Paulo: Encyclia patens Hook., Phymatidium delicatulum Lindl. e. Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay. Paulo Roberto de Medeiros Cabral

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA Biologia reprodutiva e polinização de orquídeas nativas do estado de São Paulo: Encyclia patens Hook., Phymatidium delicatulum Lindl. e Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay. Paulo Roberto de Medeiros Cabral Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: Entomologia. Ribeirão Preto-SP 2014

2 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA Biologia reprodutiva e polinização de orquídeas nativas do estado de São Paulo: Encyclia patens Hook., Phymatidium delicatulum Lindl. e Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay. Paulo Roberto de Medeiros Cabral Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: Entomologia. Orientador: Prof. Dr. Emerson Ricardo Pansarin Ribeirão Preto-SP 2014

3 Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada à fonte. Cabral, Paulo Roberto de Medeiros Biologia reprodutiva e polinização de orquídeas nativas do estado de São Paulo: Encyclia patens Hook., Phymatidium delicatulum Lindl. e Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay.. Ribeirão Preto, p. Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Entomologia. Orientador: Emerson Ricardo Pansarin 1. Fragrância floral. 2. Flores nectaríferas. 3. Autocompatibilidade. 4. Óleo comestível. 5. Protandria.

4 Paulo Roberto de Medeiros Cabral Biologia reprodutiva e polinização de orquídeas nativas do estado de São Paulo: Encyclia patens Hook., Phymatidium delicatulum Lindl. e Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay. Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento Universidade de São Paulo-USP. Profª. Drª. Helena Maura Torezan Silingardi Universidade federal de Uberlândia. Prof. Dr. Emerson Ricardo Pansarin Universidade de São Paulo-USP (Orientador) Ribeirão Preto-SP 2014

5 O correr da vida embrulha tudo, a vida é assim: esquenta e esfria, aperta e daí afrouxa, sossega e depois desinquieta. O que ela quer da gente é coragem. O que Deus quer é ver a gente aprendendo a ser capaz de ficar alegre a mais, no meio da alegria, e inda mais alegre ainda no meio da tristeza! Só assim de repente, na horinha em que se quer, de propósito-por coragem. Será? Era o que eu às vezes achava. Ao clarear do dia. Guimarães Rosa, Grande Sertão Veredas

6 Agradecimentos Agradeço imensamente às instituições que financiaram este trabalho: CNPq, pela bolsa de mestrado e o PROAP pelo auxílio a mim concedido. E às instituições ambientais que permitiram a realização dos trabalhos de campo: Secretaria do Meio Ambiente do Estado de São Paulo, Administraçaõ da Reserva biológica Serra do Japi por me receber, oferecendo hospedagem e Parque Estadual de Vassununga. Ao Prof. Dr. Emerson Ricardo Pansarin, que com dedicação e paciência me orientou durante o desenvolvimento deste projeto. À Dra. Ludmila Mickeliunas Pansarin, pelo auxílio ao longo dessa pesquisa e pela contribuição na minha formação. Ao Prof. Dr. Leonardo Gobbo, por nos receber no seu laboratório nas realizações das nossas análises de fragrância. Agradeço também a sua aluna Maria Elvira por fazer as análises de fragrância e identificação dos compostos. Ao Prof. Dr. Eduardo Andrade Botelho de Almeida. Também ao Dr. Sidnei Matheus por nos ajudar com a identificação das abelhas. À Renta e à Vera pelapaciência, competência, carinho e instruções que nos deixa seguros e queridos. Aos amigos do laboratório Carol, Bruno, Bruno (Tolima), Evelyn, Luciano e João. À minha família, em especial a minha mãe, Maria, que foi e continua sendo minha maior força e segurança. À minha noiva Ana Paula, que foi muito importante para meu equilíbrio na finalização do trabalho, sempre paciente nos momentos difíceis e me fazendo feliz. À minha sogra, Neide, pelos bons momentos e conselhos. Aos meus grandes amigos Eduardo e Paulo pelas boas discussões cientificas. Ao amigo Bruno, pelas discussões científicas, quanto pela amizade e companheirismo.

7 A todos os docentes e funcionários do Departamento de Biologia da FFCLRP, em especial àqueles que compõem o Programa de Pós-Graduação em Entomologia

8 Sumário Lista de figuras...8 Lista de Tabelas...10 Resumo...12 Abstract...15 Introdução geral...17 Referêcnias bibliográficas...21 CAPÍTULO 1: Biologia reprodutiva de Encyclia patens Hook. (Laeliinae: Orchidaceae)...24 Resumo...26 Abstract...27 Introdução...28 Material e Métodos...30 Resultados...35 Discussão...42 Conclusão...46 Referências bibliográficas...47

9 CAPÍTULO 2: Autocompatibilidade e polinização por abelhas Tapinotaspidini no gênero com oferta de óleo, Phymatidium Lindl. (Orchidaceae: Oncidiinae)...54 Resumo...55 Abstract...56 Introdução...57 Material e Métodos...59 Resultados...62 Discussão...66 Conclusão...69 Referências bibliográficas...70 CAPÍTULO 3: Biologia reprodutiva, polinização e protandria em Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay (Orchidaceae: Spiranthinae)...77 Resumo...78 Abstract...79 Introdução...80 Material e Métodos...82 Resultados...87 Discussão...97

10 Conclusão Referências bibliográficas Considerações finais Anexos...112

11 Lista de figuras CAPÍTULO 1: Biologia reprodutiva de Encyclia patens Hook. (Laeliinae: Orchidaceae). FIGURA 1: Compostos voláteis detectados na fragrância floral de Encyclia patens...37 FIGURA 2. A, Corte longitudinal da região do cunículo. B, Corte transversas região do cunículo com reagente de Fehling. C, Corte transversal do cunículo com vermelho de Rutênio. D, Vespa Polybia ignobilis. E, Mosca Syrphidae...39 CAPÍTULO 2: Autocompatibilidade e polinização por abelhas Tapinotaspidini no gênero com oferta de óleo, Phymatidium Lindl. (Orchidaceae: Oncidiinae). FIGURA1. A, Inflorescência. B, Abelha Trigonopedia Moure 1941 coletando óleo no labelo...65 CAPÍTULO 3: Biologia reprodutiva, polinização e protandria em Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay (Orchidaceae: Spiranthinae). FIGURA 1: Compostos voláteis detectados na fragrância floral de Mesadenella cuspidata...90 FIGURA 2: Protandria em Mesadenella cuspidata. Flores em vista lateral, frontal e cortes longitudinais em diferentes fases sexuais. A-C, Fase masculina. B-D, Fase feminina. E, Corte lateral na fase masculina. F, Corte lateral na fase feminina

12 FIGURA 3: A, Glândula de néctar. B, Corte transversal das glândulas de néctar. C, Abelha Osiris Smith D, Abelha Augochlorella tredecim Vachal E, Abelha Rhathymus friese Ducke F, Abelha operária da tribo Meliponini pilhando néctar

13 Lista de Tabelas CAPÍTULO 1: Biologia reprodutiva de Encyclia patens Hook. (Laeliinae: Orchidaceae). TABELA 1: Variação, Média (X) e desvio padrão (DP) das estruturas florais de Encyclia patens na população de estudo...38 TABELA 2: Resultados sobre o sistema reprodutivo de Encyclia patens: porcentagem de frutos desenvolvidos nos tratamentos manuais de polinização; quantidade de frutos desenvolvidos em polinização aberta no ano de 2013 e 2014; porcentagem de sementes potencialmente viáveis obtidas nos tratamentos de polinização cruzada e autopolinização...41 CAPÍTULO 2: Autocompatibilidade e polinização por abelhas Tapinotaspidini no gênero com oferta de óleo, Phymatidium Lindl. (Orchidaceae: Oncidiinae). TABELA 1. Resultados obtidos nos testes sobre o sistema reprodutivo de Phymatidium delicatulum: porcentagem de frutos oriundos dos tratamentos manuais; quantidade de frutos desenvolvidos em condições naturais; portecentagem de sementes potencialmente viáveis obtidas nos tratamentos manuais...64 CAPÍTULO 3: Biologia reprodutiva, polinização e protandria em Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay (Orchidaceae: Spiranthinae). TABELA 1: Variação, Média (X) e desvio padrão (DP) das estruturas florais de Mesadenella cuspidata na população

14 TABELA 2: Resultados alcançado sobre o sistema reprodutivo de Mesadenella cuspidata; porcentagem de frutos formados nos tratamentos manuais; quantidade de frutos desenvolvidos em polinização aberta no ano de 2013 e 2014; porcentagem de sementes potencialmente viáveis oriundas dos frutos desenvolvidos nos tratamentos de manuais

