Colonização e efeitos no ecossistema digestivo de camundongos gnotobióticos de uma cultura comercial (BIOVICERIN ) de Bacillus cereus

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1 REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN Volume 1 - Número Colonização e efeitos no ecossistema digestivo de camundongos gnotobióticos de uma cultura comercial (BIOVICERIN ) de Bacillus cereus Juliana Libânio Bittencourt [1]; Jacques R. Nicoli [2]; Francisco J. Pena ; Dr. Mário C. Vieira; Antônio P. Ribeiro Sobrinho [2]; Rosa M.E. Arantes RESUMO Probióticos são preparações contendo células microbianas vivas que quando ingeridos promovem efeitos benéficos ao nível do ecossistema gastrointestinal do homem ou de animais. O objetivo do trabalho foi testar um possível probiótico comercial, o BIOVICERINÒ. Este produto seria uma cultura viva de Bacillus cereus esporulado indicado para tratamento de enterocolites. Nos testes de viabilidade e enumeração de bactérias, houve crescimento da cultura, porém o número de células viáveis estava abaixo do indicado na composição do produto. Testes de antagonismo "in vitro" não demonstraram halo de inibição do Bacillus contra algumas bactérias enteropatogênicas (Salmonella typhimurium, Shiguella flexneri, Escherichia coli). Quando inoculado por via oral em camundongos sem germes, o Bacillus conseguiu resistir às condições do trato gastrointestinal, se instalou em altos níveis populacionais e não provocou sinais clínicos. Foram realizados testes "in vivo" em animais monoxênicos, desafiados com um inóculo de Salmonella typhimurium. Apesar do Bacillus não ter antagonizado esse patógeno no trato digestivo, os animais não apresentaram os sintomas clínicos típicos da Salmonellose. Em conclusão, essa cepa de Bacillus consegue sobreviver e multiplicar-se no trato digestivo de camundongos gnotobióticos e num ensaio preliminar parece proteger os animais contra uma infecção experimental por Salmonella. Contudo, pelo conhecido envolvimento do B. cereus em gastrointerites, a real identidade ao nível de espécie dessa bactéria deverá ser bem definida por métodos seguros antes de se pensar num possível uso clínico. Palavras-chave:Salmonella typhimurium, Shiguella flexneri, Escherichia coli, probióticos, Salmonellose. ABSTRACT Probiotics are preparations of non-pathogenic microrganisms that promotes beneficial effects to the host. The aim of this work was to test a commercial probiotic containing a Bacillus (BIOVICERINÒ ), which is indicated for handling chronic and acute enterocolites, against the pathogenic strains of Salmonella Typhimurium, Shigella flexneri and Escherichia coli. Our results have shown no antagonism in vitro of probiotic against the pathogens since no inhibition zone was observed in the used conditions. For evaluation of ecological protection in intestines, GF mice were monoassociated with the probiotic in a single inoculum ten days before challenge with S. Typhimurium. The probiotic was shown

2 to resist the conditions of the gastrointestinal tract and survived in high population levels in intestines. We found a higher survival of the experimental group monoassociated with the probiotic when compared to the control GF group but similar population levels of Salmonella in the feces of both groups. In conclusion, the probiotic BIOVICERINÒ showed a protection against an experimental infection with Salmonella Typhimurium which was not due to reduction of Salmonella in intestines. Key-words:Salmonella typhimurium, Shiguella flexneri, Escherichia coli, probiotics, nonpathogenic microrganisms. 