio, mecanismo o qual se mantém oscilante com uma periodicidade constante sem uma pista temporal externa. Desta forma a organização temporal de um ser vivo se

11 expressa de duas formas: como reação a estímulos ambientais e como ritmicidade intrínseca (Marques N e Menna-Barreto L, 2003). O processo de reação ao aparecimento cíclico da luz ambiental que resulta na sincronização da ritmicidade intrínseca se dá por dois processos; o arrastamento e o mascaramento. O arrastamento age através do sistema circadiano e o mascaramento age diretamente no comportamento como, por exemplo, o desejo de sair ao sol numa manhã ensolarada. Em humanos, considerando a luz como agente mascarador, o efeito é de aumentar o alerta quando o estímulo é dado durante a noite (Cajochen C, 2007). No processo de arrastamento, o efeito da luz (o zeitgeber) no sistema circadiano não é sempre o mesmo ao longo do período circadiano, a resposta ao sinal luminoso pode ser de avanço de fase, de atraso ou nula e é dependente da fase na qual o sistema circadiano é atingido pelo sinal luminoso e da força do zeitgeber (Figura 1a e 1b) (Foster&Kreitzman, 2004). Em humanos a luz no final da noite ou pela manhã avança a fase (Figura 1b) e nos faz dormir mais cedo, por exemplo, (Boivin e cols., 1996; Zeitzer e cols., 2005 ) e no final da tarde e início da noite a luz atrasa a fase, no meio do dia não faz efeito (Zeitzer e cols., 2000) O desenvolvimento desta ritmicidade endógena ou programa temporal circadiano está inscrito no programa genético de cada organismo e permite que a expressão de processos metabólicos e/ou comportamentais aconteça em consonância com o claro/escuro ambiental de acordo com as necessidades de cada espécie, proporcionando trocas energéticas eficientes e maximizando a possibilidade de sobrevivência e reprodução (Foster & Kreitzman, 2004).

12 a) b) Figura 1. Curva de resposta dependente de fase (CRdF) em animal noturno e avanço de fase produzido por pulso de luz em humanos. 1a) Diagrama atividade/repouso (actograma) de um animal noturno sincronizado em 24h sob um ciclo claro/escuro de 12h/12h. Os regimes de luminosidade são mostrados por barras brancas e negras (claro e escuro respectivamente), LD significa claro/escuro (ligth/dark em inglês) e DD escuro contínuo (dark/dark). As barras cinza escuro logo abaixo dos regimes de luminosidade representam a fase de atividade dos animais dia a dia. No quinto dia as luzes são apagadas definitivamente e mantidas assim, o animal entra em livre curso expressando um período um pouco menor que 24h como mostra o aspecto inclinado do registros de atividade. Por convenção, no escuro constante, se considera o início da atividade como a hora circadiana 12 (circadian time 12 ou CT12), e entre CT0 e 12 é considerado o dia subjetivo (subjective day na figura) porque o animal permanece mais em repouso e entre CT12-24 a noite subjetiva (subjective night na figura) porque o animal se move mais. Usa-se o termo subjetivo porque de fato é sempre escuro durante o experimento e o dia e a noite são definidos pelo padrão atividade/repouso que mimetizam o comportamento do animal em condições reais de claro/escuro; atividade à noite e repouso durante o dia. O pequeno quadrado cinza nos actogramas representa um pulso de luz num determinado momento do ciclo circadiano, o gráfico logo abaixo dos actogramas é de fato como é representada uma CRdF. Nas ordenadas o deslocamento de fase (phase shifts, em inglês) gerado por pulsos de luz, + representa avanços e - atrasos de fase. Observe o efeito do pulso de luz no actograma e em seguida observe como é representado na CRdF. A) Um pulso de luz no meio do dia subjetivo não causa deslocamento de fase, tem efeito nulo (dead zone), B) Um pulso logo no começo da noite subjetiva causa um pequeno atraso, C) um pulso um pouco depois do inicio da noite subjetiva causa um atraso maior e D) Um pulso de luz dado depois do meio da noite subjetiva causa avanços de fase. Em humanos espera-se uma CRdF semelhante. Adaptado de Foster&Kreitzman (2005) b) Avanços de fase da temperatura central causados por pulso de luz de diferentes intensidades no mesmo momento em humanos, uma curva dose resposta para a luz. Nas ordenadas os valores da temperatura central (core body temperature) em Celsius, nas abscissas a hora subjetiva (relative clock time). O momento do mínimo da temperatura por grupo em livre curso está indicado pela linha vertical EP1 (endogenous period 1) como valor de referência 6h. Os círculos pretos representam o momento da temperatura mínima depois do pulso de luz, dado para todos os grupos 1,5h depois do mínimo da temperatura (depois da metade da noite subjetiva). A intensidade dos pulsos de luz de 5h esta dada em lux acima de cada curva (de 0,03 a 9500 lux). Com exceção do pulso de 0,03 todos os outros causaram um avanço de uma maneira dose dependente, quanto mais brilhante mais avanço na temperatura. Adaptado de Boivin e cols. (1996).

13 1.2 A REGULAÇÃO DA RITMICIDADE CIRCADIANA PELO SISTEMA NERVOSO A PARTIR DA INFORMAÇÃO LUMINOSA A informação do nível de luminosidade ambiental chega à retina, uma estrutura do olho humano com milhões de células fotoreceptoras e neurônios, onde é transduzida num sinal elétrico e depois químico que é transmitido cérebro adentro. Essa sinalização luminosa além de ser a informação que o nosso cérebro usa para constituir nosso sentido da visão, é também informação temporal emanante do ciclo geofísico claro/escuro ao qual estamos submetidos diariamente. A retina é a única estrutura fotossensível do nosso corpo. Nela a informação recebida pelas células fotoreceptoras é enviada às células ganglionares, cujos axônios emergem pelo nervo óptico alcançando estruturas intra-cerebrais especializadas em processar a visão de imagens e cores, alguns reflexos ligados a visão e a temporalidade do sinal luminoso. Parte do nervo óptico forma o trato retino-hipotalâmico, que chega ao hipotálamo para inervar os núcleos supraquiasmáticos (para revisão, Morin & Allen, 2005). Os núcleos supraquiasmáticos (NSQ) são dois aglomerados de neurônios separados pelo terceiro ventrículo, localizados na base do hipotálamo logo acima do quiasma óptico. Deles partem diversas vias eferentes nervosas e hormonais peptídicas, que levam a informação temporal processada, para todo o organismo (Moore RY, 1992). Estes sinais neuronais e humorais, originados do NSQ podem regular vias que controlam diversas funções fisiológicas. Estas vias estão muito envolvidas na manutenção da periodicidade, por exemplo, da liberação hormonal, do ciclo sono-vigília, do comportamento de alimentação e da termorregulação e,

14 portanto participam controle nervoso da sincronização ao claro/escuro ambiental. (Saper et al, 2005). Inicialmente a informação temporal processada no NSQ é transmitida por uma rede de conexões entre este núcleo e vários núcleos hipotalâmicos. Esta rede transmite e a espalha o sinal que permite a regulação temporal fisiológica do comportamento. O NSQ emite sinais para a zona subparaventricular (spvz) que é retransmitido para as regiões medial pré-óptica (MPO) e pré óptica ventro-lateral (VLPO) para controlar a termorregulação e o sono, respectivamente. Da zona subparaventricular, também, parte um sinal, para o núcleo dorsomedial do hipotálamo (DMH), que controla a secreção hormonal diária, através do núcleo paraventricular (PVN) e a vigília através área hipotálâmica lateral (LH) (Takahashi, 2008, Figura 2).

15 Figura 1. Esquema do NSQ e suas vias. A região ventromedial do NSQ recebe informações sobre o ciclo diário de claro/escuro através do trato retinohipotalâmico. Tanto sinais neuronais quanto sinais humorais funcionam como sinais do NSQ para outras regiões do cérebro e periféricas. O NSQ emite sinais para a zona subparaventricular (spvz) que são retransmitidos para a região medial pré-óptica (MPO) para controlar o ritmo circadiano de temperatura do corpo. Outra projeção da spvz, através do núcleo dorsomedial do hipotálamo (DMH), controla a secreção de hormônios diariamente através do núcleo paraventricular (PVN) e ciclos de sono-vigília através do hipotálamo lateral (LH) e núcleo pré-óptico ventro-lateral (VLPO). Figura traduzida de Takahashi e cols. (2008).

16 Uma das vias mais importantes na amplificação do sinal claro/escuro decodificado na retina e processado no NSQ é a via que passa pelo PVN e vai à glândula pineal (Kalsbeek A e cols., 2006), onde é produzido e liberado o hormônio melatonina que se difunde para a malha capilar, sendo assim distribuído sistemicamente (Zawilska e cols., 2009). A liberação da melatonina acontece principalmente na ausência de luz e, portanto sinaliza o escuro ambiental, por isso há quem a nomeie, poeticamente, como o hormônio da noite interior (para revisão Arendt, 2006). Pelo sinal dado pela concentração de melatonina no plasma e no líquor cefalorraquidiano originado na pineal, qualquer célula nas profundezas do nosso organismo decodifica que é noite e pode adequar seu metabolismo a este sinal. Além dos sinais provenientes do meio externo o NSQ e a rede de núcleos no hipotálamo conectados entre si também recebem múltiplas informações temporais dos tecidos periféricos. O resultado é um arranjo complexo de interações recíprocas as quais contribuem para a manutenção do período, da fase, da amplitude e da sincronização dos ritmos circadianos (Dibner e cols., 2010). 1.3 FENÓTIPOS DE RITMOS CIRCADIANOS EM HUMANOS E SUA REPERCUSSÃO SOCIAL O Homo sapiens como nos conhecemos hoje surgiu na África há aproximadamente 150 mil anos (Stanford, 2004). A partir daí nossos ancestrais em movimentos migratórios graduais ocuparam pouco a pouco a Ásia, a Europa, a Oceania e as Américas. Podemos imaginar que esta diáspora inicial da espécie humana a partir de regiões equatoriais na África foi acompanhada de diversificação morfológica, fruto

17 de adaptações necessárias a sobrevivência em diferentes condições climáticas e ambientais existentes nos outros continentes. Entre estas condições climáticas destacam-se as condições de luminosidade e temperatura ao longo do eixo norte-sul latitudinal. Nossos ancestrais partiram de um local no qual praticamente não existem variações na duração do dia e da noite ao longo do ano, para regiões distantes do equador onde estas variações são muito grandes. É lícito supor que parte destas adaptações aumentou as chances de sobrevivência dos nossos ancestrais em ambientes com alternância entre dias curtos e noites longas para dias longos e noites curtas e também para épocas de frio extremo e escassez de alimento que acompanhavam a as condições de luminosidade. É interessante imaginar que tais adaptações permitiram um sistema de temporização suficientemente plástico que tivesse a capacidade de sincronizar com essas novas condições nunca experimentadas antes. Mas talvez parte do mecanismo já estivesse suficientemente inscrito no nosso programa genético. Mas existem evidências científicas para estes fatos? Os humanos são animais diurnos assim como todos os primatas, com somente uma exceção, o macaco da noite (Aoutus sp). Os horários de dormir e acordar nas populações humanas são a expressão mais evidente de fenótipos circadianos, pois são de fácil observação sem necessidade de nenhuma medida mais invasiva ao organismo. Apesar de sermos animais diurnos, as relações de fase que mantemos com as pistas temporais ambientais como a luz do sol ou falta dela no escuro da noite que resultam nos horários nos quais iniciamos um episódio de sono, são características individuais. De forma geral, considerando, por exemplo, latitudes subtropicais como