15 Resumo A família Orchidaceae A. Juss. pertence a ordem Asparagales e é considerada uma das maiores famílias de plantas com flores. Com distribuição cosmopolita, sua maior diversidade e abundâcia são observadas nas florestas tropicais e subtropicais úmidas. No Brasil, estima-se que ocorram cerca de espécies que podem ser encontradas em todos os seus biomas. Entretanto, a Mata Atlântica é considerada a mais rica em números de espécies. Encyclia patens Hook., é uma espécie epífita endêmica do Brasil e apresenta ampla distribuição geográfica, ocorrendo no nordeste, sudeste e sul do país. A sua biologia reprodutiva foi estudada no município de São Simão, no noroeste do estado de São Paulo. A espécie produz inflorescências paniculiforme apicais e flores nectaríferas que exalam uma fragrância adocicada composta por 10 substâncias. Suas flores, que apresentam coloração verde e púrpura, abrem nos meses de junho a agosto e, quando intactas, permanecem abertas por até 21 dias. O néctar produzido por elas é secretado em uma cavidade nectarífera chamada de cunículo. Contudo, não foram observados os polinizadores de Encyclia patens. Apenas vespas sociais da espécie Polybia ignobilis Haliday 1836 e também moscas da família Syrphidae foram observados como visitantes florais. Encyclia patens é autocompatível. Entretanto, não autógama e dependente de um polinizador, uma vez que os frutos formados foram exclusivamente dos tramentos de autopolinização manual (100%) e polinização cruzada (93,3%). A taxa de sementes potencialmente viáveis dos frutos provenientes destes tratamentos foi de 57,93% para autopolinização manual e 82,52% para polinização cruzada. Em condições naturais, a população estudada apresentou uma taxa de frutificação de 0,28%. Phymatidium delicatulum Lindl. é uma espécies com hábito epifito endêmica do Brasil que ocorre no nordeste, sudeste e sul do país. Os estudos sobre a sua biologia reprodutiva foi desenvolvidos na Reserva Biológica Serra do Japi, no município de Jundiaí, estado de São Paulo. Phymatidium delicatulum corresponde a plantas muito 12

16 pequenas (ca. 5 cm), desprovidas de pseudobulbos. Suas inflorescências são racemosas e podem produzir até 17 flores que se abrem no verão, de dezembro a fevereiro e apresentam coloração predominantemente branca com calosidades verdes sobre o labelo, onde se localizam o elaióforos. O óleo produzido por elas é coletado por abelhas Tapinotaspidini (Tetrapedia amplitarsis Friese 1899 e Trigonopedia sp. Moure 1941), que atuam como seus polinizadores. Phymatidium delicatulum é uma espécie autocompatível e não autógama. Nos tratamentos manuais de autopolinização suas flores resultaram em 31,9% de frutos que apresentaram 57,93% de sementes potencialmente viáveis. Enquanto que nos tratamentos de polinização cruzada 54% das flores resultaram em frutos com uma porcentagem de 82,52% de sementes potencialmente viáveis. Em condições naturais a taxa de frutificação de Phymatidium delicatulum foi de 10,7%. Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay apresenta hábito terrícola. Essa espécie ocorre nas regiões sul e sudeste, ocorrendo também no centrooeste do Brasil. Os estudos sobre a sua biologia reprodutiva e polinização foram realizados na Reserva Biológica Serra do Japi, no município de Jundiaí, e no Parque Estadual de Vassununga, no município de Santa Rita do Passa Quatro, ambos no estado de São Paulo. Mesadenella cuspidata apresenta uma inflorescência racemosa apical com flores espiraladamente dispostas. Suas flores que são protândricas apresestam coloração branca e exalam uma fragrância adocicada composta por 16 voláteis diferentes. Além disso, elas apresetam um nectário em forma de bojo formado pela união das sépalas laterais e o labelo que armazena X= 1,43 ± 0,87 de néctar com uma concentração de X= 39,50% ± 5,98. O néctar produzido pelas suas flores é coletado por abelhas Augochlorella tredecim Vachal 191, Osiris sp. Smith 1854 e Rhathymus friese Ducke A espécie é autocompatível e não é autógama. As flores que foram submetidas à autopolinização manual resultaram em 66,6% de frutos e as que foram submetidas ao tratamento de polinização cruzada resultaram em 86,6%. A taxa de sementes potencialmente viáveis em frutos provenientes destes 13

17 tratamentos foi de 78,7% em autopolinização manual e 70,9% nos frutos de polinização cruzada. Em condições naturais, no ano de 2013 as flores resultaram em 74,1% de frutos e em 2014 a taxa de frutificação foi de 62,4%. Palavras-chave: fragrância floral, flores nectaríferas, autocompatibilidade, óleo comestível, protandria 14

18 Abstract The family Orchidaceae A. Juss. currently belongs to the order Asparagales and is considered one of the largest families among the flowering plants. With cosmopolitan distribution, its greater diversity and abundance are observed along tropical rainforest and subtropical forests. In Brazil, it is estimated are recorded ca species. Encyclia patens Hook., is an endemic to Brazil, occurring in the northeastern, southeastern and southern regions. The study on its reproductive biology was conducted in municipality of São Simão in the northwestern of state of São Paulo. Encyclia patens produce a paniculate inflorescence, which produces nectariferous flowers that emit a sweet fragrance composed of 10 different volatile compounds. Its flowes are green and purple. The flowering period occur from June to August and each flower lasts up to 21 days. The nectar produced is secreted in a nectar chamber called cuniculus. Does not were observed the pollinators of Encyclia patens. Only social wasps (Polybia ignobilis Haliday 1836) and Syrphidae flies were recorded as floral visitors. Encyclia patens is self-compatible. However, it is a pollinator-dependent species. Fruits were formed exclusively in self-polination (100%) and cross-pollination (93.3%) treatments. The tax of potentially viable seeds from fruits of these treatments was 57.93% in manual self-pollinations and 82.52% in manual cross-pollinations. Under natural conditions, the studied population the fruit set was 0.28%. Phymatidium delicatulum Lindl., occurs in the northeast, southeast and south of Brazil. Its reproductive biology was studied in the Biological Reserve of Serra do Japi, in Jundiaí, state of São Paulo. Phymatidium delicatulum produces racemose inflorescences with up to 17 flowers that open in the summer, from December to February. The flowers are white with a green callus on the lip, where by the elaiophores.the oil produced by its flowers is collected by Tapinotaspidini bees of the specie Tetrapedia amplitarsis Friese 1899 and bees of the genus Trigonopedia Moure The species is self-compatible and not autogamous. In the treatment of manual self-pollination 15

19 resulted in 31.9% of fruit set and presented 57.93% of potentially viable seeds. In crosspollinations 54% of flowers set fruits, with a percentage of 82.52% of potentially viable seeds. Under natural conditions the fructification tax of Phymatidium delicatulum was 10.7%. Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay occur in south, southeastern and central western Brazil. The reproductive biology and pollination of this species were studied in the Biological Reserve of Serra do Japi, in the municipality of Jundiaí and Parque Estadual de Vassunga, in the municipality of Santa Rita do Passa Quatro. Mesadenella cuspidata possesses an apical raceme with flowers arranged in spiral. Its flowers are protandrous, have white coloration and emit a sweet fragrance composed of 16 different substances. Moreover, they a nectary-shaped bunt forms by the union of the lateral sepals and the lip that produces X= 1.43 ± 0.87 nectar with a concentration of X= 39.50% ± The nectar produced by the flowers is collected by bees Augochlorella tredecim Vachal 1911, Osiris sp. Smith 1854 and Rhathymus friese Ducke Mesadenella cuspidate is self-compatible and not autogamous. The manual self-pollinations resulted in 66.6% of fruits and the crosspollination resulted in 86.6% of fruit set. The tax of potentially viable seeds from the fruits of these treatments was 78.7% in manual self-pollination and 70.9% in cross-pollination. Under natural conditions, the fruit set was 74.1% of fruit in 2013 flowering period and in 2014 the tax of fruit set was 62.4%. Key-words: floral fragrance, nectariferous flowers, self-compatibility, edible oil, protandry 16