1 - INTRODUÇÃO Probióticos Os probióticos podem ser definidos como preparações microbianas vivas que quando ingeridas afetam beneficamente o ecossistema digestivo do hospedeiro animal ou humano melhorando os aspectos da proteção ecológica, imunomodulação e contribuição nutricional (Penna et al, 2000). Dentre os principais mecanismos de ação propostos para a proteção ecológica e imunomodulação, destacam-se: a) o antagonismo pela produção de substâncias que inibem ou matam o patógeno (Vandenberg, 1993); b) a imunomodulação do hospedeiro, aumentando a resistência à infecção (Neumann et al., 1998; Podoprigora et al., 1999; Rodrigues et al., 2000) c) a competição por sítio de adesão ou fonte nutricional com o patógeno (Bernet et al., 1994) d) inibição da produção ou ação de toxinas bacterianas (Czerucka et al., 1994; Brandão et al., 1998) A lista dos probióticos comercializados ou estudados é longa e podemos nos limitar àqueles bem identificados como: 1. Lactobacillus, principalmente as espécies lactis, bulgaricus, plantarum, casei, fermentum e acidophilus (Neumann et al., 1998) 2. Escherichia coli (Lima Filho et al., 2000; Figueiredo et al., 2001) 3. Enterococcus das espécies faecium e faecalis (Maia et al., 2001) 4. Bifidobacterium das espécies bifidum, infantis e longum (Podoprigora et al., 1999; Silva et al., 1999) 5. Bacillus das espécies subtilis e toyoi 6. Saccharomyces sp. (Dias et al., 1995; Rodrigues et al., 1996; Peret et al., 1998) Existe hoje um número grande de probióticos comercializados na forma de preparações farmacêuticas para uso em medicina humana (Floratil, Lacteol, Symbioflor, Bificol, etc) e veterinária (Vitacanis, Biocanis, Levucell, etc) e também como alimentados fermentados vendidos por várias indústrias alimentares (Yakult, Nestlé, Danone, Batavo, Parmalat). Alguns são incorporados nas rações animais (Paciflor). Os microrganismos utilizados

3 como probióticos podem ser oriundos do ecossistema digestivo humano ou animal (Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium, Escherichia coli) ou não (Saccharomyces, Bacillus) Bacillus como Probiótico 2 - OBJETIVOS Existem poucas cepas bacterianas do gênero Bacillus que foram estudadas, testadas em ensaios clínicos ou comercializadas como probióticos. A mais conhecida é comercializada com o nome Bactisubtil (Merell) e contém uma cepa proveniente do Instituto Pasteur de Paris (IP 5832) que foi identificada como uma variante menor de Bacillus subtilis, situando-se entre esta espécie e o B.cereus, as duas bactérias pertencentes ao grupo I de Smith, Gordon e Clark. O produto foi testado há bastante tempo em ensaios clínicos com recém-nascidos (Ganczarski et al., 1960; Vandekerkove, 1979). Mais recentemente foi também utilizado em veterinária (Lestradet, 1995). Contudo, foram descritos casos de bacteremia com seu uso (Richard et al., 1988), mas em pacientes cancerosos submetidos a uma quimioterapia intensiva para os quais os probióticos não são indicados. Enfim, não se deve esquecer que o B.cereus é envolvido como agente etiológico em casos de síndrome gastrointestinal e por isto procurado como possível patogênico nas análises microbiológicas de alimentos (Pelczar et al., 1981) Objetivo Geral Avaliar o probiótico Biovicerin na sua capacidade de sobreviver em um ecossistema digestivo, de provocar danos histopatológicos para o hospedeiro e/ou de protegê-lo contra um desafio bacteriano patogênico em camundongos gnotoxênicos Objetivos Específicos - Avaliar a capacidade do componente bacteriano do probiótico Biovicerin de colonizar o trato digestivo de camundongos gnotobióticos. - Avaliar possíveis danos histológicos do intestino delgado, linfonodos mesentéricos, baço e fígado de camundongos gnotobióticos tratados com o componente bacteriano do probiótico Biovicerin. - Avaliar a mortalidade de camundongos gnotobióticos tratados (grupo experimental) ou não (grupo controle) com Biovicerin e desafiados, via oral, com Salmonella enterica subsp. enterica var. Typhimurium. - Avaliar os danos histológicos do intestino delgado, linfonodos mesentéricos, baço e fígado de camundongos gnotobióticos controles e experimentais. - Avaliar as inter-relações populacionais entre o componente bacteriano do probiótico Biovicerin e/ou Salmonella enterica subsp. enterica var. Typhimurium no trato digestivo de camundongos gnotobióticos controles e experimentais.