18 em São Paulo e a falta de obrigações sociais, ao observar os horários de dormir e acordar de populações humanas nota-se que uma pequena parte da população acorda num horário próximo ou anterior ao nascer do sol e dorme algumas poucas horas após o pôr do sol, outra pequena parte tem um padrão invertido; acorda muitas horas depois do nascer do sol e dorme muitas horas depois do pôr. No entanto a maioria da população mantém relações de fase com o nascer e o pôr do sol, intermediárias entre estes dois extremos (Roennberg e cols. 2007). Podemos considerar os horários de dormir e acordar como somente um dos muitos processos fisiológicos ou comportamentais que apresentam expressão circadiana. Se considerarmos estes processos na sua totalidade é possível notar, por exemplo, que o início do sono mantém uma relação de fase com a temperatura corporal, que por sua vez mantém uma relação com a secreção do hormônio melatonina que mantém uma relação com a secreção do cortisol e que todos mantém relações temporais (de fase) entre si, formando o que pode ser definido como uma organização temporal interna. Portanto, quando consideramos os horários de sono como fenótipo, não podemos deixar de levar em consideração que estes horários são somente a ponta de um iceberg o qual é um reflexo do que está sob sua superfície; a organização temporal interna daquele organismo em particular. Em termos cronobiológicos podemos fenotipar ou cronotipar os indivíduos de acordo com a preferência de horários que têm para realizar suas atividades diárias e para dormir, um caráter conhecido como preferência diurna ou cronotipo. De acordo com esta preferência identificam-se três cronotipos básicos; os matutinos, indivíduos que têm preferência em levantar cedo e realizar suas atividades pela

19 manhã, os vespertinos que preferem acordar tarde e realizar suas atividades durante à tarde ou à noite e os intermediários, que escolhem horários intermediários entre os dois extremos. A maioria da população é intermediária (Roenneberg e cols., 2007; Wittmann e cols., 2006; Horne & Ostberg, 1976). Curiosamente o cronotipo apresenta um componente de desenvolvimento ontogenético, ou seja, o cronotipo muda durante o desenvolvimento, do nascimento a velhice. Crianças tendem a serem matutinos, adolescentes muito vespertinos, adultos jovens e sujeitos de meia idade intermediários e os idosos tendem a ser extremamente matutinos (Randler e Bilger, 2009; Duffy et al, 1999; Abe e Suzuki, 1985). Considerando que cronotipos refletem processos de sincronização entre a organização temporal interna e eventos rítmicos ambientais e que esta temporalidade endógena é particular de cada indivíduo, em parte herdada dos ancestrais, desenvolvida durante o processo evolutivo da espécie ante as forças naturais, é interessante pensar como este sistema de temporização circadiano endógeno lida com as novas pistas ambientais de temporalidade surgidas, após a revolução industrial, como a luz artificial, a organização para a educação dos jovens e o modo de produção capitalista que impõe os horários sociais de trabalho. A organização social humana impõe uma temporalidade na qual a maioria das atividades trabalhistas e educacionais ocorre entre 8h e 18h, portanto, os indivíduos que estão sincronizados a este horário têm uma tendência a um melhor desempenho. Parte da população, entretanto, está biologicamente sincronizada em horários incomuns e vive num estado dessincronizado aos horários sociais o qual poderíamos chamar de Jet lag social, em alusão ao desarranjo temporal sofrido por viajantes aéreos que passam por vários fusos horários (Wittmann e cols., 2006).

20 Além do problema da adaptação ou sincronização aos horários sociais mais habituais, a sociedade urbana moderna traz alguns desafios temporais ao sistema de temporização biológico. Por exemplo, viagens transcontinentais nas quais vários fusos horários são ultrapassados em pouco tempo (o já citado, Jet lag ), trabalho noturno e horários escolares nas primeiras horas da manhã para os adolescentes que naturalmente apresentam um horário de dormir tardio. A adaptação aos horários sociais é dependente de uma tendência individual pela escolha do momento para realizar atividades, num contínuo que vai da preferência pela manhã até a preferência pela tarde e noite. Se um indivíduo que tem uma tendência natural a ser vespertino, ou seja, dorme e acorda tarde necessita acordar muito cedo para obrigações sociais como trabalho ou escola, seu desempenho será prejudicado e sua adaptação a este evento temporal não será totalmente eficiente. Além destas tendências individuais de escolha de horários existem indivíduos nas populações humanas que têm tendências muito extremas na escolha dos horários de sono e realização de atividades. Estes horários por estarem muito fora do padrão populacional e por gerarem consequências negativas físicas e psicológicas nos indivíduos, são consideradas patologias da ritmicidade circadiana e do sono. Existem três tipos de distúrbios de sono caracterizados por anormalidades no sistema circadiano já bem descritos hoje em dia. A Síndrome da Fase Atrasada do Sono (SFAS), é um distúrbio no qual o principal episódio de sono é atrasado, resultando em sintomas semelhante à insônia e dificuldade de levantar no horário desejado pela manhã. A Síndrome de Fase Avançada do Sono (SFAVS), é

21 caracterizada por um episódio de sono adiantado, próximo ao começo da fase noturna e um despertar espontâneo nas primeiras horas da manhã. A síndrome do ciclo sono-vigília diferente de 24h (N-24), um padrão constante crônico de atrasos diários em uma ou duas horas no começo e final do sono, resultando em um horário não constante de início do sono e despertar (American Sleep Disorder Association, 1997). Desta forma considerando os padrões individuais destes diferentes fenótipos em relação à escolha de horários mais apropriados para se exercer atividades ou dormir podemos imaginar se tais padrões derivam em parte de herança genética e como a carga genética permite ou dificulta a adaptação. 1.4 GENÉTICA MOLECULAR DA RITMICIDADE CIRCADIANA Pesquisas recentes mostram que a matutinidade ou a vespertinidade, ou os cronotipos, são características resultantes do funcionamento do sistema de temporização circadiano que são herdadas geneticamente e sofrem uma adaptação as condições ambientais (Katzenberg e cols., 1998; Pereira e cols., 2005; Pedrazzoli e cols., 2007, Pereira e cols., 2009). Os ritmos circadianos biológicos são expressos como eventos bioquímicos, fisiológicos ou comportamentais e são muito importantes para sobrevivência. Estes ritmos circadianos têm um mecanismo correspondente ao nível molecular existente em cada célula do organismo, composto por alças de retroalimentação de facilitação e repressão de transcrição gênica (Gallego e Virshup, 2007; Lowrey e cols., 2000; Gekakis e cols., 1998; Shearman e cols., 2000a; Sangoram e cols., 1998; Zylka e cols., 1998). Este mecanismo molecular é como um espelho da expressão rítmica circadiana dos níveis organizacionais superiores de complexidade (bioquímico,

22 fisiológico e comportamental) que oscila com o mesmo período e que regula em última instância a expressão destes. A construção teórica colocada no parágrafo anterior a respeito da existência de um mecanismo molecular de oscilação circadiana e suas relações com o comportamento ocupou os cientistas na área nos últimos 40 anos e foi uma história que se inicia em estudos básicos em invertebrados, passa pelo estudo de mamíferos roedores e constrói conhecimento que pode ser hoje aplicado em humanos. O passo inicial para a construção deste conhecimento aconteceu no início da década de 70 com Konopka e Benzer (1971). Estes pesquisadores analisaram drosófilas mutantes e observaram que alguns animais apresentavam ritmicidade circadiana anormal da atividade locomotora e eclosão de pupas. Enquanto moscas selvagens em livre-curso, ou seja, sem a presença de pistas temporais ambientais externas, apresentavam o ciclo atividade/repouso numa periodicidade que se aproximava muito de 24h, podia-se observar em moscas mutantes sob o mesmo protocolo três linhagens distintas para o fenótipo do ritmo circadiano de atividade e repouso; um mutante arrítmico, um mutante com período circadiano endógeno curto (19h) e um mutante com período longo (28h). Estas observações significavam que alterações gênicas que provavelmente levavam a alterações de estrutura protéica estavam associadas à manutenção da duração do período na expressão circadiana da variável comportamental atividade e repouso (Konopka & Benzer, 1971). O que era uma novidade absoluta na época e de difícil interpretação, qual seria o mecanismo? Mas definitivamente o primeiro passo estava dado na identificação do mecanismo molecular da ritmicidade circadiana.

23 Em 1981, Smith e Konopka descobriram exatamente qual o era o gene mutante nestas moscas e o nomearam de Period (Per), pois causava alterações no período endógeno, este gene foi mais tarde identificado também em mamíferos e continua a ser considerado importante no mecanismo molecular do sistema de temporização circadiano (Tei e cols, 1997). Após esta descoberta na década de 70, nenhum estudo sobre a regulação da ritmicidade circadiana em vertebrados ou mamíferos surgiu até 1988, ano no qual Ralph & Menaker encontraram por serendipidade a primeira evidência da regulação genética do ritmo circadiano do ciclo sono-vigília em mamíferos. Estes pesquisadores observaram que um dos animais de seu laboratório apresentava um fenótipo anormal do ritmo circadiano ciclo sono-vigília. Este hamster quando colocado em livre-curso, apresentava um período endógeno curto de 22h e uma sincronização anormal ao ciclo claro/escuro com ângulos de fase entre e o início da atividade e o apagar das luzes com cerca de 3h de diferença dos animais selvagens. Fazendo uma analogia com uma condição humana para facilitar a compreensão, este resultado representa um indivíduo que acorda bem cedo e inicia sua atividade pela manhã, muito antes do sol nascer. Por meio de cruzamentos deste animal com outras fêmeas e entre animais das gerações F1, os pesquisadores observaram nas proles três fenótipos diferentes; animais com período endógeno médio de 24,1h (selvagens) e hamsters com período médio de 22h. e outro grupo com período médio de 20h, indicando um padrão genético mendeliano de herança. A observação posterior de cruzamentos entre hamsters com estes três fenótipos diferentes e a análise de proporções de animais nascidos revelou que o fenótipo apresentado inicialmente (período endógeno de 22h) era devido a uma mutação genética, ocorria em um único lócus autossômico e

24 era parcialmente dominante, seguindo um padrão de herança mendeliano clássico. Esta mutação foi denominada a princípio tau (τ), como referência a abreviação usada em cronobiologia para período circadiano endógeno. Nesta época (1988) não existiam ainda ferramentas de biologia molecular suficientes para identificar qual era exatamente o gene e a mutação existente neste animal, no entanto, este trabalho é um grande marco para pesquisa molecular da ritmicidade circadiana. Os resultados encontrados mostravam que exatamente como nas moscas drosófilas, mas no sistema mais complexo do organismo mamífero, uma mutação em somente um gene podia alterar drasticamente a regulação de ritmicidade circadiana. Com o estudo de Ralph & Menaker (1988), as investigações moleculares sobre a ritmicidade circadiana em mamíferos evoluíram rapidamente e alguns genes foram identificados como participantes do sistema de temporização circadiano. Vitaterna e cols. (1994) identificaram especificamente o primeiro gene do relógio circadiano celular em mamíferos. Neste estudo os pesquisadores por meio de agentes mutagênicos, induziram mutações em camundongos que resultaram em alterações no comprimento do período endógeno e perda da ritmicidade circadiana dos animais. O cruzamento entre animais heterozigotos mutantes produziu três fenótipos diferentes para a geração F2, indicando que a mutação estava localizada em um único gene que poderia ser o responsável por regular o comportamento circadiano de atividade/repouso. Análises posteriores demonstraram que este gene estava localizado no cromossomo 5 em camundongos (região equivalente ao cromossomo 4 humano), ele foi denominado gene Clock (do inglês, Circadian Locomotor Output Cycle Kaput).