20 Introdução geral A família Orchidaceae A. Juss. pertence a ordem Asparagales (Stevens 2001) e é considerada uma das maiores famílias de plantas com flores, compreendendo cerca de espécies distribuidas em 800 gêneros (Dressler1995). As orquídeas apresentam distribuição cosmopolita. No entanto, sua maior diversidade e abundâcia são observadas nas florestas tropicais e subtropicais úmidas (Dressler 2005). No Brasil, estima-se que ocorram aproximadamente espécies em 240 gêneros, que podem ser encontradas em todos os biomas (Barros et al. 2014). Todavia, a Mata Atlântica é considerada a mais rica em números de espécies (Pabst & Dungs 1975). A maior parte das espécies em Orchidaceae apresenta hábito epífito (Dressler 1993). Entretanto, na família é comum encontrar espécies que vivem sobre rochas (rupícolas), no solo (terrícolas) e em locais alagados (palustres). Além disso, há também espécies que não apresentam clorofila e vivem associadas a fungos micorrízicos (mico-heterotróficas). Além da diversidade de hábitos, as orquídeas apresentam diferentes estratégias relacionadas, basicamente, com a obtenção e reserva de água e nutrientes como caules intumescidos formando pseudobulbos, folhas carnosas, raízes dotadas de velame e o próprio crescimento em touceiras que permite o acúmulo de matéria orgânica, são algumas destas estratégias. Por outro lado, ao contrário dos órgãos vegetativos que podem apresentar grande diversidade estrutural, suas flores são relativamente uniformes quanto ao número e arranjo de suas partes. Geralmente, elas são zigomorfas e constituídas de três sépalas e três pétalas, sendo uma das pétalas diferenciada em uma estrutura denominada labelo. Os órgãos reprodutivos são fundidos em uma única estrutura, a coluna. A coluna apresenta uma ou mais raramente duas ou três anteras e uma região estigmática, formada pela fusão dos três lobos do estigma (Dressler 1981). 17

21 Na maioria das espécies, os grãos de pólen são reunidos em duas ou mais polínias, e estas, em conjunto com o viscídio (e estipe em alguns gêneros), que é a extremidade adesiva responsável pela fixação ao polinizador, constituem o polinário. O polinário, por sua vez, é separado do estigma por uma região denominada rostelo que tende a evitar a ocorrência de autopolinização espontânea de suas flores (Dressler 1993). Apesar de apresentar uma disposição estrutural uniforme, as flores das orquídeas possuem uma grande variação em detalhes estruturais, na forma e no tamanho dos componentes básicos, levando ao surgimento de estruturas muito complexas em algumas espécies (van der Pijl & Dodson 1966). Tal complexidade pode ser atribuída à importante relação entre as orquídeas e seus polinizadores, o que resulta em grande especialização e diversidade de sua morfologia floral (Dressler 1981, van der Pijl & Dodson 1966, Fay & Chase 2009), podendo existir co-evolução entre determinadas espécies e seus polinizadores (Pabst & Dungs 1975). Sendo assim, havendo mudanças significativas nas estruturas florais, nas características químicas ou fenotípicas das plantas, de modo recíproco podem ser catalisados pelos seus polinizadores ou vice-versa (van der Pijl & Dodson 1966). As orquídeas apresentam um número consideravelmente abundante de polinizadores não especializados que são raramente eficientes no sucesso da polinização de muitas espécies (Herrera 1989). A especialização floral para polinizadores específicos e a limitação na diversidade dos polinizadores é interpretada como propiciador na redução do custo de energia da planta no sucesso da transferência de pólen entre indivíduos (Tremblay 1992). Cerca de um terço das espécies das orquídeas não oferecem nenhum recurso aos seus polinizadores e a polinização ocorre por engano (Ackerman 1986). Além disso, algumas espécies são aptas a se reproduzirem sem o auxílio de veteros bióticos e se autopolinizam espontâneamente (e.g. Catling 1980, 1990, Catling & Catling 1991, Pansarin et al. 2008, 18

22 Aguiar et al. 2012). Considerando-se que em Orchidaceae a maioria das espécies é autocompatível (van der Pijl & Dodson 1966, Dressler 1981). Por outro lado, entre as espécies com recursos, o néctar é a principal recompensa oferecida aos polinizadores. No entanto, o polén, o pseudopólen, os óleos florais, as fragrâncias, as ceras (van der Pijl & Dodson 1966, Dressler 1993) e as substâncias viscosas semelhantes a resinas também são comumente encotradas (Davies et al. 2003). Essa grande variedade de recursos presentes nas orquídeas podem ser atribuídas à diversidade de glândulas florais como os nectários (Catling 1983, 1987, Singer & Sazima 1999, Pansarin et al. 2012, Cabral & Pansarin 2014), os elaióforos (Vogel 1974, Buchmann 1987, Mickeliunas et al. 2006, Pansarin & Pansarin 2011), os osmóforos (Pansarin & Amaral 2009, Pansarin et al. 2013) entre outras estruturas produtoras de recursos que podem ser encotradas nas suas flores (van der Pjil & Dodson 1966). O néctar, no entanto, é um composto explorado por vários grupos de animais como abelhas, vespas, moscas, borboletas, mariposas e aves como beija-flores e olho-branco (van der Pijl & Dodson 1966, Catling 1987, Dressler 1993, Singer & Cocucci 1999, Singer & Sazima 1999, 2000, Singer 2002, Micheneau et al. 2008). Entre os Hymenoptera, as abelhas principalmente, são consideradas o grupo mais importante de polinizadores das orquídeas, sendo responsável pela polinização de cerca de 60% de todas as espécies (van der Pijl & Dodson 1966). Ainda assim, menos freqüentes, porém não menos importantes outros animais também podem atuar como polinizadores das orquídeas. Em Grobya amherstiae Lindl., por exemplo, uma espécie nativa ocorrente no interior do estado de São Paulo, besouros foram observados polinizado suas flores (Mickeliunas et al. 2006). Além disso, em uma espécie do gênero Angraecum sp. (Angraeciinae), as flores são polinizadas por grilos (Micheneau et al. 19

23 2010). E na espécie Cymbidium serratum Schltr., o único registro de mamíferos, tendo ratos selvagens como visitantes florais (Wang et al. 2008). 20

24 Referências bibliográficas Ackerman, J.D Mechanisms and evolution of food-deceptive pollination systems in orchids. 1: Aguiar, J.M.R.B.V. Pansarin L.M. Ackerman J.D. & Pansarin E.R Biotic versus abiotic pollination in Oeceoclades maculata (Lindl.) Lindl. (Orchidaceae). Plant Species Biology. 27: Barros, F.D.E. Vinhos F. Rodrigues V.T. Barbarena F.F.V.A. Fraga C.N. Pessoa E.M. & Foster W Orchidaceae in Lista de Espécies da flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. ( Buchmann, S.L The ecology of oil flowers and their bees. Annual Review of Ecology and Systematics. 18: Cabral, P.R.M. & Pansarin E.R Biologia reprodutiva de Campylocentrum micranthum (Lindl.) Rolfe (Orchidaceae, Angraecinae). Submetido para publicação. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto-SP. Catling, P.M Pollination of Northeastern North American Spiranthes (Orchidaceae). Canadian Journal of Botany. 61: Catling, P.M Notes on the breeding systems of Saccoila lanceolata (Aublet) Garay (Orchidaceae). Annals of the Missouri Botanical Garden. 74: Catling, P.M. & Catling V.R A synopsis of breeding systems and pollination in North American orchids. Lindleyana. 6:

25 Davies, K.L. Turner M.P. & Gregg A A typical pseudopollen forming hairs in Maxillaria Ruiz & Pav. (Orchidaceae). Botanical Journal of the Linnean Society. 143: Dressler, R.L The Orchids: Natural History and Classification. Harvard University Press, Harvard, USA. 332p. Dressler, R.L Phylogeny and Classification of the Orchid Family. Timber Press, Portland, Oregon. USA. 314p. Dressler, R.L How many orchid species? Selbyana. 26: Garay, L.A On the origin of the Orchidaceae. Botanical Museum Leafly Harvard. University. 19: Herrera, C Pollinator abundance, morphology, and flower visitation rate: analysis of the quantity component in plant-pollinator system. Oecologia. 80: Mickeliunas, L. Pansarin E.R. & Sazima M Biologia floral, melitofilia e influência de besouros Curculionidae no sucesso reprodutivo de Grobya amherstiae Lindl. (Orchidaceae: Cyrtopodiinae). Revista Brasileira de Botânica. 29: Micheneau, C. Fournel J. Humeau L. & Pailler T Orchid-bird interactions: a case study from Angraecum (Vandeae, Angraecinae) and Zosterops (white-eyes, Zosteropidae) on Reunion Island. Botany. 86: Micheneau, C. Fournel J. Warren B.H. Hugel S. Gauvin-Bialecki A. Pailler T. Strasberg D. & Chase M.W Orthoptera, a new order of pollinator. Annals of Botany. 105: Pabst, G.F.J. & Dungs F Orchidaceae Brasilienses, v. 1. Kurt Schmersow, Hildesheim. 22