4 3 - MATERIAL E MÉTODOS Animais Foram utilizados camundongos NIH isentos de germes com dias de idade, dos dois sexos, provenientes de matrizes da TACONIC (Germantown, NY, USA). Estes receberam água e ração comercial (Nuvilab, Curitiba, PR) ad libitum, esterilizadas pelo calor úmido, sendo manuseados assepticamente (PLEASANTS, 1974) e foram mantidos em isoladores tipo Trexler (Standard Safety Equipment Co., Pallatine, IL, USA) até o desmame. Os animais foram, então, transferidos para microisoladores (UNO Roestvaststaal, BV, Zevenaar, The Netherlands) para os experimentos Microrganismos Origem: A linhagem patogênica de Salmonella enterica subsp. enterica var. Typhimurium foi isolada na Fundação Ezequiel Dias (FUNED, Belo Horizonte, MG) e o probiótico Biovicerin foi fornecido pelo laboratório Geyer Medicamentos S.A. (Porto Alegre, RS) na forma de suspensão contendo 10 6 esporos/ml do Bacillus cereus. Manutenção das linhagens: O patógeno utilizado será mantido em 0,5 ml de uma solução aquosa de glicerina 80% esterilizada por calor úmido, com 0,5ml da cultura de 18 h em caldo BHI (Brain Heart Infusion, BIOBRÁS) e estocadas à 70 o C. O probiótico Biovicerin será mantido na geladeira Tratamento e desafio experimental Para os objetivos 1 e 2, um grupo de 5 camundongos isentos de germes foi tratado com um inóculo único de 0,1ml da suspensão de Biovicerin por via orogástrica e mantido por um mês em monoassociação antes do seu sacrifício por inalação com éter. Um grupo controle de 5 animais sem germes servirá de controle. Para os objetivos 3,4 e 5, os animais gnotobióticos do grupo experimental (10 animais) serão tratados com um inoculo único de 0,1ml da suspensão de Biovicerin por via orogástrica, 10 dias antes do desafio experimental pela bactéria patogênica. O grupo controle gnotobiótico (10 animais) recebeu PBS durante o período de tratamento, de acordo com o esquema seguido para seu par experimental Mortalidade e Histopatologia A mortalidade de camundongos gnotobióticos foi avaliada 15 dias após o desafio experimental por S. enteritidis var. typhimurium nos grupos controles e experimentais. Os animais que sobreviveram às infecções foram sacrificados por inalação com éter e encaminhados para exames histopatológicos. Para os objetivos 2 e 4, amostras do intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo), ceco e intestino grosso (porções ascendente, transversal e descendentes), baço, fígado e linfonodos mesentéricos dos animais foram dissecadas e fixadas em formalina 10%, inclusas em parafina e cortes de 3-5

5 µm de espessura serão corados por hematoxilina-eosina. A especialista (Dra. Rosa M.E. Arantes, Departamento de Patologia Geral, ICB, UFMG), sem a revelação dos códigos até a apresentação dos laudos Enumeração microbiana Os níveis populacionais do componente bacteriano no produto Biovicerin foram confirmados por enumeração em placas de ágar BS encubados à 37 o C durante 24 h. O ágar BS tem a seguinte composição em g/l: extrato de carne 8,0; extrato de levedura 2,0; MnSO 4 0,04; ágar 20,0 com ph ajustado em 6,3. Camundongos gnotobióticos tratados com o componente bacteriano do probiótico Biovicerin tiveram os níveis populacionais da bactéria determinados por contagem nas fezes dos animais 5 e 10 dias após a inoculação. As fezes recolhidas sob estimulação anal, pesadas, submetidas a diluições decimais e 0,1 ml das diluições foram adicionados a placas contendo ágar