25 Após a caracterização direta do primeiro gene envolvido com o sistema de temporização circadiano em mamíferos, outros genes foram descobertos o que indicava a crescente complexidade deste mecanismo na regulação dos ritmos circadianos. Considerando que em termos de expressão fisiológica ou comportamentais muitas variáveis, como o ciclo sono-vigília, a temperatura corporal e a secreção hormonal se expressam circadianamente, de alguma forma o mecanismo molecular, se único, teria que dar conta da explicação da expressão circadiana e das relações de fase de todas estas variáveis. Em 1992, foi demonstrado que sequências conservadas do gene Per de drosófilas eram também expressas nos Núcleos Supraquiasmáticos (NSQs) de mamíferos (Maler e cols, 1992) o que indicava a extrema conservação evolutiva que este gene teria sofrido, pois era semelhante em duas espécies muito distantes na escala filogenética, o que por sua vez sugeria que a conservação deste gene deveria ser importante para a adaptação ao ambiente desde antes do momento em que estas duas espécies tiveram um ancestral em comum. A descrição completa e caracterização do gene Per1 em mamíferos foram feitas em 1997 (Tei e cols, 1997). Em 1998, Takumi e cols. isolaram o segundo gene Period em mamíferos (Per2) que possui alta homologia com o gene Per1 e neste mesmo ano, foi isolado outro gene desta família, em mamíferos, o gene Per3 (Takumi e cols., 1998; Zylca e cols., 1998). Desta forma, diferente das drosófilas, o relógio circadiano molecular dos mamíferos possui três proteínas PER com papéis provavelmente não redundantes (Dunlap e cols., 1999; Vitaterna e cols., 2001). Os genes Per1 e Per2 apresentam diferentes respostas na expressão gênica nos núcleos supraquiasmáticos do

26 hipotálamo diante da estimulação por pulsos de luz (Zylca e cols., 1998) enquanto o Per3 parece ter um padrão oscilatório de expressão independente da luz nos núcleos supraquiasmáticos (Takumi e cols., 1998). Animais knock-out para os genes Per1, Per2 e Per3 apresentam período endógeno mais curto em livre-curso. Esse efeito é menos evidente para os animais knock-out para o gene Per3, que apresentam somente 30 minutos de encurtamento do período endógeno (Shearman e cols., 2000). O gene Bmal1 também conhecido como Mop3 passou a ser considerado um gene relógio em 1998 (Gekakis e cols.). Os autores demonstraram que a proteína BMAL1, que se expressava circadianamente, era capaz de se ligar a proteína CLOCK, formando um heterodímero que funcionava como um fator de transcrição que, portanto promove a transcrição de outros genes com um padrão rítmico circadiano. Animais com o gene Bmal1 não funcional (animais knock-out), tornamse totalmente arrítmicos em escuro constante e com a atividade locomotora prejudicada em condições normais de luminosidade (Bunger e cols, 2000). Neste ponto fica claro que há uma complexidade crescente no possível mecanismo do relógio circadiano molecular, mas ainda nesta mesma época uma dupla de genes parálogos, os genes Cryptocromo 1 e 2 (Cry 1 e Cry2) são adicionados na lista dos genes relógio. Estes genes são membros da família de receptores de luz azul em plantas (Todo e cols., 1996; van der Spek e cols., 1996; Hsu e cols.,1996; Kobayashi e cols., 1998). Em mamíferos, estes genes foram primeiramente classificados como possíveis candidatos para fotoreceptores circadianos (Stanewsky e cols., 1998), no entanto, análises posteriores demonstraram que eles têm um papel independente da luz no sistema circadiano de mamíferos (Griffin e cols., 1999).

27 Estudos em animais knock-out mostram que estes genes são essenciais para a regulação molecular do sistema de temporização e estão envolvidos com a regulação do período endógeno e com a sincronização. Camundongos knock-out para o gene Cry1 apresentam um período curto em livre-curso, enquanto os knock-out para o gene Cry2 exibem um período endógeno longo. Animais duplo knock-out tornam-se arrítmicos em escuro constante (van der Horst e cols., 1999). Finalmente, em 2000, a mutação tau identificada pela primeira vez em 1988 em hamsters foi encontrada no genoma do camundongo e localizada no gene da caseína quinase I épsilon (CKI ), uma importante enzima envolvida na fosforilação de proteínas (Lowrey e cols., em 2000). Desta forma por volta do ano 2000 oito genes haviam sido identificados como componentes de um possível mecanismo molecular de oscilação circadiana, mas qual seria o mecanismo? Um grupo de características especiais e comuns destes diferentes genes guiaria alguns pesquisadores para a elaboração de uma hipótese. Em primeiro lugar, eles possuem um perfil robusto de oscilação nos NSQs que dura aproximadamente 24h, exceto pelo gene Clock. Mutações em qualquer um destes genes podem causar uma regulação circadiana anormal com fenótipos que vão desde períodos endógenos mais curtos ou mais longos até a perda da ritmicidade e um prejuízo na sincronização pela luz. Em segundo lugar, todos os genes relógio codificam proteínas que possuem o domínio PAS, um domínio protéico que permite a dimerização proteína-proteína, essencial para o funcionamento do relógio circadiano. Os genes Clock e Bmal1 possuem um domínio adicional chamado basic-helix-loop-helix que permite a interação destes genes com a molécula de DNA (Zheng e cols., 1999; Shearman e

28 cols., 1999; Allada e cols., 1998). O heterodímero CLOCK/BMAL1 possui a capacidade de ligação com o DNA e age como um fator de transcrição para os outros genes relógio e outros genes no genoma (Lowrey e cols., 2000; Shearman e cols., 2000; Badiu, 2003; Gachon e cols., 2004; Cermakian e cols., 2003). Baseado nestas características, Lowrey e col. (2000) propuseram um mecanismo no qual, uma alça de retroalimentação negativa que envolve a transcrição e tradução de todos os genes relógio, estaria atuando como reguladora da ritmicidade circadiana molecular. De acordo com Lowrey (2000) o heterodímero formado pelas proteínas CLOCK e BMAL1 promoveria a transcrição dos genes Per1, Per2, Per3, Cry1 e Cry2. As proteínas codificadas por estes genes, uma vez traduzidas, formariam dímeros no citoplasma e quando em determinados níveis de concentração retornariam ao núcleo, bloqueando a ação do heterodímero CLOCK/BMAL1 na transcrição de seus próprios genes, formando assim uma alça de retroalimentação negativa de transcrição e tradução que duraria aproximadamente 24h (Lowrey e cols.,2000; Sangoram e cols., 1998). A enzima CKI também estaria envolvida neste mecanismo e tem como papel principal regular a atividade das proteínas PER por meio de fosforilação (Lowrey e col., 2000). Entretanto, está claro que este é um modelo bastante simplificado, pois novas descobertas estão sendo descritas demonstrando a complexidade deste sistema. De qualquer forma este modelo de alça de retroalimentação de facilitação e repressão da transcrição gênica tem valor heurístico, sendo bastante suficiente até o momento para explicar grande parte dos fenômenos comportamentais associados aos ritmos circadianos em animais de experimentação.

29 1.5 O SIGNIFICADO DO RELÓGIO MOLECULAR NA BIOLOGIA CIRCADIANA EM HUMANOS Uma conseqüência dos estudos descritos anteriormente é entender como a regulação molecular do sistema de temporização em mamíferos é aplicável na regulação da ritmicidade circadiana em humanos. Se mutações nos genes relógio levam a regulação anormal da ritmicidade circadiana em animais de laboratório, poderíamos supor que a regulação da fisiologia circadiana humana e seus aspectos fisiopatológicos podem ser conseqüências da variabilidade genética nestes genes relógio? Essa, a princípio, suposição já tem bastante confirmação experimental, Katzenberg e col. (1998) demonstraram que um polimorfismo localizado na região 3 do gene Clock (C3111T) está associado com a preferência diurna. Eles verificaram que o alelo C na posição 3111 está associado com a vespertinidade. Os dados em relação a este polimorfismo ainda são muito controversos. Em 2002, Robilliard e cols. não encontraram a mesma associação em uma amostra da população inglesa e alguns dados obtidos em nosso laboratório também não mostram a associação do polimorfismo no gene Clock com a preferência diurna em uma amostra da população brasileira (Pedrazzoli e cols., 2007). Outros genes além do gene Clock também têm sido implicados com os cronotipos. Archer e col. (2003) e Pereira e col. (2005) demonstraram que um polimorfismo de repetição, um VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) no gene Per3 humano está associado com a preferência diurna. Ambos os grupos de pesquisa demonstraram que a freqüência do alelo longo (5 repetições) é maior em grupos de matutinos do que em grupos de vespertinos.

30 Figura 3. Esquema representativo da proteína PER3 humana. Nos domínios PAS A e B se ligam outras moléculas PER. A seqüência de aminoácidos da região com 4 ou 5 repetições esta expandida na parte de baixo da figura. As repetições estão numeradas de 1 a 5. Na primeira linha consta a seqüência com 5 repetições, e na segunda linha a de 4 repetições, a seqüência faltante é representada por traços. Os círculos negros indicam sítios potenciais de fosforilação. Figura extraída de Archer e cols., Carpen e cols. (2006) analisaram um polimorfismo silencioso no gene Per1 (T2434C) e verificaram que a freqüência do alelo C foi maior no grupo de matutinos do que no de vespertinos. Como o polimorfismo T2434C não altera a seqüência de aminoácidos na proteína e nem a estrutura do RNAm, os autores sugerem que alteração (T2434C) esteja em desequilíbrio de ligação com algum polimorfismo desconhecido. Estudos em família têm demonstrado que o avanço ou o atraso de fase do sono possui um caráter hereditário (Reid e cols.,2001; Ancoli-Israel e cols., 2001). A identificação de famílias com distúrbios de ritmo é uma importante ferramenta para identificar genes relacionados com a regulação do ritmo circadiano do ciclo sono-vigília em humanos. Em 2001, Reid e cols. caracterizaram fenotipicamente uma família com SFAVS e observaram que existia um indivíduo afetado para cada geração, seguindo

31 um padrão mendeliano de herança autossômica dominante. Ancoli-Israel e cols. (2001), publicaram um heredrograma de uma família com SFAS. Toh e cols. (2001) analisaram geneticamente uma família portadora de SFAVS e verificaram que uma mutação encontrada no gene Per2 (A2106G) estava presente em todos os membros afetados da família. Em 2007, Xu e col. inseriram a mutação humana do gene Per2 (A2106G) em camundongos e observaram o mesmo fenótipo de avanço de fase nos animais e conseqüentemente a diminuição do período endógeno, reforçando a associação desta mutação com a SFAVS. Outros polimorfismos têm sido estudados em casos não familiares de distúrbios de ritmo circadiano. Ebisawa e cols. (2001) mostraram que polimorfismos presentes no gene Per3 podem estar associados com a SFAS. Archer e cols. (2003) reduziram a região estudada por Ebisawa e verificaram que o VNTR presente no gene Per3 está associado com a SFAS. Estes pesquisadores verificaram que a freqüência do alelo curto de 4 repetições era maior no grupo de pacientes com SFAS. Nosso grupo (Pereira e cols., 2005) encontrou associação do alelo oposto, o alelo longo (5 repetições), com a SFAS. Viola e cols., 2007 analisaram a estrutura do sono em 24 indivíduos saudáveis, que foram selecionados por seu genótipo no gene Per3 (homozigotos de 4 ou 5 repetições), no laboratório de sono em condições constantes e monitoradas. Os resultados deste trabalho mostram que este polimorfismo tem notáveis efeitos na estrutura do sono, incluindo marcadores da homeostase do sono, sugerindo que este alelo do gene Per3 esteja envolvido não somente com a regulação circadiana do sono, como também com sua regulação homeostática.

32 Em geral, estudos em animais têm demonstrado que variações nos genes relógio causam anormalidades na regulação dos ritmos circadianos, principalmente por alteração na duração do período endógeno, levando a uma alteração no ângulo de fase de sincronização pela luz. O nível de conservação filogenética destes genes é alta e é muito provável que alterações gênicas associadas a expressões comportamentais e circadianas observadas em animais de experimentação tenham certa semelhança em humanos. Descobertas de variações genéticas regulando os fenótipos circadianos em humanos incluindo alguns distúrbios de humor e suas relações com pistas temporais ambientais teriam, a longo prazo, um importante impacto terapêutico em medicina preventiva, ajudando no entendimento e tratamento dos distúrbios do sono, de ritmo circadiano e de humor, bem como, na prevenção de riscos para saúde causados por viagens transcontinentais e trabalhos em turno e noturno.