26 Pansarin, L.M. Pansarin E.R. & Sazima M Reproductive biology of Cyrtopodium polyphyllum (Orchidaceae): a Cyrtopodiinae pollinated by deceit. Plant Biology. 10: Pansarin, L.M. & Pansarin E.R Reproductive biology of Epidendrum tridactylum (Orchidaceae: Epidendroideae): a reward producing species and its deceptive flowers. Plant Systematics and Evolution. DOI /s Renner, S.S Rewardless flowers in the angiosperms and the role of insect cognition in their evolution. In Waser N.M. Orleton J. (eds) Plant-Pollinator Interactions from Specialization to Generalization, 1 st edn. The University of Chicago Press. Chicago. pp Singer, R.B The pollination biology of Sauroglossum elatum Lindl. (Orchidaceae: Spiranthinae): moth-pollination and protandry in neotropical Spiranthinae. Botanical Journal of the Linnean Society. 138: Singer, R.B. & Cocucci A.A Pollination mechanism in southern Brazilian orchids which are exclusively or mainly pollinated by halictid bees. Plant Systematic and Evolution. 217: Singer, R.B. & Sazima M The pollination mechanism in the Pelexia alliance (Orchidaceae: Spiranthinae). Botanical Journal of the Linnean Society. 131: Singer, R.B. & Sazima M The pollination of Stenorrhynchos lanceolatus (Aublet) L.C. Rich. (Orchidaceae: Spiranthinae) by hummingbirds in southeastern Brazil. Plant Systematics and Evolution. 223: Tremblay, R.L Trends in pollination ecology of the Orchidaceae: evolution and systematics. Canadian Journal Botany. 70:

27 Van der Pijl, L. & Dodson C.H Orchid flowers: their pollination and evolution. Florida: University of Miami Press. Vogel, S Ölblumen und ölsammelnde Bienen. Tropical und Subtropical Pflanzenwelt. 7: Vogel, S. & Cocucci A Pollination of Basitemon (Scrophulariaceae) by oil-collecting bees in Argentina. Flora. 190: Wang, Y. Zhang Y. Ma X. & Dong L The unique mouse-pollination in an orchid species. Nature Precedings. hdl:10101/npre

28 Capitulo 1 Biologia reprodutiva de Encyclia patens Hook. (Laeliinae: Orchidaceae). 25

29 Resumo Encyclia patens Hook., é uma espécie endêmica do Brasil que apresenta ampla distribuição geográfica, ocorrendo nas regiões nordeste, sudeste e sul do país. Os estudos sobre a sua biologia reprodutiva foram realizados no município de São Simão, no noroeste do estado de São Paulo. Essa espécie é epífita e produz inflorescências paniculiforme apicais e flores nectaríferas que exalam uma fragrância adocicada composta por 10 substâncias. Suas flores de coloração verde e púrpura se abrem nos meses de junho a agosto e, quando intactas, permanecem abertas por até 21 dias. O néctar produzido por elas é secretado em uma cavidade nectarífera, chamada cunículo. Não foram observados os polinizadores de Encyclia patens. Apenas vespas sociais da espécie Polybia ignobilis Haliday 1836 e também moscas da família Syrphidae foram observados como visitantes florais. Encyclia patens é autocompativel. Entretanto, não autógama e dependente de um polinizador, uma vez que os frutos formados foram exclusivamente dos tramentos de autopolinização manual (100%) e polinização cruzada (93,3%). A taxa de sementes potencialmente viáveis dos frutos provenientes destes tratamentos foi de 57,93% para autopolinização manual e 82,52% para polinização cruzada. Em condições naturais, a população estudada apresentou uma taxa de frutificação de 0,28%. Palavras-chave: Laeliinae, biologia floral, autocompatibilidade, fragrância floral, néctar. 26

30 Abstract Encyclia patens Hook., is endemic to Brazil, occurring in the Northeastern, Southeastern and Southern regions. The study on its reproductive biology was conducted in municipality of São Simão in the northwestern of state of São Paulo. This specie is epiphytic with paniculate apical inflorescence, which produces nectariferous flowers and that emits sweet fragrance composed of 10 different volatile compounds. The flowers are green and purple. The flowering period occur from June to August and each flower up to 21 days. The nectar produced is accumulated in a nectar chamber called cuniculus. Does not were observed the pollinators of Encyclia patens. Only social wasps (Polybia ignobilis Haliday 1836) and Syrphidae flies were recorded as floral visitors. Although the pollinators have not been observed, Encyclia patens is self-compatible. However, it is a pollinator-dependent species, since fruits were formed exclusively in self-polinition (100%) and cross-pollination (93.3%) treatments. The tax of potentially viable seeds from fruits of these treatments was 57.93% in manual self-pollination and 82.52% in manual cross-pollination. In natural conditions, the studied population the fruit set was 0.28%. Key-words: Laeliinae, floral biology, self-compatibility, floral fragrance, nectar. 27

31 Introdução A família Orchidaceae apresenta alguns dos mais intrigantes e complexos mecanisnos de polinização conhecidos, sendo as suas flores polinizadas por diversos grupos de insetos como Diptera, Lepidoptera, Coleoptera e Hymenoptera (van der Pijl & Dodson 1966, Dressler 1981). Entre as orquídeas, várias espécies atraem os insetos para as suas flores com a produção de fragrâncias florais que apresentam um papel importante na polinização. Tais compostos atuam como sinalizadores para os insetos que visitam suas flores em busca de algum recurso (van der Pijl & Dodson 1966, Singer 2002, Stökl et al. 2007, Humeneau et al. 2011). Suas flores produzem uma série de recursos como óleos florais, ceras, substâncias viscosas semelhantes a resinas e o néctar, composto considerado a principal recompensa oferecida aos seus polinizadores (van der Pijl & Dodson 1966, Davies et al. 2003). Tal composto pode ser produzido em estruturas secretoras como nectários florais (Cabral & Pansarin,dados não publicados), nectários extraflorais (Leitão et al. 2014), glândulas nectaríferas (Pansarin 2003), ou ainda em cunículos, um tipo de nectário comum encontrado em espécies da subtribo Laeliinae (Dressler 1993, Pridgeon et al. 1999). Laeliinae é uma subtribo restrita a região Neotropical que compreende cerca de espécies distribuídas em 43 gêneros (Dressler 1993). O grupo constitui um dos melhores exemplos de radiação adaptativa entre as orquideas, sendo encontrados todos os principais grupos de polinizadores observados na família (van der Pijl & Dodson 1966, Dressler 1981). Apesar dos dados serem escassos, a maioria dos gêneros da subtribo é polinizado por Hymenoptera. No entanto, em Epidendrum, que é considerado o maior gênero do grupo, os polinizadores são principalmente os Lepidoptera (van der Pijl & Dodson 1966). 28

32 O gênero Encyclia Hook. é neotropical e apresenta aproximadamente 120 espécies distribuídas pelos Estados Unidos, México, Brasil e Argentina (van den Berg et al., 2005). Encyclia patens Hook. que é uma dessas espécies, apresenta ampla distribuição geográfica no Brasil, ocorrendo desde o Rio Grande do Sul até o Pernambuco (Pansarin & Pansarin, 2010). Contudo, não existem estudos envolvendo a sua biologia reprodutiva e polinização. Somente vespas foram observadas visitando suas flores. Além disso, foi documentada baixa desenvolvimento de frutos em condições naturais (Pansarin & Pansarin, 2010). O presente trabalho teve como objetivos estudar a biologia reprodutiva de Encyclia patens. Para isso foram desenvolvidas análises sobre os aspectos de sua fenologia, morfologia floral, análise química das fragrâncias florais, observações sobre seus polinizadores e mecanismos de polinização, bem como quantificação do desenvolvimento de frutos em condições naturais. 29