BS incubadas em estufa à 37 o C/24 h para enumeração das bactérias. Camundongos gnotobióticos tratados com o componente bacteriano do probiótico Biovicerin e desafiados com S. enteritidis var. typhimurium tiveram seus níveis bacterianos populacionais determinados por contagens nas fezes dos animais no primeiro, terceiro, quinto, sétimo, nono, décimo-primeiro, décimo-terceiro e décimo-quinto dias após o desafio com o patógeno, nos grupos controles e experimentais. As fezes foram recolhidas sob estimulação anal, pesadas, submetidas a diluições decimais e 0,1ml das diluições foram adicionados á placas contendo ágar MacConkey e/ou ágar BS incubadas em estufa á 37 o C/24 h para enumeração das bactérias Estatística Os significados estatísticos dos resultados obtidos foram avaliados dependendo do caso, com a utilização do teste "t" de Student ou do teste exato de Fisher. Na realização dos testes descritos acima foi utilizado o programa EPISTAT (T.X. Gustafson, Round Rock,TX USA). O nível de significância foi determinado com p, 0, RESULTADOS E DISCUSSÃO Enumeração e viabilidade do produto Primeiramente foram realizados testes de viabilidade e enumeração de bactérias no produto comercial utilizando um meio de cultura adequado para crescimento de Bacillus. Houve crescimento, porém o número de células viáveis estava abaixo do indicado na composição do produto que afirmava ser constituído exclusivamente por cultura viva de Bacillus cereus esporulados na proporção de 5 milhões de esporos por flaconete. A enumeração indicava uma concentração de 10 ufc/ml.

6 4.2 - Antagonismo "in vitro" O teste denominado "in vitro" foi feito em ágar MacConkey e ágar BHI (MERCK) a partir de microgotas (5 microlitros) de Bacillus cereus ativado em Caldo BHI por 18 horas à 37 o C. As placas com microgotas foram incubadas em estufa à 37 o C por 48 horas. Após este período, as placas foram retiradas e, na posição invertida, em cada tampa, foi colocado 1 ml de clorofórmio. Depois de 20 minutos as placas foram abertas para evaporação do restante de clorofórmio. Inocularam-se então 3,5 ml de BHI semi-sólido (aquecido à 56 o C e resfriado na hora do inóculo) adicionados de 100 microlitros de cada uma das culturas patogênicas (bactérias reveladoras: S. Typhimurium, S. flexneri e E. coli) previamente ativadas em Caldo BHI por 18 horas à 37 o C. Em seguida as placas foram incubadas á 37 o C por horas. Após este período foi feita a leitura da presença ou ausência de halo (Mayr-Harting et al., 1972; Tagg et al., 1976) Colonização do trato digestivo Em seqüência foram feitos testes "in vivo" em camundongos sem germes inoculados por via oral. O Bacillus conseguiu resistir ás condições do trato gastrointestinal e se instalou em altos níveis populacionais no ecossistema digestivo atingindo uma concentração de 4,9 x 10 7 ufc/g. No período testado não provocou sinais clínicos nos animais monoassociados Antagonismo "in vivo" Posteriormente, foram realizados testes "in vivo" em animais monoxênicos, desafiados com um inóculo de Salmonella Typhimurium. Apesar do Bacillus não ter antagonizado esse patógeno no trato digestivo, os animais não apresentaram os sintomas clínicos típicos da Salmonellose. No 5 o dia a Salmonella atingiu níveis populacionais de 1,4 x 10 7 ufc/g e o B. cereus de 0,1 x 10 7 ufc/g e no 10 o dia a Salmonella atingiu 15,5 x 10 7 ufc/g e o B. cereus de 18,7 x 10 7 ufc/g, como mostra o gráfico a seguir.