33 2. OBJETIVO Esta tese tem como objetivo fazer uma análise de parte de minha produção científica e demonstrar, a partir desta análise, que existem elementos suficientes para considerar que as condições climáticas e de luminosidade associadas à latitude influenciam a ritmicidade circadiana humana, que o ciclo claro/escuro ambiental é a pista temporal preponderante para a nossa espécie, que esta ritmicidade é em parte determinada geneticamente e que estes fatos têm implicação para a organização social, saúde e a evolução humana.

34 3. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OS SUJEITOS ESTUDADOS E OS MÉTODOS 3.1 SUJEITOS Humanos Para os estudos genéticos participaram 1750 voluntários, na sua maioria estudantes universitários de várias universidades em São Paulo e 17 pacientes com Síndrome da Fase Atrasada de Sono. Para o projeto PROSUL de cronobiologia (cronotipo on-line) participaram 16 mil pessoas residentes em todos os estados do Brasil. Primatas não humanos Utilizamos as seguintes espécies primatas, macaco-prego (Cebus apella), sagüi-de-goeldi (Callimico Goeldi), bugio (Alouatta), macaco-aranha (Ateles paniscus), macaco-barrigudo (Lagothrix lagothricha), macaco verde africano (Chlorocebus aethiops), sagüi-de-cara-branca (Callithrix geoffroy), sagüi-una (Sagüinus 34idas), sagüi-imperador (Sagüinus imperator), macaco-de-cheiro (Saimiri sciurus), macaco-da-noite (Aotus infulatus) e sagüi-de-cara-suja (Sagüinus fuscicollis). Estas amostras foram coletadas no Núcleo de macaco-prego da UNESP (campus Araçatuba), na Função Parque do Zoológico de São Paulo e no Centro Nacional de Primatas (Belém PA).

35 3.2 FENOTIPAGEM CIRCADIANA COMPORTAMENTAL Para determinar o cronotipo usamos uma versão on-line ou em papel do questionário Horne-Ostberg (1976). Este questionário é um instrumento internacionalmente validado e muito difundido, utilizado na avaliação de preferências diurnas para a realização de atividades e identifica os chamados cronotipos do espectro matutino/vespertino. Os pacientes foram diagnosticados por médicos especializados de acordo com o International Classification of Sleep Disorders. 3.3 CLASSIFICAÇÃO ÉTNICA A princípio nos primeiros estudos os voluntários se auto-classificavam. No estudo específico sobre diferenças étnicas nas freqüências gênicas (estudo 8), os indivíduos foram primeiramente visualmente observados quanto às características físicas inerentes a origem étnica, tais como, tipo de cabelo, cor da pele e tipo e cor dos olhos. Após essa observação prévia foi aplicado um questionário de avaliação etnica (anexo 1) no qual era indagado o país de origem do voluntário, dos pais, avôs e avós paternos e maternos. Foram selecionados somente aqueles que tinham todos os ancestrais asiáticos ou caucasianos segundo as respostas do questionário. 3.4 GENOTIPAGEM E MANIPULAÇÃO MOLECULAR DOS GENES Tecidos e manipulação do DNA e RNA Amostras de sangue ou amostras da mucosa oral foram coletadas para a extração do DNA ou RNA das células. As genotipagens foram feitas a partir do DNA por meio de técnicas tradicionais (PCR-RFLP, Polimerase Chain Reaction- Restriction Fragment Lenght Polimorphism), mas também por meio de novas

36 tecnologias como Taqman Real Time SNP Genotyping Assay (Applied Biosystems, USA). Nos primatas não humanos o DNA foi sequenciado por métodos tradicionais Região repetida no gene Per3 VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) O gene Per3 dos primatas contém uma região repetida composta por unidades 54 pares de base, polimórfica em humanos, que foi extensamente analisada no presente estudo, em muitas espécies de primatas. A genotipagem nesta região é feita por PCR simples em humanos. Em primatas não humanos, antes de se saber o número de repetições, é necessário fazer o seqüenciamento para se calcular então o número de repetições. 3.5 ASPECTOS ÉTICOS Todos os estudos foram aprovados pela comissão de ética da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP).

37 4. RESULTADOS 4.1 Estudo 1 - Moléculas que Marcam o Tempo: implicações para os Fenótipos Circadianos Objetivo Revisar a literatura sobre influências de polimorfismos genéticos sobre fenótipos circadianos a partir dos primeiros relatos até os dias atuais e mostrar a possível aplicação social em medicina preventiva. Era também nossa intenção publicar em português a fim de divulgar área de conhecimento no Brasil e para a classe médica. Considerações Neste artigo descrevemos para os leitores os avanços e possíveis conseqüências dos estudos sobre genética molecular dos ritmos circadianos para a pesquisa médica, incluindo o possível efeito destes genes em distúrbios de humor decorrentes de alterações patológicas da regulação da ritmicidade circadiana. 4.2 ESTUDO 2 - Association of the Length Polymorphism in the human Per3 Gene with the Delayed Sleep Phase Syndrome: Does latitude have an influence upon it? Objetivo O objetivo deste estudo foi verificar a existência de associação entre o VNTR polimórfico do gene Per3 e fenótipos de ritmo circadiano em humanos. Estudamos

38 as distribuições das freqüências gênicas em grupos de matutinos, intermediários e vespertinos, em pacientes com SFAS e em uma amostra da população geral. Considerações iniciais O VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) existente no gene Per3 é um elemento gênico raro em regiões codificantes do genoma humano. O alelo longo com cinco repetições codifica uma proteína com 18 aminoácidos a mais que o alelo curto com quatro repetições, esta diferença a princípio tinha um grande potencial em produzir um efeito no mecanismo do relógio molecular circadiano resultando em efeitos fenotípicos. Esse potencial foi o elemento lógico que nos levou a realizar o experimento. Resultados do Estudo Os resultados serão mostrados resumidamente baseados nas tabelas e gráficos. O diagnóstico médico de SFAS foi confirmado por exames fisiológicos. Foram feitas medidas circadianas de temperatura, melatonina e horários de sono dos pacientes que mostraram o atraso de fase destas variáveis. Todos os pacientes foram genotipados para o polimorfismo no VNTR do gene Per3 (Tabela 1). A tabela 2 mostra as frequências alélicas para o VNTR nos grupos experimentais. No grupo que representa a população geral 34% dos cromossomos carregam o alelo com 5 repetições (Per3 5 ) e 66% o alelo com 4 repetições (Per3 4 ). No grupo dos pacientes com SFAS estas proporções estão significativamente alteradas (χ2 = 4.85, P=.028, odds ratio, 95% CI: 2.4 [ ]), sendo que 56% dos cromossomos no grupo carregam o alelo Per3 5, quase o dobro do grupo controle, indicando uma forte associação deste alelo com a SFAS. A observação dos valores das frequências alélicas nos grupos extremos matutinos e vespertinos permite

39 também perceber que há diferenças significativas, sendo o alelo Per3 4 mais presente no grupo vespertino. Tabela 1: Horário de início do sono, Início da secreção de melatonina, e temperatura mínima (nadir) e genótipo para o VNTR do gene em pacientes com SFAS. PACIENTES HIS ISM TN GENÓTIPO PER3 1 3:12 22:30 4:12 4/5 2 3:47 2:01 9:41 4/5 3 1:34 19:07 4:01 4/4 4 1:03 21:50 6:52 4/5 5 2:19 00:58 5/5 6 2:24 00:38 7:24 4/5 7 23:53 19:45 4:30 4/5 8 2:52 00:12 8:36 4/4 9 3:46 00:09 6:26 5/5 10 1:43 00:27 7:51 5/5 11 3:05 6:08 5/5 12 3:46 2:02 10:06 4/5 Abreviações: HIS, horário de início de sono; ISM, início de secreção da melatonina; TN temperatura nadir, ou mínima durante o período de 24h. Os números na coluna genótipo representam o número de repetições do VNTR que cada paciente carrega em cada um de seus cromossomos. O traço significa valores inexistentes por problemas técnicos. A figura 4 mostra as frequências genotípicas e dá uma visão mais nítida da tendência da distribuição nos grupos. Note que enquanto na população geral os homozigotos Per3 5 (5/5) são aproximadamente 10% do total, no grupo de pacientes com SFAS eles são 30%. Note também a tendência do homozigoto 5/5 aumentar gradualmente a partir do grupo vespertino ao matutino.

40 Tabela 2: Frequências alélicas nos grupos experimentais Grupo Frq do alelo Per3 4 Frq alelo Per3 5 População geral 0,66 0,34 SFAS 0,44 0,56 * Matutino 0,60 0,40 Intermediário 0,65 0,35 Vespertino 0,77 0,23 # * diferença significativa comparando com a população geral, χ2 = 4.85, p=.028, odds ratio, 95% CI: 2.4 [ ]. # tendência significativa comparando os grupos de cronotipo (χ2 test for trend = 5.91, p=.015) Figura 4: Freqüências genotípicas na população estudada: SFAS, pacientes com diagnóstico para Síndrome da Fase Atrasada de Sono; MAT, grupo indivíduos extremos matutinos, INTERM, indivíduos intermediários; VESP = indivíduos extremos vespertinos, POP = população geral. 4/4 homozigotos Per3 4 para o VNTR, 4/5 heterozigoto e 5/5 homozigoto Per3 5.

41 Considerações Finais Este estudo mostrou que esta variação genética no gene Per3 está associada com os fenótipos circadianos estudados, sendo o alelo Per3 5 muito mais presente no grupo de pacientes do que na população geral sugerindo um papel para este alelo na patofisiologia da SFAS. Além da associação em si do alelo com o fenótipo, mais um fato interessante surgiu destes resultados. A comparação com resultados de um estudo muito semelhante ao nosso realizado na Inglaterra com pessoas que vivem em Londres (Archer e cols. 2003) mostrou que lá o alelo associado a SFAS é o alelo Per3 4. Uma possível razão para estas diferenças de efeito alélico entre os dois estudos é a latitude onde foram realizados. Londres fica a 51º30 N enquanto São Paulo 23º32 S. Há uma considerável diferença na duração da fase clara do dia e, portanto dos horários de nascer e pôr do sol entre estas duas cidades ao longo do ano. Em São Paulo, em média a fase clara do dia dura no inverno 10,5h enquanto o dia mais longo no verão dura 13,5h, uma diferença de aproximadamente 3h ao longo do ano. Em Londres os dias mais curtos do ano duram por volta de 8h, enquanto os mais longos 16h; 8h de diferença. Diante destes fatos nós hipotetizamos que tais condições extremamente diferentes de luminosidade dada pela latitude, o organismo adota diferentes estratégias de sincronização que é em parte influenciada pelo polimorfismo do VNTR do gene Per3.

42 4.3 ESTUDO 3 - Distribuição de Cronotipos em Diferentes Latitudes na América Latina (Projeto PROSUL de Cronobiologia) Objetivo Avaliar a distribuição dos cronotipos em diferentes populações que vivem ao longo do eixo latitudinal do América do Sul em busca dos possíveis efeitos da latitude no cronotipo. Considerações iniciais A partir dos resultados e a formação da hipótese no estudo 1 seria interessante testar se os cronotipo tinham alguma correlação com a latitude. Iniciamos um projeto cuja proposta inicial foi formar uma rede de colaboração baseada em dados que seriam coletados seguindo o trabalho original de Horne- Ostberg sobre cronotipos (1976). O grupo desenvolveu um programa de computador que permitiu a disponibilização on-line, nos idiomas português e espanhol, do questionário HO para determinação do cronotipo e a avaliação de uma grande quantidade de pessoas por meio da internet, em vários países da América Latina (AL). Ao final do projeto infelizmente não tivemos as respostas esperadas em outros países, mas no Brasil os resultados foram excelentes. Resultados Nós obtivemos respostas de 16 mil pessoas vivendo no território brasileiro entre as latitudes 0º e 32º33'S e longitudes entre 34º50' e 57º05' (Figuras 5a e 5b).