33 Material e Métodos Área de estudo Os estudos com Encyclia patens foram desenvolvidos no município de São Simão (aproximadamente S e O), no estado de São Paulo. Essa região é caracterizada por altitudes que variam entre 620 e 700 m e temperaturas médias mensais que variam entre 17,6 C no mês mais frio (julho) e 23,5 C no mês mais quente (fevereiro). A precipitação média anual é de aproximadamente 1478 mm. De acordo com a classificação de Köppen (1948), o clima da região enquadra-se na categoria Cwa, ou seja, temperado, macrotérmico moderadamente chuvoso e com inverno seco não rigoroso (Pires Neto et al. 2005). Estudos sobre a Fenologia As observações sobre a fenologia de Encyclia patens foram realizadas sobre 4 indivíduos no município de São Simão interior do estado de São Paulo. Para cada indivíduo foi observado desenvolvimento de inflorescências, botões florais e flores, o período de antese, a longevidade floral e a deiscência dos frutos. As observações foram realizadas em oito expedições na população de estudo entre o mês de maio de 2012 a setembro de 2013 e entre abril e julho de As visitas ao campo foram intensificadas no período de floração para estudo da biologia floral e observações dos polinizadores. Análise química dos compostos voláteis Para a realização da análise de headspace com microextração em fase sólida (HS- SPME) dos voláteis florais algumas flores foram colocadas separadamente em um frasco de 30

34 vidro de 20 ml e submetidos a uma temperatura constante de 35ºC por 60 minutos. Nesse período, a fibra de sílica fundida coberta com 10µm de polidimetilsiloxano (PDMS) (Supelco Inc., Bellefont, PA) foi inserida no frasco e exposta ao headspace floral. A análise dos compostos voláteis florais foi processada usando um cromatógrafo a gás acoplado a um espectrômetro de massa QP 2010 Shimadzu. Um detector de espectrometria com fonte de ionização por elétrons (EI-MS) foi operado sob a temperatura da fonte a 250ºC, uma corrente de emissão de 60 µa e uma energia de ionização de 70 e V. O tempo global de corrida foi registrado em modo de varredura completo ( m/z de variação de massa) e uma proporção de leitura de 0.30 scan s -1. Os compostos foram dissolvidos termicamente da fibra SPME no injetor por 2 minutos a 250ºC, com modo de injeção em splitless. Esses compostos foram separados em uma coluna capilar DB-5MS (J & W Agilent) de 30 m x 0,24 mm, sendo a espessura do filme de 0,25µm, com He (79,7 kpa) como gás de arraste e fluxo de 1,3 ml min -1. A temperatura do GC se iniciou a 60ºC, e aumentou linearmente 30ºC por minuto até atingir 240ºC, durante 60 minutos. Os dados de cromatografia foram analisados com o software GC-MS Solution e os compostos voláteis foram identificados com a biblioteca NIST 62, Wiley 7 e FFNSC 1.3, por comparação dos espectros de MS. Além disso, os índices de retenção de Kováts (KI) de cada composto foram calculados de acordo com a fórmula de Kováts (Robards et al. 1994). As áreas de cada pico das cromatogramas foram integradas para determinar a abundância relativa de cada composto. Estudos sobre morfologia floral Para realização dos estudos sobre a morfologia floral de Encyclia patens, 30 flores frescas foram coletadas em indivíduos coletados previamente na população de estudo e 31

35 mantidas em cultivo no Orquidário LBMBP da FFCLRP-USP. Suas estruturas foram medidas e analisadas sob um microscópio estereoscópico binocular utilizando um paquímetro de precisão. Foram observadas a forma, a simetria, o tamanho e o formato das peças florais, como pétalas, sépalas, labelo, coluna, antera e polinário. O material testemunho de Encyclia patens foi depositado no Orquidário do Laboratório de Biologia Molecular e Biossistemática de Plantas-LBMBP, FFCLRP-USP Universidade de São Paulo ( org.br/manager/detail?setlang=pt&resource=lbmbp). Análises histoquímicas das regiões produtoras de recursos Para a realização dos testes, cortes a mão livre foram obtidos a partir de flores frescas coletadas em indivíduos mantidos em cultivo no orquidário LBMBP. Os testes histoquímicos foram realizados para detectar substâncias pécticas com solução aquosa de vermelho de Rutênio 0,02% (Jensen 1962) e teste para açucares redutores com reagente de Fehling (Purvis et al.1964). Visitantes florais e mecanismo de polinização As observações focais sobre os visitantes florais foram realizados em condições naturais nos períodos de floração no ano de 2013 e Em 2013, as observações foram realizadas entre os dias 26 de junho e 9 de julho nos períodos de 08:00-17:00h. Em 2014, as observações foram realizadas entre os dias 26 de junho e 16 de julho. Todavia, devido as adivesidades climáticas como fortes ventos, dias nublados e com chuvas que pudessem impossibilitar as observações por todo o período, elas foram realizadas no período entre 08:00-13:00h. Foram realizadas um total de 132 horas de observações. Durante as 32

36 observações, dois indivíduos com flores intactas foram marcadas no final de cada dia e checadas na manhã seguinte para verificar a possível ocorrência de polinização noturna. Sistema reprodutivo Para investigar o sistema reprodutivo de Encyclia patens foram utilizados cinco indivíduos que foram coletados e mantidos em cultivo no orquidário LBMBP. Todos os indivíduos foram submetidos a três diferentes tratamentos que são: autopolinização manual (n=30 flores), emasculação (n=30 flores) e polinização cruzada (n=30 flores). Além disso, 30 flores foram utilizadas para a realização das observações sobre a presença de autopolinização espontânea. Taxa de frutificação em condições naturais As informações sobre a taxa de frutificação em condições naturais foram obtidas no município de São Simão em setembro de 2013 e Foram utilizados 30 indivíduos da população de estudo, contando-se o número flores produzidas e a quantidade de frutos desenvolvidos. Análise da viabilidade das sementes Para a análise sobre a viabilidade das sementes, todos os frutos formados a partir dos tratamentos manuais foram amostrados. Uma amostra de 200 sementes por frutos foi analisada sob um microscópio de luz. As sementes foram classificadas em viáveis e não viáveis de acordo com o desenvolvimento dos embriões, sendo consideradas não viáveis as 33

37 sementes sem embriões ou com embriões rudimentares (Pansarin et al. 2008). As sementes foral coletadas quando os frutos estavam deiscentes. 34

38 Resultados Encyclia patens é uma espécie com hábito epífito e folhas lineares com inflorescências paniculadas apicais que podem produzir até 40 flores. Suas flores que exalam uma fragrância adocicada se abrem no inverno, nos meses de junho a julho. Tal fragrância é composta por dez substâncias voláteis distintas. O volátil mais abundante é o β-α-transbergamoteno que nas análises químicas apresentou uma porcentagem de área relativa de 27%, depois o composto trans-ocimeno com 25.32%, seguido pelo trans-cariofileno com 18.1 %, o α-farneseno com 12.6%, o linalol com 7.26%, o germacreno D com 1.52%, o acetato fenetilico com 1.37%, o β-cis-ocimeno com 1.35%, o α-bisaboleno com 0.87% e por último, o menos abundante isolongifolene com uma porcentagem de área relativa de 0.9% (Fig. 1). As flores de Encyclia patens são pediceladas, ressupinadas de coloração predominantemente verde e púrpura e se abrem logo pela manhã. Cada flor pode durar cerca de 21 dias. Suas sépalas dorsais medem X= 1,62 ± 0,06 x 0,54 ± 0,04 são oblanceoladas, levemente curvadas para frente, apresenta ápice apiculado e margem lisa; as sépalas laterais medem X= 1,61 ± 0,05 x 0,59 ± 0,04, são oblanceoladas, levemente falcadas e com ápice apiculado; as pétalas medem X= 1,57 ± 0,07 x 0,60 ± 0,05 são falcadas e atenuadas; o labelo é 3-lobado mede X= 1,46 ± 0,06 x 0,89 ± 0,07 e apresenta coloração amarelo-esverdeado com linhas púrpuras longitudinais (guias de néctar), margem ondulada; os lobos laterais são de coloração branco-esverdeada com linhas púrpuras na base e envolvem a coluna (X= 0,75± 0,05 x 0,89 ± 0,07) que é sigmóide e apresenta aurículas no ápice; o polinário mede ca. 0.1 cm e é formado por 4 polínias discóides de consistência cartilaginosa; a antera mede ca. 0,2 cm é oval e de coloração amarela (Tabela 1). 35