7 4.5 - Perspectiva 5 - BIBLIOGRAFIA Em conclusão, essa cepa de Bacillus consegue sobreviver e multiplicar-se no trato digestivo de camundongos gnotobióticos e num ensaio preliminar parece proteger os animais contra uma infecção experimental por Salmonella. Essa proteção não parece estar ligada a um antagonismo populacional e outros mecanismos (ex: imunomodulação) podem estar envolvidos. Contudo, pelo conhecido envolvimento do B.cereus em gastrointerites, a real identidade ao nível de espécie dessa bactéria deverá ser absolutamente bem definida por métodos seguros antes de se pensar num possível uso clínico. BERNET; MF, BRASSART D; NEESER, JR; SERVIN, A.L. Lactobacillus acidophilus LA1 binds to human intestinal cell lines and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent bacteria. Gut, 35: , BRANDÃO, R.L.; CASTRO, I.M.; BAMBIRRA, E.A.; AMARAL, S.C.; FIETTO, L.O.; TROPIA, M.J.M.; NEVES, M.J.; SANTOS, R.G.; GOMES, N.C.M.; NICOLI, J.R.. Intracellular signal triggered by cholera toxin in Saccharomyces boulardii and Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environm. Microbiol., 64: , CZERUCKA, D.; ROUXL, I; RAMPAL, P. Saccharomyces boulardii inhibits secretaguogemediated adenosine 3`,5`- cyclic monophosphate induction in intestinal cells. Gastroenterology, 106: 65-72, DIAS, R.S.; BAMBIRRA, E.A.; SILVA, M.E.; NICOLI, J.R. Protective effect of Saccharomyces boulardii against the cholera toxin in rats. Braz.J.Biol.Med.Res., 28: , FIGUEIREDO, P.P.; VIEIRA, E.C.; NICOLI, J.R.; NARDI, R.D.; RAIBAUD, P.; DUVAL- IFLAH Y; PENNA, F.J. Influence of oral inoculation with plasmid-free human Escherichia coli on the frequency of diarrhea during the first year of life in human newborns. J.Pediatr.Gastroenterol. Nutr., 33: 70-74, GANCZARSKI, A; SCROCZINSKI, K.; BROZIK, H; GOLSTEIN, L.; KOWALSKA, D.; LIPINSKA, I; NAREMBSKA, E; MIKUCKI, J.; RADZIKOWSKA, H. Modifications de la flore intestinale par le Bacillus subtilis (Sp 5832). Gaz.Med.France, 67: , LESTRADET, H. Probiotiques: le Bacillus CIP 5832 chez l`homme et l`animal. Med.Chirurg. Dig., 24: 37-39, LIMA FILHO, J.V.M.; VIEIRA, E.C.; NICOLI, J.R. Antagonistic effect of Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces boulardii and Escherichia coli combinations against experimental infections with Shigella flexneri and Salmonella enteritidis subsp.typhimurium. J. Appl. Microbiol., 88: , MAIA, O.B.; DUARTE, R.; SILVA, A.M.; CARA, D.C.; NICOLI, J.R. Evaluation of the components of a commercial probiotic in gnotobiotic mice experimentally challenged with Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium. Vet. Microbiol., 79: , NEUMAN, E.; OLIVEIRA, M.A.P.; CABRAL, C.M.; NICOLI, J.R.; VIEIRA, E.C; CARA, D.C.; VIEIRA, L.Q. Monoassociation with Lactobacillus acidophilus UFV- H 2 B 20 stimulates the phagocytic system of germfree mice. Braz. J. Med. Biol. Res., 31: , PELCZAE, M.; REID, R.; CHAN, E.C.S. Microbiologia, V2, McGraw-Hill do Brasil, 1072p, PENNA, F.J.; PÉRET FILHO, L.A.; CALÇADO, A.C.; RIBEIROJr., H.; NICOLI, J.R. Bases experimentais e Clínicas atuais para o emprego dos probióticos. J.Pediatr., 76: , 2000.

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