43 Figura 5. Localização no mapa do Brasil das respostas obtidas para o questionário HO on-line e com coordenadas de latitude e longitude. LATITUDE (0) a 5b LONGITUDE Figura 5: 5a) A área circunscrita no mapa representa as localizações que estão no mesmo fusohorário e que foram usadas da nossa análise para comparação de distribuições do cronotipo, os circulos azuis representam as localidades de onde foram obtidas respostas e (5b) representação da área circunscrita em 5a com coordenadas de latitude e longitude. O nível da insolação ou energia luminosa que atinge a atmosfera nesses diferentes pontos do eixo latitudinal é bastante variável. Na latitude mais baixa, 0º, o sol é muito brilhante e há uma pequena variação no nível de insolação que atinge a região ao longo do ano (de 388 to 439 Wm 2 ). No outro extremo do território brasileiro a 32ºS, há uma grande variabilidade no nível de insolação ao longo do ano, de 200 em Junho a 500 Wm 2 em Dezembro (Figura 6).

44 Figura 6. Nível de insolação ao longo do clina de latitude: valores médios, mínimos e máximos ao longo do ano Insolation ( Wm 2 ) Irradiação Solar (Wm 2 ) Norte North Latitudes South Sul Cronotipo ao longo do eixo norte-sul latitudinal A análise da pontuação do HO ao longo do clina de latitude, levando em consideração o nível de insolação médio por grau de latitude revelou uma clara tendência a vespertinidade em direção as latitudes mais altas ou níveis de insolação menores (r=0.96, p < 0.001; Fig 7)

45 Pontuação HO Figura 7. Pontuação média do HO ao longo do clina de latitude Latitude 48, ,0 47,5 47,0 46,5 HO score 46,0 45,5 45,0 44,5 417,4 407,8 398,3 388,7 379,1 369,6 360,0 Irradiação Solar (Wm 2 ) Considerações Finais A análise dos nossos dados indica que os humanos são sensíveis a sinalização diferencial dada pela luz do sol em função da latitude, o que pode ser observado como um clina latitudinal do cronotipo. Estes resultados corroboram nossa hipótese inicial de que há uma correlação entre latitude e o fenótipo do cronotipo. Estes dados em conjunto com os dados do estudo 1 sobre o gene Per3, indicam que uma possível relação causal entre estes dois fenômenos se faz, pelo menos em parte, por meio deste gene e provavelmente o

46 VNTR tem papel importante neste efeito, embora o exato mecanismo pelo qual este efeito se processa permaneça por ser esclarecido Estudo 4 - Clock polymorphisms and circadian rhythms phenotypes in a sample of the Brazilian population. Objetivo O objetivo deste estudo foi caracterizar uma possível associação de polimorfismos do gene Clock com os cronotipos. Estudamos as distribuições das freqüências gênicas de dois polimorfismos neste gene, um, uma substituição no DNA de timina (T) para citosina (C) na posição 3111 (T3111C) na região final do gene e outro de T para guanina (G) na região inicial do gene na posição 257 (T257G) em grupos de matutinos, intermediários e vespertinos, em pacientes com SFAS e em uma amostra da população geral. Considerações Iniciais O polimorfismo T3111C localizado na região 3 UTR do gene Clock tem sido um dos polimorfismos mais estudados nos genes relógio. Entretanto, os resultados são bastante controversos. Alguns estudos mostram associação deste polimorfismo com a preferência diurna em humanos (Katzenberg et al, 1998; Mishima et al, 2005) e outro estudo feito na Inglaterra não encontrou a mesma associação (Robilliard et al, 2002). Como não existe um consenso na literatura sobre a associação deste polimorfismo e a preferência diurna em humanos, decidimos replicar estes trabalhos

47 e além do polimorfismo T3111C analisamos também um polimorfismo localizado na região 5 UTR (T257G). Resultados do Estudo Os resultados serão mostrados resumidamente baseados na tabela 3, que mostra as frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos T3111C e T257G na amostra brasileira estudada. Nenhuma associação foi encontrada entre ambos os polimorfismos e os fenótipos analisados. Tabela 3: Distribuição de frequências alélicas e genotípicas Frequências Genotípicas Frequências Alélicas Clock 257 GG (%) GT (%) TT (%) n G T População Geral 19 (7.0) 113 (40.0) 150 (53.0) SFAS (29.0) 12 (71.0) Matutinos 09 (10) 38 (44.0) 40 (46.0) Intermediários 04 (5,0) 28 (34.0) 50 (61.0) Vespertinos 04 (7.0) 24 (40.0) 32 (53.0) Clock 3111 CC (%) CT (%) TT (%) n C T População Geral 19 (7.0) 113 (40.0) 150 (53.0) SFAS (29.0) 12 (71.0) Matutinos 08 (9.0) 39 (45.0) 40 (46.0) Intermediários 04 (5,0) 28 (34.0) 50 (61.0) Vespertinos 04 (7.0) 24 (40.0) 32 (53.0)

48 Ao comparar os genótipos entre os polimorfismos T3111C e T257G observamos um desequilíbrio de ligação entre eles. Praticamente todas as amostras que são T na posição 3111 são T na posição 257 e as amostras que são C na posição 3111, são G na posição 257. Apesar da possibilidade de uma interação entre estas duas regiões na estrutura do RNAm, o que afetaria a expressão do gene, não encontramos nenhuma evidência de interação quando analisamos estas regiões por meio de um software que faz predições sobre a estrutura do RNAm. Considerações Finais A análise dos nossos resultados não mostrou nenhuma associação entre os polimorfismos estudados e o cronotipo ou a SFAS. Uma vez que este estudo foi realizado com população residente em São Paulo, uma possível interpretação dos resultados sugere, mais uma vez, que os possíveis efeitos genéticos em fenótipos circadianos podem ser dependentes das variações ambientais associadas à latitude. 4.5 Estudo 5 - The G619A Aa-nat gene polymorphism does not contribute to sleep time variation in the Brazilian population. Objetivo O objetivo deste estudo foi analisar a freqüência do polimorfismo G619A do gene Aa-nat (Arilalquilamina-N-Acetiltransferase), em busca de associação com fenótipos de ritmo circadiano.

49 Considerações Iniciais A enzima AA-NAT é a enzima passo-limitante na formação da melatonina e tem como função acetilar a serotonina formando N-acetilserotonina (penúltima etapa antes da formação de melatonina). Em 2003, Hohjoh e col. haviam analisado o polimorfismo G619A presente no éxon 4 do gene Aa-nat, em 50 indivíduos com diagnóstico confirmado para SFAS e 161 indivíduos controles. Seus resultados mostravam um aumento significativo da frequência deste polimorfismo no grupo de pacientes com SFAS em relação grupo controle. Um cenário interessante naquele momento era comparar nossos dados com os dados da população Japonesa que tem uma distinção étnica da nossa população muito mais clara que a população européia. Estudamos as distribuições das freqüências gênicas em grupos de matutinos, intermediários e vespertinos, em pacientes com SFAS e em uma amostra da população geral. Resultados do Estudo Os resultados serão mostrados resumidamente baseados na tabela 4, que mostra o número absoluto dos sujeitos por genótipo. De 551 amostras (1102 cromossomos) genotipadas em nosso estudo, foram encontrados somente dois indivíduos heterozigotos G619A, as demais amostras são homozigotas GG, ou seja, uma proporção aproximada de 1 para 550. A observação dos resultados revela claramente que o polimorfismo G619A é muito raro na população brasileira. Nenhuma associação com com SFAS e com os cronotipos foi encontrada.

50 Considerações Finais Além de mostrar a falta de associação do polimorfismo com o genótipo, os nossos resultados mostram que o polimorfismo G619A do gene Aa-nat é raríssimo na população brasileira diferente da população japonesa (Hohjoh e col., 2003). Tabela 4: Distribuição genotípica do polimorfismo G619A do gene Aa-nat nos grupos SFAS, matutinos, intermediários e vespertinos e na amostra da população em geral. Homozigotos GG Heterozigotos GA Homozigotos AA SFAS Matutinos Intermediários Vespertinos População Geral Tabela 4: Os valores apresentados na tabela são os números absolutos dos sujeitos por genótipo. A amostra populacional utilizada neste estudo é formada principalmente por caucasianos, ou seja, uma população que deriva principalmente de ascendência européia com algum grau de miscigenação com os nativos brasileiros e negros. Interessantemente, os únicos indivíduos que carregavam somente um alelo 619G (heterozigotos) em nosso estudo são de descendência asiática e africana. Desta forma diante desses resultados uma questão começava a surgir: será que estas diferenças étnicas em polimorfismos associados ao sistema circadiano

51 são resultantes de pressões evolutivas derivadas das condições de luminosidade associadas às regiões geográficas onde as populações evoluíram? 4.6 Estudo 6 Casein kinase I epsilon (CKI) N408 allele is very rare in the Brazilian population and is not involved in susceptibility to circadian rhythm sleep disorders. Objetivo Investigar o polimorfismo S408N da CKIε na população brasileira e sua possível correlação com a Síndrome da Fase Atrasada do Sono (SFAS) e o cronotipo. Considerações iniciais Mais uma vez um polimorfismo num gene relógio tinha sido descrito estar associado com a SFAS na população japonesa (Takano e cols. 2004). Desta forma poderíamos comparar como feito previamente com o gene Aa-nat, o efeito de um polimorfismo em um gene relógio e um fenótipo de ritmo circadiano entre duas populações etnicamente distintas. Resultados Não foi encontrada qualquer associação do polimorfismo com SFAS ou cronotipo na nossa amostra. Interessantemente a não associação se dá pela ausência do alelo na população brasileira, somente 1,3% apresentaram o alelo em seu genoma (Tabela 5), contrastando com 21% da população japonesa.

52 Tabela 5. Distribuição genotípica do polimorfismo S408N da CKIε (n) S408S (n) S408N (n) N408N (n) SFAS Matutinos Vespertinos População Geral Tabela 5: n é o número de indivíduos em cada grupo. Considerações finais Interessantemente, em mais uma comparação entre as duas populações as distribuições das frequencias gênicas são completamente diferentes, sendo que na população japonesa há uma correlação com fenótipo circadiano. Tais comparações indicam que tais correlações fenótipo/genótipo são próprias de populações que vivem sob determinadas condições geográficas. 4.7 Estudo 7 - Do Caucasian and Asian clocks tick differently? Objetivo O objetivo deste estudo foi investigar as freqüências dos polimorfismos T3111C no gene Clock e do VNTR do gene Per3 em duas amostras populacionais de descendentes asiáticos ou caucasianos vivendo no Brasil.

53 Considerações Iniciais Nossos estudos anteriores e o dia a dia do trabalho no laboratório nos levava a pensar que a distribuição das frequencias gênicas de polimorfismos nos genes relógio em diferentes etnias, principalmente caucasianos e asiáticos, era diferenciada. Esta hipótese é perfeitamente testável na população brasileira. Embora a população no Brasil tenha sofrido intensa miscigenação nos últimos anos, pelo fato do fluxo migratório ser recente, ainda é possível estratificar amostras não miscigenados de estratos populacionais com certeza da origem étnica. Esta peculiaridade torna a população brasileira apropriada para estudos genéticos, pois é possível separar completamente grupos de pessoas de origem caucasiana de pessoas de origem asiática. Resultados De modo geral encontramos diferenças nas distribuições alélicas e genotípicas entre as amostras populacionais étnicas estudadas para ambos os genes. Nos asiáticos cerca de 70% dos indivíduos analisados carregam o genótipo 3111TT para o gene Clock, enquanto somente 50% dos indivíduos caucasianos têm o mesmo genótipo (Figura 8). As freqüências genotípicas são diferentes estatisticamente, portanto, a distribuição genotípica do polimorfismo T3111C é diferente entre asiáticos e caucasianos que vivem no Brasil.