39 As flores de Encyclia patens produzem uma pequena quantidade de néctar que fica acumulado por um dia após a antese da flor no interior do cunículo que apresenta a epiderme recoberta por papilas (Fig. A). A partir dos testes histoquímicos com o reagente de Fehling notou-se a presença de açucares redutores no protoplasto das células (Fig. 2B). Além disso, através dos testes histoquímicos com vermelho de Rutênio verificou-se a presença de substâncias pécticas nas células epidérmicas (Fig. 2C). Não foram observados os polinizadores de Encyclia patens. Vespas sociais da espécie Polybia ignobilis Haliday 1836 (Fig. 2D) e também moscas da família Syrphidae (Fig. 2E) foram observadas atuando apenas como visitantes florais. A vespa Polybia ignobilis visitou somente uma flor pousando sobre o labelo e abandonando a flor logo em seguida. A mosca Syrphidae visitou rapidamente a flor pousando sobre o labelo. Em todas as visitas os insetos não tocaram as estruturas reprodutivas das flores. Encyclia patens é uma espécie autocompatível. Todavia, depende de um polinizador para a transferência de pólen. Não houve a formação de frutos em flores emasculadas e nas flores submetidas à autopolinização espontânea. O desenvolvimento de frutos foi exclusivamente de flores submetidas à polinização cruzada (93,3%) e autopolinização manual (100%). A taxa de sementes potencialmente viáveis nos frutos provenientes destes tratamentos foi de 57,93% em autopolinização manual e 82,52% nos frutos originados dos tratamentos manuais de polinização cruzada. Em condições naturais, a população estudada apresentou uma taxa de frutificação de 0,28% (Tabela 2). 36

40 Compostos voláteis α-bisaboleno isolongifolene β-cis-ocimeno acetato fenetilico germacreno D linalol α-farneseno trans-cariofileno β-trans-ocimeno α-trans-bergamoteno Abundância relativa Figura 1: Abundância relativa dos compostos voláteis detectados na fragrância floral de Encyclia patens, no município de São Simão-SP. 37

41 Tabela 1: Variação, Média (X) e desvio padrão (DP) das estruturas florais de Encyclia patens na população de estudo, município de São Simão-SP. Estruturas Comprimento (cm) Variação X DP Largura (cm) Variação X DP Pétalas 1,5-1,7 1,57 0,07 0,5-0,7 0,60 0,05 Labelo 1,3-1,6 1,46 0,06 0,8-1,0 0,89 0,07 Sépalas 1,5-1,7 1,61 0,05 0,5-0,7 0,59 0,04 Sépala dorsal 1,5-1,7 1,62 0,06 0,5-0,6 0,54 0,04 Coluna 0,7-0,8 0,75 0,05 0,8-1,0 0,89 0,07 Antera 0, Polinário 0,

42 FIGURA 2: Encyclia patens Hook. (Orchidaceae: Laeliinae). A, Corte longitudinal da região do cunículo com néctar. B, Corte transversal da região do cunículo com reagente de Fehling (precipitado castanho escuro) (aumeto=100x). C, Corte transversal da região do cunículo 39

43 com reagente vermelho de Rutênio (aumento=100x). D, Vespa Polybia ignobilis visitante das flores de E.patens. E, Mosca Syrphidae visitante das flores. 40

44 Tabela 2: Resultados obtidos nos testes sobre o sistema reprodutivo de Encyclia patens. porcentagem de frutos desenvolvidos nos tratamentos manuais de polinização cruzada, autopolinização manual e em polinização aberta na população no anos anos de 2013 e 2014; porcentagem de sementes potencialmente viáveis obtidas nos tratamentos manuais de polinização cruzada e autopolinização. Tratamentos Flores Frutos Sementes Autopolinização manual (100%) 4908 (81,8%) Polinização cruzada (93,3%) 4420 (73,6%) Emasculação Polinização aberta (2013) (0,28%) - Polinização aberta (2014) - - * 41

45 Discussão Encyclia patens, é uma espécie epífita endêmica do Brasil que apresenta flores fragrantes que exalam um forte cheiro adocicado. Tal fragrância, por análise GC-MS, apresentou ser composta por10 substâncias distintas que são: β-α-trans-bergamoteno como o mais rico, depois otrans-ocimeno, otrans-cariofileno, o α-farneseno, o linalol, ogermacreno D, o acetato fenetilico, o β-cis-ocimeno, oα-bisabolenoe por último, o menos abundante isolongifolene. Esses compostos são líquidos aromáticos que podem estar presentes em flores, folhas, sementes, ervas, madeira, frutos e raízes de várias espécies de plantas, podendo ter em sua constituição misturas muito complexas como terpenóides que podem conter até 100 ou mais compostos orgânicos. Na maioria dos casos, os óleos essências podem apresetar monotepenos, sesquiterpenos e com menor freqüência os diterpenos. No qual, seus constituintes podem estar envolvidos em múltiplas funções orgânicas, como alcoóis, cetonas éteres, ésteres aldeídos. No entanto, atuando como fitoalexinas, os terpenos apresentam diversas funções nas plantas, podendo agir como repelentes de insetos, agente na defesa contra herbívoro, entre outros (Burt et al. 2004) ou atração de polinizadores (Dodson 1969). Na maioria das espécies de plantas com flores, a reprodução sexuada é mediada pela interação entre os órgãos reprodutores das flores e o inseto ou animal polinizador que transfere o pólen ou polínia como ocorre nas flores de muitas especies de orquídeas (e.g. Pansarin 2003, Pansarin & Amaral 2008, Pansarin & Pansarin 2013). Os polinizadores são geralmente atraídos pelas combinações de cores e fragrâncias florais, associadas a algum tipo de recompensa alimentar como à própria fragrância, às resinas, os lipídios, o pólen e o néctar (e.g. Curry et al. 1991, Davies et al. 2003, Mickeliunas et al. 2006, Pansarin & Pansarin 2013). 42

46 As flores de Encyclia patens produzem néctar, composto que é secretado no interior de um nectário do tipo cunículo. Os testes histoquímicos com reagente de Fehling que evidenciaram a presença de açucares redutores e com o reagente vermelho de rutênio vereficando-se a presença de substâncias pécticas nas células epidérmicas do cunículo. O cunículo, em Laeliinae, está presente também em outras espécies do grupo, como por exemplo, em Pseudolaelia corcovadensis Porto & Brade (Borba & Braga 2001), em Brassavola flagellaris Barb. Rodr. (Stpiczyńska et al. 2010) e em algumas espécies do gênero Epidendrum (e.g. Pansarin 2003, Pansarin & Amaral 2008, Almeida & Figueiredo 2003, Fuhro et al. 2010, Pinheiro & Cozzolino 2013). Suas flores apresentam antese diurna e permanecem abertas por um período relativamente longo, característica, que de acordo com Endress (1998), pode ser observada em espécies que recebem poucas visitas ou visitas imprecisas e pode estar relacionada com compensação por espécies raramente polinizadas como ocorre em outras espécies no interior do estado de São Paulo (e.g. Mickeliunas et al. 2006, Pansarin & Pansarin 2011). Não foram registrados os polinizadores de Encyclia patens e sim vespas sociais da espécie Polybia ignobilis e uma espécie de moscas da família Syrphidae apenas visitando as suas flores. No entanto, vespas já haviam sido doumentadas visitando suas flores anterirormente por Pansarin & Pansarin (2010). Segundo Dodson (1967), as vespas são responsáveis pela polinização de 3% das espécies de orquídeas. Portanto, as vespas foram observadas visitando flores de outras espécies de orquídeas, como Caladenia, na Austrália (Stoutamire 1983) e Prostechea vespa (Sw.) W. E. (Higgins) no Brasil (Clemente et al. 2012). Os Diptera são considerados o segundo mais importante grupo de polinizadores das orquídeas (van der Pijl& Dodson 1966, Christensen 1994). No entanto, várias espécies têm 43

47 sido documentas como sendo polinizadas por moscas (e.g. Borba & Semir 1998, Singer & Cocucci 1999, Borba & Semir 2001). Além disso, entre elas, há espécies que são polinizadas por esses insetos que visitam as suas flores em busca de néctar (e.g. Kunth 1909, Gilbert 1958, Bernhardt & Burns-Balogh 1986), como por exemplo observado na espécie Epidendrum tridactylum Lindl., no qual quatro famílias de díptera foram documentadas visitando as suas flores, entre as quais uma espécie de Syrphidae (Ornidia obesa Fabricius) atua como polinizador (Pansarin & Pansarin 2013). Todavia, existem espécies como observado em Govenia utriculata (Sw.) Lindl. por Pansarin (2008), que são polinizadas atraindo os Syrphidae por engano, similar ao sistema observado no gênero Thelymitra, no qual suas flores se abrem no mesmo período em que outras espécies florescem, mimetizando seus estames (e.g. Bernhardt & Burns-Balogh 1986, Dafni & Calder 1987, Burns-Balogh & Berchard 1988). A espécie Encyclia patens é autocompativel, porém dependente de um polinizador biótico para transferência de pólen, uma vez que não houve desenvolvimento de frutos nos tratamentos de emasculação e nas flores submetidas ao teste de autopolinização espontânea. A autocompatibilidade é comum entre as orquídeas e o desenvolvimento de frutos provenientes de autogamia é geralmente evitada por barreiras mecânicas ou etológicas eficientes da própria flor (van der Pijl & Dodson 1966, Catling & Catling 1991, Borba & Semir 1999). Considerando que as flores de Encyclia patens produzem néctar como recurso para seus polinizadores, o número de frutos originados em condições naturais são considerados extremamente baixos quando comparados com outras espécies que ocorrem na mesma área de estudo e que também produzem néctar como por exemplo Campylocentrum micranthum (Cabral & Pansarin, dados não publicados) ou quando comparadas com algumas outras 44

48 espécies da subtribo Laeliinae que ocorrem no interior do estado como Epidendrum tridactylumlindl. (Pansarin & Pansarin 2013). O desenvolvimento de sementes potencimalmente viáveis nos frutos provenientes dos tratamentos manuais realizados em Encyclia patens, no entanto, foi considerávelmente alto. Valores aproximados foram observdos em Phymatidium delicatulum e Mesadenella cuspidata. Contudo, em outras espécies estudadas no estado de São Paulo, os resultados observados são diferentes. Em espécies do gênero Eulophia R.Br., Cattleya Lindl., Laelia Lindl., Pleurothallis e Pseudolaelia Porto & Brade são considerdos relativamente baixos (Lock & Profita 1975, Stort & Martins 1980, Stort & Galdino 1984, Borba et al. 2001, Borba & Braga 2003). 45

49 Conclusão A espécie Encyclia patens é epífita. Suas flores são ressupinadas e de coloração verde e púrpura. Cada flor dura até 21 dias. A espécie floresce no inverno nos meses de junho a agosto. Suas flores exalam uma fragrância adocicada composta por dez voláteis diferentes. Além disso, suas flores produzem uma pequena quantidade de néctar que fica exposto somente no primeiro dia após a antese. Não foram observados os polinizadores de Encyclia patens. Entretanto, vespas sociais da espécie Polybia ignobilis e moscas da família Syrphidae foram observadas sobre as suas flores, porém não atuando como seus polinizadores. A espécie é autocompativel. Todavia, dependente de um polinizador para transferência de pólen. Frutos foram formados apenas nos tratamentos de polinização cruzada e autopolinização manual. A taxa de semente potencialmente viáveis nos frutos provinientes destes tratamentos foi consideravelmente alta. Em condições naturais, a população estudada apresentou uma taxa de frutificação baixa. 46

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57 Capítulo 2 Autocompatibilidade e polinização por abelhas coletoras de óleo em Phymatidium Lindl. (Orchidaceae: Oncidiinae). 54

58 Resumo A polinização por abelhas coletoras de óleo tem sido registrada em varios grupos de orquídeas não relacionados, sugerindo evolução convergente na oferta de óleos comestíveis como recurso floral dentro da família Orchidaceae. A oferta de óleos comestíveis foi registrada em Oncidiinae, incluindo Phymatidium. No entanto, nada se sabe sobre a biologia da polinização do gênero. Os estudos sobre a biologia reprodutiva de uma espécie de Phymatidium (P. delicatulum) foram realizadas em uma reserva natural da região sudeste do Brasil. Phymatidium delicatulum é uma erva epífita com pequenas flores brancas que se abrem no verão. Suas flores fragrantes oferecem óleos comestíveis que são produzidos por elaióforos do labelo. O óleo produzido pelas suas flores é coletado por abelhas Tapinotaspidini da espécie Tetrapedia amplitarsis Friese 1899 e abelhas do gênero Trigonopedia Moure 1941, que atuam como seus polinizadores. Phymatidium delicatulum é autocompatível e dependente de um polinizador. Como ocorre em muitas orquídeas da America do Sul, a taxa de frutificação em condições naturais é baixa devido à escassez de visitas das abelhas nas flores. A taxa de sementes potencialmente viáveis em frutos originados dos tratamentos de polinização manual foi consideravelmente baixa. Palavras chave: sistema reprodutivo, óleos comestíveis, Epidendroideae, biologia da polinização, biologia reprodutivo 55

59 Abstract Pollination by oil-collecting bees has been recorded in several unrelated orchid groups, suggesting convergent evolution in the offering of edible oils as a floral resource within Orchidaceae. The offering of edible oils has been recorded in Oncidiinae, including the Brazilian Phymatidium. However, nothing is known obout the pollination biology of this endemic genus. The studies on reproductive biology of a species of Phymatidium, namely P. delicatulum, were conducted in a natural reserve of Southeastern Brazil. Phymatidium delicatulum is an epiphyte herb with small white flowers that bloom in summer. Their fragrant flowers offer edible oils that are produced by labellar elaiophores. The oil is collected by Tapinotaspidini bees that pollinate its flowers during the oil collection. Phymatidium delicatulum is self-compatible and pollinator-dependent. As occur in many South American orchids, the fruit set in natural conditions is low due frequency as a consequence of scarcity of bee visitation on flowers. The rate of seed viable potentially in fruits originated in the manual pollination treatments was considerably low. Key words: breeding system, edible oils, Epidendroideae, pollination biology, reproductive biology 56

60 Introdução A produção de óleos florais como recurso tem sido observado em várias famílias de Monocotiledôneas como Iridaceae, Orchidaceae, Commelinaceae, Cyperaceae e Dicotiledôneas como Cucurbitaceae, Primulaceae, Krameriaceae, Malpighiaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae e Convolvulaceae (Vogel & Cocucci 1995, Melo & Gaglianone 2005). Os óleos florais são compostos produzidos e secretados por glândulas conhecidas como elaióforos, estruturas que de acordo com a classificação de Vogel (1974) podem ser de dois tipos: epitelial ou tricomático. Na família Orchidaceae, os elaióforos podem ocorrer em ambas às formas e podem ser encontrados em diferentes partes de suas flores como, por exemplo, sobre pétalas espécies (e.g. Toscano de Brito 2001), sobre os calos do labelo (e.g. Buchmann 1987, Toscano de Bruto 2001, Stpiczyńska et al. 2007), sobre o labelo (e.g. Pauw 2006) e sobre a coluna (e.g. Mickeliunas et al. 2006). A presença dessas estruturas tem sido observada em várias espécies de diferentes gêneros, incluindo Gomesa R.Br., Lockhartia Hook., Oncidium SW., Ornithocephalus Hook., Trichocentrum Poepp. & Endl. e Phymatidium Lindl. (Veja Singer & Cocucci 1999, Flach et al. 2004, Reis et al. 2000, 2006, Stpiczyńska et al e Stpiczyńska & Davies 2008). Os óleos florais são coletados por abelhas de diversos gêneros, como Tetrapedia Klung 1810, Paratetrapedia Moure 1941 e Centris Fabricius 1804, que visitam suas flores, e atuam como polinizadores dessas orquídeas (e.g. Buchmann 1987, Singer & Cocucci 1999, Toscano de Brito 2001, Van der Cingel 2001, Mickeliunas et al. 2006, Pansarin & Pansarin 2010, Renner & Schaefer 2010, Torretta et al. 2011). Em Oncidium, por exemplo, algumas 57

61 espécies que produzem esta substância como recurso são polinizadas por abelhas do gênero Centris, Paratetrapedia e Tetrapedia (e.g. Singer & Cocucci 1999, Silveira 2002, Van der Cingel 2001, Toscano de Brito 2001). Em relação ao sistema reprodutivo, a autocompatibilidade é comum entre as orquídeas e a autogamia geralmente é evitada por barreiras de pré-polinização (van der Pijl & Dodson 1966, Dressler 1981, 1993, Borba & Semir 1999). Não obstante, a auto-incompatibilidade é tipicamente uma característica comum na subtribe Oncidiinae e tem sido observada em espécies do gênero Oncidium, Rodriguezia Ruiz & Pav., Gomesa, Trichocentrum (e.g. Tremblay et al. 2005, Singer et al. 2006, Carvalho & Machado 2006, Alcátara et al. 2006, Parra-Tabla et al e Pansarin & Pansarin 2010). O gênero Phymatidium compreende 10 espécies distribuídas pelo nordeste, sudeste e sul do Brasil (Barros et al. 2014). Nada é conhecido sobre o sistema reprodutivo e biologia da polinização de espécies deste gênero. Portanto, o principal objetivo deste estudo é investigar a biologia reprodutiva de Phymatidium delicatlum Lindl., uma espécie nativa endêmica do Brasil (Barros et al. 2014). Para isso, foram analisandos os aspectos de seu sistema reprodutivo, sua fenologia e morfologia floral, o comportamento dos polinizadores, os mecanismos de polinização e o sucesso no desenvolvimento de frutos da espécie em condições naturais. 58