54 Caucasianos TT TC CC Asiaticos 0% 20% 40% 60% 80% 100% SUJEITOS Tabela Valores das frequencias genotípicas para o polimorfismo T3111C no gene Clock. GENÓTIPOS Grupo Étnico (%) TT (%) TC (%) CC Asiáticos* (0,71) 78 (0,25) 27 (0,04) 4 Caucasianos (0,50) 68 (0,41) 55 (0,09) 12 Figura 8: Gráfico das frequências genotípicas do polimorfismo T3111C no gene Clock nos indivíduos com ascendências Caucasianas e Asiáticas. A tabela também é fornecida para melhor visualizar os números reais de indivíduos por genótipo, entre parêntesis as porcentagens. * diferença significativa da distribuição quando comparada com o grupo Caucasiano, p<0,01. TT, homozigoto T; TC heterozigoto e CC homozigotos C. Para o gene Per3 a observação dos dados revela que nos asiáticos 74% dos indivíduos analisados carregam o genótipo 4/4 e somente 47% dos indivíduos caucasianos tem o mesmo genótipo (Figura 9). As freqüências genotípicas são diferentes estatisticamente, portanto, a distribuição genotípica do VNTR do gene Per3 é diferente entre asiáticos e caucasianos que vivem no Brasil.

55 / Tabela Distribuição genotípica do polimorfismo VNTR no gene PER3 GENÓTIPOS Grupo Étnico (%) 4/4 (%) 4/5 (%) 5/5 Asiáticos* (0,74) 81 (0,23) 25 (0,03) 3 Caucasianos (0,47) 63 (0,43) 59 (0,10)13 Figura 9: Gráfico das frequências genotípicas do polimorfismo no VNTR do gene Per3 nos grupos Caucasiano e Asiático. A tabela é mostrada para facilitar visualização do número real de sujeitos e % entre parentesis. * diferença significativa quando comparado com a distribuição no grupo caucasiano p<0,01. 4/4 homozigotos 4 repetições para o VNTR, 4/5 heterozigoto e 5/5 homozigoto 5 repetições.

56 Considerações Finais Os nossos resultados mostram que a frequência do alelo T3111 do gene Clock é maior em asiáticos do que em caucasianos que vivem no Brasil e a freqüência do alelo de 4 repetições no gene Per3 é muito maior em asiáticos do que em caucasianos. Levando em consideração as diferenças genéticas encontradas neste estudo, dois fatores ficam evidentes: primeiro, variações étnicas talvez sejam importantes na interpretação dos resultados em estudos de associação entre genes e ritmo circadiano, segundo, uma pergunta surge, quais forças evolutivas moldaram estas variações genéticas nos genes relógio em diferentes populações? 4.8 ESTUDO 8 Caracterização Molecular do Gene Relógio Per3 em primatas: foco no Sagui (Callithrix Jacchus). Objetivos Este estudo foi realizado com o objetivo de caracterizar molecularmente o gene Per3 do sagüi (Callithrix jacchus) e investigar, especialmente, em outras espécies primatas, a região do VNTR do gene Per3. Considerações iniciais Diante dos resultados sobre a influência do VNTR do gene Per3 no fenótipo cronotipo e das correlações entre cronotipo e latitude, o ideal para explorar este fenômeno e buscar explicações mais detalhadas sobre um possível mecanismo de interação destes fatores, seria trabalhar com um modelo animal no qual pudéssemos

57 analisar tanto os fatores genéticos quanto as condições de luminosidade que poderiam ser facilmente replicadas num laboratório. Escolhemos a princípio tentar criar um modelo em roedores no qual produziríamos linhagens homozigotas para cada alelo as quais testaríamos em diferentes regimes de claro/escuro mimetizando as condições naturais. No entanto, surpreendentemente, descobrimos por meio de buscas em base de dados do genoma dessas espécies que elas não tinham esta região do VNTR do gene Per3, embora este gene seja bastante conservado entre os mamíferos. Inicialmente, esse fato nos levou a perguntar, será que esse VNTR existe somente no homem ou nos primatas em geral? Ou será que ele tem alguma relação com o fato de algumas espécies serem diurnas? Se caso o gene Per3 do sagui possuísse este VNTR polimórfico, como no homem, poderíamos então iniciar estudos utilizando modelos animais. Desta forma decidimos buscar no genoma do sagui pistas para responder estas perguntas. No início do estudo não havia em nenhum banco de dados do genoma informações sobre esta espécie que pudesse nos guiar. Desta forma, demos um salto numa semi-escuridão genômica, que só não foi total porque nos guiamos pelo genoma de outros primatas. Estudamos também somente a região do VNTR em vários primatas do novo mundo que vivem em regiões amazônicas e todos os mamíferos com genomas descritos em bases de dados. Resultados Primeiramente analisamos a região do VNTR em saguis e depois partimos para a análise em 11 espécies de primatas do novo mundo e em três espécies de

58 primatas do velho mundo (Chlorocebus aethiops e Pongo pygmaeus e Macaca mulatta). Surpreendentemente verificamos que os sagüis não possuíam na região do VNTR nem quatro nem cinco repetições, mas sete (Figura 10). Analisamos por volta de 90 animais e encontramos somente um com gene Per3 polimórfico na região do VNTR, semelhante aos humanos, este animal carregava um alelo com seis repetições, além do alelo de sete repetições. Mas infelizmente este animal morreu o que impossibilitou a continuidade de experimentos para criação de um novo modelo animal. Seguimos com a análise de outras espécies primatas e encontramos o VNTR em todas elas, no entanto, interessantemente, o número de repetições varia entre as espécies primatas estudadas. Esta variação vai de duas a 11 repetições dependendo da espécie estudada (Figura 10). Surpreendentemente encontramos, no decorrer da nossa exploração de genomas primatas, dois elementos transponíveis (TE) flanqueando o éxon 18 o qual contém o VNTR. A observação dos nossos resultados revela três fatores que se destacam: 1) somente os primatas carregam este VNTR em seus genomas, o que sugere que ele deve conferir alguma propriedade especial ao sistema de temporização ou relógio circadiano primata, 2) que apenas o sagüi-de-cara-suja (Sagüinus fuscicollis) apresentou o VNTR polimórfico, semelhante ao homem, com dez e onze repetições, desta forma poderemos utilizar esta espécie como modelo animal, citado a priori, 3) O macaco da noite (Aotus infulatus), única espécie primata noturna, tem o VNTR com somente duas repetições. 4) Todos os primatas, e só eles mais

59 nenhum outro mamífero, carregam em seus genomas dois elementos transponíveis flanqueando o éxon 18. A partir de nossos dados foi possível inferir razoavelmente a história natural deste VNTR levando em consideração a evolução primata. A observação dos dados revela que o número de repetições é razoavelmente conservado nos primatas antropóides (Figura 11) sugerindo uma ação conservativa da seleção natural no número de repetições do VNTR. Para os primatas do novo mundo ou haplorrinos, a variação do número de repetições é muito maior (Figura 11) sugerindo um processo estocástico na gênese e estabilização do número de cópias por espécie ou ainda mais interessante especiação simpátrica.

60 10

61 Figura 11. Representação da árvore evolutiva (filogênese) dos primatas, baseada em Dawkins (2004) e Schneider (2000). Ao lado do nome de cada primata está, entre parenteses, o número de repetições do VNTR do gene Per3 que a espécie ou o gênero contém. Em vermelho, estão os prováveis números de repetições do VNTR dos ancestrais correspondentes em cada nó da árvore. 3)

62 4. DISCUSSÃO O acúmulo do conhecimento sobre a genética dos ritmos circadianos em humanos nos últimos doze anos traz à tona elementos que revelam, sem sombra de dúvidas, a existência de polimorfismos e mutações genéticas que têm um papel na regulação desses ritmos. Estudos que mostram associações de genes relógio com fenótipos de ritmos circadianos normais e patológicos existem em relativa abundância. Já foram descritos casos de associação com os cronotipos, com distúrbios de ritmo circadiano e com distúrbios de humor (para revisão Estudo 1; von Schantz, 2008). No entanto apesar de a informação acumulada sobre a genética, devemos ainda pensar de que forma estes achados conversam com o conhecimento teórico acumulado sobre a regulação da ritmicidade circadiana? Devemos trazer uma visão mais abrangente da genética, é necessário pensar numa genética fisiológica na qual os achados sobre os genes e fenótipos circadianos sejam também interpretados à luz do conhecimento sobre a fisiologia dos ritmos circadianos em humanos e não simplesmente como cálculos matemáticos que revelam associações entre genes e caracteres. Uma conexão possível é a relação entre a temporalidade de completude da alça molecular de retroalimentação que regula os ritmos circadianos celulares e o tamanho do período endógeno de um ritmo circadiano. Estudos em animais transgênicos (knockout) para diversos genes relógio têm mostrado que um dos principais fenótipos observados é alteração do período endógeno (τ) do ritmo de atividade e repouso relativo à espécie estudada (Takahashi e cols., 2008; Vitaterna e cols., 1994; Ralph & Menaker, 1988).

63 Podemos observar vários exemplos na literatura nos quais o τ de animais mutantes é muito diferente do τ médio da espécie, é o caso por exemplo, dos hamster mutantes, descritos por Ralph e Menaker em 1988, nos quais a mutação tinha como conseqüência a redução o τ de 24,1h, descrito para os animais selvagens, para 22h nos animais heterozigotos e para 20h nos animais homozigotos para a mutação (*). Em humanos um fenômeno semelhante foi descrito num caso de Síndrome de Avanço de Fase de Sono familiar no qual um indivíduo da família teve seu τ avaliado em 23,3h (bem mais curto que τ médio humano de 24,2h), os indivíduos desta família foram identificados posteriormente como portadores de uma mutação no gene Per2 (Toh e cols. 2001). Estes dados descritos nos parágrafos anteriores formam um amálgama teórico bastante razoável entre a teoria genética e a de ritmos circadianos segundo o qual poderíamos então supor que a duração da completude da alça molecular de retroalimentação circadiana, na qual estão envolvidos os genes relógio, determinaria a duração do período endógeno (τ). Indo mais adiante no raciocínio poderíamos supor que a variação interindividual do τ na população seria em parte decorrente da variação genética e das combinações alélicas que cada um de nós herdou de seus ancestrais. * Recentemente foi descrito que a mutação τ causa um ganho de função para enzima Caseína Quinase ε, que além encurtar o período endógeno do ritmo de atividade/repouso encurta também o período circadiano de disparo dos neurônios do NSQ e de células em osciladores periféricos. O ganho de função enzimático permite o aumento da degradação de proteínas PER no núcleo e no citoplasma aumentando a velocidade de completude da alça de retroalimentação encurtando o dia interior dos animais transgênicos (Meng e cols., 2008).

64 Para facilitar a compreensão poderíamos usar uma analogia do mecanismo molecular de marcação do tempo biológico com um relógio mecânico no qual cada um destes genes funcionaria como uma engrenagem do relógio. Assim, o mau funcionamento de algum deles (no caso de mutações) ou uma particularidade sutil do funcionamento (no caso de polimorfismos) resultaria em um arranjo particular nos encaixes entre as engrenagens, que levaria a uma forma particular no funcionamento da maquinaria do relógio, encurtando ou alongando o tempo biológico circadiano. A fraqueza desta analogia reside no fato de que o relógio mecânico é um sistema fechado, enquanto o relógio molecular é sistema aberto que recebe informações do exterior celular continuamente o que permite o ajuste temporal fino entre os milhões de células do organismo e organiza a expressão circadiana permitindo a manutenção das relações de fase de variáveis fisiológicas e comportamentais. Essa hipótese da relação entre da duração da completude da alça de retroalimentado molecular e a duração do τ daria conta, pelo menos em parte, da explicação de uma possível variação interindividual e também da observação de uma possível curva de distribuição em torno de uma média para este fenótipo em populações humanas. Os resultados de experimentos recentes nos quais o τ foi avaliado em vários indivíduos confirmam a variação individual e revelam que esta variável se apresenta com uma distribuição numa faixa entre 23,9 e 24,5h (Czeisler e cols. 1999, Duffy&Czeisler, 2001).

65 Um fato consequente desta relação entre a teoria genética e a cronobiológica é a implicação com os mecanismos de sincronização dos ritmos circadianos pela luz ambiental e os fenótipos circadianos resultantes. A partir dos dados expostos surge a possibilidade interessante de que diferentes períodos endógenos (τ) resultantes de diferentes combinações de variações gênicas nos genes relógio implicariam em diferentes curvas de resposta dependentes de fase e, portanto diferentes ângulos de fase de sincronização às pistas temporais derivadas do claro/escuro ambiental, o que teria como corolário os fenótipos comportamentais circadianos conhecidos como cronotipos. Tais fenótipos seriam então a resultante da ação de componentes genéticos e ambientais claramente identificáveis nas duas teorias. Interessantemente estes fatos permitem hipotetizar que os cronotipos não são fenótipos rígidos, mas ao contrário flexíveis. Sendo que a direção da flexibilidade estaria então associada às condições ambientais de luminosidade. Dentro desta linha de raciocínio o nosso estudo de 2005 (Estudo nº 2) sobre a associação entre o VNTR do gene Per3 e a Síndrome da Fase Atrasada do Sono (SFAS) traz um novo elemento que permite ir um pouco mais adiante na dissecção de fenômenos cronobiológicos relacionados a adaptação às pistas temporais ambientais associados com elementos genéticos.

66 Neste estudo em questão mostramos que o alelo de 5 repetições do gene Per3 (Per3 5 ) está muito mais presente no grupo de pacientes com SFAS do que na população geral, sendo que o genótipo homozigoto Per3 5 aparece em 30% dos pacientes e em somente em 10% da população geral. Em estudo similar feito na população inglesa (Archer e cols. 2003) as frequencias gênicas são muito semelhantes na população geral, mas muito diferentes no grupo de pacientes, sendo que nenhum paciente com SFAS apresenta o genótipo homozigoto Per3 5 (Figura 12) Figura 12. Comparação de frequências genotípicas para o VNTR polimórfico do gene Per3 em amostras de pacientes com SFAS no Brasil (São Paulo) e Inglaterra (Londres). Repare na diferença entre os genótipos ( 4/4 homozigoto Per3 4, 4/5 heterozigoto, 5/5 homozigoto Per3 5 ), a diferença nas frequência dos homozigotos nas duas cidades é gritante. Ambas as distribuições genotípicas são incomuns quando comparadas com a distribuição na população geral das duas cidades (ver figura 4). Alelos invertidos levando ao mesmo fenótipo em latitudes diferentes?

67 A partir da comparação destes dados coletados em duas cidades localizadas em hemisfério e latitudes diferentes fica claro que o VNTR do gene Per3 está associado com a SFAS, mas uma situação curiosa surge; os alelos associados à doença e os alelos protetivos estão invertidos nas duas cidades, ou seja, o alelo Per3 5 aumenta a chance de um indivíduo em São Paulo desenvolver SFAS e o Per3 4 protege, enquanto em Londres, o alelo Per3 5 protege e o Per3 4 aumenta a chance. Poderia esse resultado ser explicado pela teoria genético-cronobiológica? Considerando que a sincronização dos ritmos biológicos se dá pelos processos de arrastamento e mascaramento e que o efeito da luz, no arrastamento, está associado à hora (fase do período endógeno) em que o estímulo alcança o sistema circadiano e a força do zeitgeber (irradiação solar ou luz artificial), nós hipotetizamos que os mecanismos de regulação diferencial dos ritmos circadianos relativos ao gene Per3 em São Paulo e Londres talvez se devam a localização geográfica das duas cidades, principalmente a latitude, do que deriva padrões de claro/escuro ambiental muito diferentes. Os alvoreceres e os ocasos do sol acontecem em momentos diferentes ao longo do ano, com duração de fotofases menos variantes e sol mais brilhante em São Paulo do que em Londres. Assim a luz do sol incide com intensidades diferentes e em momentos diferentes na curva de resposta de fase individual levando a perfis de sincronização particulares, que seriam dependentes em parte do VNTR do gene Per3.

68 Desta forma poderíamos imaginar que as condições de luminosidade diferenciadas combinadas com os alelos que um indivíduo carrega resultariam em relações de fase próprias entre o alvorecer e o acordar ou o ocaso do sol e o adormecer. Seguindo poderíamos ainda imaginar que combinações diferentes entre padrão claro/escuro e genótipo poderiam paradoxalmente resultar no mesmo fenótipo em locais diferentes. Tal como observamos; diferentes combinações de genótipos (do VNTR gene Per3) e padrões de luminosidade resultam no mesmo fenótipo de SFAS em São Paulo e Londres. Como corolário desta situação poderíamos inferir que um indivíduo com SFAS com genótipo Per3 5/5 vivendo em São Paulo que mudasse para Londres teria uma tendência a ter a sua condição melhorada, seria possível admitir este fenômeno? Uma doença que melhora com a mudança de latitude? Interessantemente Gottesman (2000) relata um caso de um paciente com SFAS morador de Paris no qual ocorre o desaparecimento dos sintomas depois da mudança para o Rio de Janeiro. Embora este paciente não tenha sido genotipado para o VNTR do gene Per3, a simples verificação da ocorrência do fenômeno de melhora, ou flexibilidade da fase circadiana, associado à mudança de latitude reforça o nosso ponto de vista baseado em nossas inferências teóricas.

69 A idéia de flexibilidade da fase circadiana associada à latitude também seria um argumento razoável para explicar resultados conflitantes em estudos de associação genética e fenótipos circadianos em várias partes do mundo. Como por exemplo, no nosso estudo sobre polimorfismos no gene Clock (estudo 4) no qual não conseguimos confirmar associação com os cronotipos em amostra da população brasileira como descrito por Katzenberg e cols. (1998) para uma amostra populacional do estado de Wisconsin (EUA), que se localiza ao redor da latitude 43º norte, embora as frequencias gênicas encontradas nas duas populações fossem muito semelhantes. Observando a idade média nos dois estudos também encontramos diferenças, sendo a amostra populacional norte americana mais velha, como a idade também está associada à fase circadiana e a sensibilidade do sistema visual a informação luminosa poderia servir como um fato adicional para explicar as diferenças dos resultados nos dois estudos (Roenneberg & Merrow, 2007). Embora as diferenças de iluminação ambiental ao longo do eixo latitudinal norte/sul do planeta sejam informações corriqueiras na comunidade científica cronobiológica, em geral as evidências experimentais sobre o efeito da latitude no comportamento e fisiologia circadiana em humanos não tem sido muito abundantes, menos ainda quanto se trata de aspectos da vida real cotidiana (Randler C., 2008 Menna-Barreto e cols. 1990, Roenneberg & Aschoff 1990). Nesse sentido os nossos resultados obtidos a partir do estudo nº 2 desta tese, Distribuição de Cronotipos em Diferentes Latitudes na América Latina, preenchem uma lacuna na literatura especializada ao mostrar, no território brasileiro, que há uma correlação entre o gradiente latitudinal e os cronotipos, sendo que partindo das regiões equatoriais há uma tendência a vespertinidade em direção ao sul.

70 O arcabouço teórico que pode explicar estes resultados reside observação do momento da incidência da pista temporal no sistema circadiano, ou seja, na fase de sincronização pela luz solar. Neste caso a pista temporal se expressa como gradientes de horários de nascer e ocaso do sol (Figura 13) e intensidade da irradiação solar que acompanham o crescente latitudinal a partir da linha do equador (Figura 6, resultados). A partir destas informações é possível observar que a incidência da luz solar, quando analisadas em cidades localizadas na região costeira do Brasil, atinge sempre o sistema em horários mais avançados em torno dos meses de inverno e horários menos atrasados nos meses de verão no nordeste brasileiro em relação ao sul. Explicando de forma mais detalhada, ao observamos os horários do nascer e ocaso do sol ao longo do crescente latitudinal da costa brasileira é possível verificar que durante os meses de verão, ao redor do solstício, os alvoreceres acontecem em horários semelhantes nas cidades ao longo da costa, enquanto os ocasos acontecem sempre mais tarde seguindo o crescente latitudinal (Figura 13). Nos meses ao redor do solstício de inverno a situação se inverte, os alvoreceres estão antecipados e os ocasos são semelhantes (Figura 13, Tabela para horários absolutos), causando, portanto sempre, ao longo do ano, avanços de fase maiores e atrasos de fase menores gerando um clina comportamental que acompanha o crescente latitudinal.

71 Sosltícios Inverno Verão Nascer Ocaso Nascer Ocaso Natal 5:29h 17:16h 5:05h 17:33h São Paulo 6:48h 17:29h 5:17h 18:52h Porto Alegre 7:20h 17:33h 5:20h 19:26h Figura 13. Comparação dos horários de nascer e por do sol em três cidades localizadas ao longo da costa brasileira. O gráfico mostra nascer e ocaso do sol nas três cidades nos horários mais extremos possíveis, os solstícios. Qualquer outro momento do ano será intermediário, mas com padrão semelhante a estes dois extremos. Repare que no inverno o sol nasce sempre mais cedo em Natal e se põe em horários semelhantes nas três cidades. No verão por outro lado o nascer do sol é semelhante nas três cidades, mas o ocaso é mais tardio em Porto Alegre. A tabela, para facilitação de visualização, mostra os horários reais descontando o horário de verão, onde ele acontece.

72 Outra explicação possível (e talvez complementar) seria que à medida que se afasta do equador a força do zeitgeber diminui, portanto diminuindo seu efeito sincronizador liberando o sistema para expressar o período endógeno individual (τ) que na maioria dos humanos é maior que 24h, se expressando, portanto como atraso de fase e vespertinidade (Roenneberg e cols. 2003). Estes dados sugerem fortemente algo muito relevante para o entendimento da regulação da ritmicidade circadiana em humanos; nossos ritmos circadianos são sincronizados principalmente pela luz solar. Entendo que tal afirmação é delicada já que muitos estudos têm sido publicados sugerindo que há múltiplos zeitgebers para a nossa espécie e outras, como o contexto social incluindo a luz artificial, exercício físico e alimentação (Mistlberger & Skeene, 2005). No entanto entendemos que tal tipo de informação sobre os efeitos dos diferentes zeitgebers sobre os processos de sincronização só pode ser gerado, em ultima instância, por experimentos ou situações experimentais realizados em condições de vida real e na nossa própria espécie, ainda mais robustos serão os resultados se gerados a partir de estudos epidemiológicos. Experimentos com condições controladas em laboratórios de sono ou em outras espécies podem, no máximo, fornecer informações que tenham valor heurístico a ser confirmado ou não em condições reais. Afinal podemos pensar que o sistema de temporização circadiano evoluiu como um sistema de percepção e resposta temporais em condições naturais, nas quais a pista temporal emanante da luz solar é a mais robusta e estável ao longo do processo evolutivo.

73 Se este raciocínio é correto, ou seja, que a luz solar é o zeitgeber preponderante para a nossa espécie seria de se esperar que em cidades separadas no espaço por 15º de longitude (portanto com um intervalo de tempo de uma hora no alvorecer ou ocaso do sol), mas que estivessem no mesmo fuso horário, as fases circadianas das populações fossem diferentes seguindo o movimento do sol e, ao contrário, se a pista temporal é o contexto social (o horário do relógio) seria de se esperar que não houvesse diferenças na fase circadiana entre as populações, pois todos na população estariam se orientando pelo mesmo horário; o do relógio. De fato este estudo foi realizado por Till Roenneberg e cols. (2007) e mostrou que a primeira hipótese é verdadeira; existe um clina longitudinal de fases circadianas (evidenciado pelos cronotipos) no eixo leste-oeste. Estudos com indivíduos cegos em vida livre também reforçam este ponto de vista, pois estes têm uma vida cheia, do que poderíamos chamar, de pistas temporais não fóticas, como o contexto social, alimentação em horários regulares, empregos com horários determinados, acesso a informação de relógios de pulso, alarmes despertadores e até cães e, no entanto não sincronizam seus ritmos circadianos quando a cegueira envolve falta de resposta fisiológica a luz (como por exemplo supressão da produção de melatonina). Por outro lado cegos com percepção ou pelo menos sensação da luz sincronizam, indicando claramente a resposta a luz solar como fator predominante no processo de sincronização em humanos. (Skene & Arendt, 2007) Desta forma olhando em conjunto nossos dados sobre a latitude, os de Till Roenneberg e os dados sobre cegos, que foram resultantes de estudos realizados na vida real cotidiana na nossa espécie, podemos imaginar um sistema de temporização circadiano em humanos no qual os processos de sincronização envolveriam

74 múltiplos zeitgebers, sendo que a luz solar seria o predominante e os outros (já descritos anteriormente) atuariam como ajustadores finos do processo não sendo capazes de sincronizar por si só (na maioria dos casos), sem a entrada de informação sobre a luz solar no sistema. Se a luz solar é uma pista temporal tão importante é de se supor que tenha atuado como fator ambiental de seleção e que os genes relógio, por estarem envolvidos na regulação da ritmicidade circadiana, sejam alvos potenciais. Portanto, é sugestivo que as variações genéticas nos genes relógio presentes em diferentes populações poderiam refletir forças seletivas atuando em populações vivendo em diferentes condições de luminosidade e desta forma teriam contribuído com a adaptação regional e evolução da espécie humana. Nos nossos estudos buscando associação entre polimorfismos em genes relógios ou genes associados ao sistema circadiano começamos a nos deparar com um fato interessante; a distribuição das frequencias gênicas nas populações com ancestralidade caucasianas e asiáticas eram muito diferentes e isso estava diretamente associado ao fato de não conseguirmos replicar alguns estudos. Pois em geral polimorfismos descritos como associados com fenótipos circadianos nas populações asiáticas, como começávamos a reparar, eram raríssimos na população brasileira, uma população miscigenada, mas com alto grau de herança caucasiana européia. Estudos recentes demonstram que a imensa maioria (provavelmente 90%) das patrilinhagens dos brancos brasileiros é de origem européia, enquanto a maioria (aproximadamente 60%) das matrilinhagens é de origem ameríndia ou africana (Pena e cols. 2009; Carvalho-Silva e cols. 2001).

75 Desde que o fenótipo circadiano é resultado de uma forte interação entre o meio ambiente e o organismo, e que, um dos mais importantes zeitgebers para os seres humanos é o ciclo claro-escuro, seria lógico pensarmos que diferenças na latitude onde populações ancestrais evoluíram poderiam contribuir de maneira importante para a seleção destes polimorfismos. A distribuição sistemática de polimorfismos ou haplotipos étnico-específicos nos genes relógio poderia representar eventos adaptativos para os diferentes fotoperíodos e mudanças climáticas sazonais que representam ritmos ambientais. Em estudos com Drosophila melanogaster há relatos de associação de polimorfismos nos genes relógio com clina de latitude (Costa & Kyriacou, 1998; Costa et al., 1992; Sawyer et al., 2006). Embora a população brasileira tenha sofrido intensa miscigenação nos últimos anos, o fato do fluxo migratório ser recente, torna possível estratificar amostras não miscigenadas destas populações imigrantes com certeza da origem étnica. Esta peculiaridade torna a população brasileira apropriada para estudos genéticos, em especial, estudos sobre os genes relógio. Nossos resultados sobre a distribuição das frequencias de alelos dos genes Clock e Per3 em grupos étnicos estratificados de uma amostra populacional brasileira confirmam nossa hipótese inicial sobre uma possível distribuição étnico específica de polimorfismos em genes relógio. Seriam estas distribuições resquícios de pressões seletivas diferenciadas associadas ao local que estas populações evoluíram? Um primeiro ponto a considerar no caminho para se pensar esta questão é a reflexão sobre história evolutiva humana em termos das pistas temporais presentes ao longo de nossa história evolutiva. O Homo sapiens apareceu no planeta,

76 especificamente, na África por volta de mil anos antes do presente e de lá se espalhou pelo globo iniciando a jornada por volta de 50 mil a 70 mil anos atrás (Stafond, 2003). Esta jornada se deu principalmente em direção ao norte em direção a latitudes mais altas. Quando consideramos estes dados e colocamos ainda na equação todos os ancestrais bípedes da nossa espécie, não é difícil perceber que tivemos aproximadamente três milhões de anos de adaptação a zonas equatoriais (Figura 14), onde às pistas de luminosidade ambiental são constantes ao longo do ano; dias e noites com duração de aproximadamente 12h com muito pouca variação, inclusive de temperatura. 10º N Equador Figura14. Locais na África onde a maioria dos Australopithecus viveram há até 4 milhões de anos. Um deles é nosso ancestral. No mapa da África à esquerda a região está localizada dentro da elipse vermelha, repare que a região fica entre 0 e 10º de latitude. No mapa à direita a mesma região ampliada, os círculos vermelhos localizam os locais onde os fósseis de foram encontrados. Fontes: Google maps e Scientific American Special Edition New look at human evolution, Agosto de 2003.

77 O movimento migratório, primeiro em direção ao norte, levou nossos ancestrais a ambientes bem menos constantes com muito mais tons de sazonalidade inclusive com a variação da luminosidade ao longo do ano que a acompanha. As mudanças sazonais e as pressão seletivas inerentes a elas devem ter sido um fator chave na formação do gênero Homo, incluindo o erectus, que também fez essa rota. A evolução de um sistema circadiano plástico o suficiente para antecipar estas mudanças sazonais deve ter sido crucial para maximizar a taxa de sobrevivência. Modelos genético populacionais para a evolução humana que incluem dados geográficos tem sido considerados de grande potencial na busca de variações genéticas sob a ação da seleção natural (Handley e cols., 2007). Desde que publicamos nosso estudo de 2005 (Estudo 2) sugerindo um efeito da latitude no cronotipo modulado pelo gene Per3 se iniciou o debate sobre uma possível pressão seletiva sobre os polimorfismos em genes relógio em humanos. Num estudo realizado por Nadkarni e cols. (2005), os autores não encontraram evidências de que o comprimento do dia ou a média anual de insolação possa ter contribuído como pressão seletiva no polimorfismo VNTR do gene Per3 em humanos. Todavia foi observado um padrão de distribuição genotípico diferente associado a cada etnia, além disso, os autores descrevem distribuições de freqüências gênicas invertidas para populações aborígines da Austrália que vivem próximos a linha do equador, nestas populações o alelo Per3 5 é mais freqüente. Nenhuma população aborígene brasileira foi ainda estudada com relação para este polimorfismo.

78 Outro estudo abordando este tema (Ciarleglio e cols. 2008) investigou cinco amostras de populações originárias de diferentes latitudes e ambientes para vários polimorfismos nos genes relógio. O estudo revelou diferença significativa entre as populações para as freqüências genotípica, alélica e haplotípica nos genes relógio, mas sugere que tais diferenças são mais um efeito da deriva genética ou possivelmente um efeito de fundador, mas não seleção natural. Por outro lado, Cruciani e cols. (2008), num estudo sobre o gene Per2 que incluiu onze amostras populacionais, originárias de cinco continentes diferentes sugerem que há evidência de seleção natural para este lócus no caminho de saída dos nossos ancestrais da África. Com base em nossos achados, bem como de outros autores (Ciarleglio cols., 2008; Cruciani e cols., 2008; Nadkarni e cols.., 2005) e na historia de migrações do ser humano pelo mundo ao longo da nossa história evolutiva e levando em consideração as características peculiares de insolação e luminosidade inerentes a diferentes lugares na terra, questiona-se; quais fatores contribuíram para que tais variações genéticas tornassem próprias de cada etnia, especialmente com relação aos genes relógio? Os fatores ambientais associados à latitude são fortes candidatos. Um aspecto interessante sobre padrões étnico-específicos de variações nos genes relógio é que se, como colocamos a princípio, o mecanismo molecular de temporização circadiano está associado ao período endógeno (τ) poderíamos inferir que haveria diferenças médias significativas de τ entre etnias. Este fato foi observado em estudo recente (Smith e cols. 2009) no qual os autores relatam diferenças étnicas no tamanho do τ e no deslocamento da fase circadiana em humanos sob protocolos de avanço e atraso de fase.

79 Outro fato muito interessante relativo à evolução dos genes relógio é que o VNTR do gene Per3 está presente somente em primatas, segundo a análise que fizemos (estudo 8), fato que levanta a questão sobre o papel deste VNTR no processo evolutivo desta Ordem e sugere que esta região gênica confere alguma característica especial ao sistema de temporização circadiano primata. Características como diurnalidade e visão a cores são candidatos comportamentais e fisiológicos possivelmente associados ao papel deste gene, particularmente o VNTR, embora não existam ainda outros estudos sobre o tema. Encontramos o VNTR em todos os primatas antropóides analisados por nós, embora o número de repetições se apresente razoavelmente diferente de espécie para espécie. Foi possível verificar que embora haja diversificação do número de repetições, em geral analisando os primatas como um todo, este número se mantém entre três e quatro repetições (Figura 10). Com relação às espécies de macacos do novo mundo (Platirrinos), a variação no tamanho do VNTR é bem mais diversificada (de 2 a 11 repetições) que nos Catarrinos (3 a 5 repetições). Deste quadro geral destaca-se que entre os platirrinos, o gênero Saguinus apresenta maior variedade do tamanho ou número de repetições do VNTR (de três a onze repetições) e o gênero Aotus tem o menor número de repetições, duas. O VNTR não está presente na subordem Strepsirhini (lêmures em geral) e nos haplorrinos tarsiiformes (Társios). Todos os primatas estudados, e só os primatas entre todos os mamíferos, apresentam dois elementos transponíveis (TE) flanqueando a região do éxon 18 no qual o VNTR está contido (para apreciação geral da arvore filogenética dos primatas veja a tabela 6).

80 Tabela 6. Àrvore filogenética geral dos primatas mostrando os grandes grupos e algumas espécies estudadas no estudo 8. A partir dos dados descritos acima sobre a composição do VNTR nas diferentes espécies de primatas podemos destacar três fatos importantes que sugerem um possível papel do VNTR na alocação temporal do comportamento circadiano do sono/vigília dos primatas: 1) As espécies do gênero Saguinus apresentam maior diversidade no VNTR e vivem em áreas comuns no oeste da Amazônia o que é sugestivo de especiação simpátrica neste gênero, ou seja, é possível que estas espécies vivam no mesmo local, mas tenham evoluído ocupando nichos temporais diferenciados. É uma hipótese a ser testada e 2) o único gênero de macacos noturnos já descritos, o gênero Aotus, apresenta o menor número de repetições no VNTR entre os primatas antropóides e os primatas da subordem Strepsirhini (lêmures em geral) e os haplorrinos tarsiiformes, que também são animais noturnos, não apresentam o VNTR. 3) Os TEs flanqueando o éxon 18 estão presentes em todos os primatas, inclusive nos primatas noturnos que não carregam o VNTR em seus genomas. Isto sugere que a inserção dos TEs no genoma do