62 Material e Métodos Área de estudo Os estudos sobre a biologia de Phymatidium delicatulum foram conduzidos na Reserva Biológica Serra do Japi, no município de Jundiaí, estado de São Paulo, sudeste do Brasil (aproximadamente 23º15 S e 46º58 W). A Serra do Japi é principalmente coberta de floresta semidecidual mesofítica. A região é caracterizada por elevações de 700 a m e temperatura média anual de 15.7 ºC a 19.2ºC (Pinto 1992). A sazonalidade é bem marcada, com estação seca no inverno, de abril a setembro, e uma estação chuvosa, de outubro a março. Estudos sobre a fenologia As observações sobre a fenologia foram realizadas em 15 indivíduos. Para cada indivíduo foram observados o desenvolvimento das inflorescências, botões e flores, o período de antese, a longevidade floral e deiscência dos frutos. Estas análises foram realizadas durante cinco expedições na população de estudo, entre janeiro de 2013 e abril de Estudos sobre morfologia floral Para os estudos sobre a morfologia floral foram analisadas 30 flores frescas. Suas estruturas foram observadas em um microscópio estereoscópico binocular e medidas com paquímetro. 59

63 Visitantes florais e mecanismo de polinização As observações para registros sobre o comportamento, a frequência de visitas, os mecanismos de polinização e a captura dos polinizadores para posterior identificação foram realizados nos períodos de floração de 2013 e No período de floração de 2013 as observações foram realizadas entre de janeiro e de fevereiro. Em 2014 as observações foram realizadas entre de janeiro. O período diário de observações foi de 07:00 às 16:00 h, totalizando 83 horas. Durante o período de observações, dois indivíduos foram marcados, monitorados do início ao fim de cada dia, e checados na manhã seguinte, antes das 07:00 h, para verificar a possível ocorrência de polinização noturna. O comportamento dos polinizadores nas flores foi documentado utilizando uma câmera fotográfica Nikon D-SLR D80 e uma lente Micro Nikkor 55 mm f2.8. Os detalhes dos polinizadores foram fotografados com câmera digital acoplada a um microscópio estereoscópico Leica StereoZoom S8 APO. Os insetos foram coletados utilizando uma rede entomológica, identificado e depositados como vouchers na Coleção Camargo (RPSP) do Departamento de Biologia, FFCLRP-USP, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Brasil. Sistema reprodutivo O sistema reprodutivo de Phymatidium delicatulum foi analisado baseando-se em três tratamentos experimentais: autopolinização manual (n=47 flores), polinização cruzada (n=37 flores) e emasculação (n=30 flores, teste para apomixia). Além disso, foram realizadas observações sobre autopolinização espontânea (n=30 flores). Os tratamentos de autopolinização manual foram realizados em três indivíduos, utilizando cinco inflorescências, sendo polinizadas até nove flores, totalizando 47 flores. Nos tratamentos de 60

64 emasculação e nas análises sobre autopolinização espontânea foram utilizados dois indivíduos, sendo um para emasculação e o outro para autopolinização espontânea. Em cada indivíduo, cinco inflorescências foram utilizadas, sendo usadas seis flores em cada, totalizando 30 flores. Nos tratamentos manuais de polinização cruzada dois indivíduos foram utilizados, destes, oito inflorescências, sendo polinizadas até 6 flores em cada, totalizando 37 flores. Os tratamentos para investigar o sistema reprodutivo de Phymatidium delicatulum e as observações sobre autopolinização espontânea foram realizados em indivíduos previamente coletados na população de estudo entre os meses de janeiro e abril de 2013 e mantidos cultivados em vasos no Orquidário LBMBP (Laboratório de Biologia Molecular e Biossistemática de Plantas), FFCLRP-USP, Universidade de São Paulo ( Taxa de frutificação em condições naturais As informações sobre a taxa de frutificação em condições naturais foram obtidas na Serra do Japi, no município de Jundiaí-SP, em abril de Para obter essas informações foram utilizados 15 indivíduos da população, sendo usadas 30 inflorescências, contando-se o número de flores produzidas e o número de frutos desenvolvidos durante a estação. Análise da viabilidade das sementes As análises da viabilidade das sementes foram obtidas a partir de frutos deiscentes desenvolvidos através dos tratamentos manuais de polinização. Foi utilizada uma amostra de 200 sementes por fruto e examinadas em um microscópio de luz. As sementes com embrião rudimentar ou sem embrião foram consideradas não viáveis (Pansarin et al. 2008). 61

65 Resultados Nas florestas da Serra do Japi, Phymatidium delicatulum ocorre como epífita. Trata-se de plantas muito pequenas com até 5 cm que não desenvolvem pseudobulbos. Suas folhas medem 1.0-2,5 cm compr. são lineares e irregularmente dispostas sobre um curto caule, apresenta margem lisa e ápice agudo. As inflorescências são racemosas e podem produzir até17 flores. As primeiras flores começam a se abrir no verão, no final de dezembro, com alguns poucos indivíduos florescendo até o final de fevereiro. O processo de antese ocorre ao longo de todo o dia, com a abertura de 2-3 flores/dia que permanecem abertas por até15 dias. As flores são pediceladas, ressupinadas e apresentam coloração predominantemente branca com calosidades verdes sobre o labelo (Fig. 1A) e exalam fragrância adocicada. Suas pétalas medem 3,0-3,5 x 1,0-1,2 mm são livres, linear-lanceoladas a ablongo-lonceoladas; as sépalas são de tamanho igual ao das pétalas, são livres entre si, linear-lanceoladas a ablongolonceoladas; o labelo é 3-lobado mede 4,2-4,5 x 3,0-3,5 mm, apresentam calos glandulares na superfície adaxial, margem levemente erosa e ápice agudo; o ginostêmio mede 2,0-2,2 x 1,0-1,3 mm, apresenta aurículas no ápice (aurículas densamente papilosas) e uma cavidade estigmática basal; o rostelo é curto; a antera é amarela e mede 2,0-2,2 x 1,0-1,3 mm; o polinário é formado por quatro polínias ovais (ca. 1,0 mm diâm.) e um viscídio elíptico. Os frutos são globulares, estriados e são deiscentes no outono, de março a abril. As flores de Phymatidium delicatulum foram visitadas e polinizadas por abelhas Tapinotaspidini (Tetrapedia amplitarsis Friese 1899 e Trigonopedia Moure 1941 (Fig. 1B)), que coletam o óleo produzido pelos calos glandulares do labelo. As visitas dos polinizadores às flores foram pouco frequentes e ocorreram em intervalos irregulares entre 07:00 e 14:00h, e somente em dias ensolarados. As visitas têm início com as abelhas pousando sobre uma 62

66 inflorescência. Em seguida, dirigindo-se a uma flor e posicionando-se sobre os calos glandulares do labelo a abelha fricciona os tarsos das pernas medianas sobre os calos para coletar o óleo. Neste momento, a parte frontal da cabeça da abelha entra em contato com o viscídio do polinário, o qual é removido. A polinização ocorre assim que a abelha carregado um polinário visita uma flor, e no processo de coleta de óleo ele é depositado no estigma. As abelhas geralmente visitam de uma a duas flores em cada inflorescência, permanecendo de 20 a 50 segundos. Através da conferencia das flores marcadas, nenhuma visitação noturna foi notificada. A espécie Phymatidium delicatulum mostrou-se autocompatível e não autógama, uma vez que os frutos formados são exclusivamente dos tratamentos manuais de autopolinização (31,9%) e polinização cruzada (54%). As flores submetidas à autopolinização espontânea não desenvolveram frutos. Em condições naturais a taxa de frutificação foi de 10,7%. A taxa de sementes potencialmente viáveis nos frutos provenientes dos tratamentos de autopolinização manual foi de 57,93% e nos frutos originados dos tratamentos manuais de polinização cruzada foi 82,52% (Tabela 1). 63

67 Tabela 1. Resultados obtidos nos testes sobre o sistema reprodutivo de Phymatidium delicatulum: porcentagem de frutos formados em cada tratamento manual, em autopolinização espontânea e em condições naturais (polinização aberta); portecentagem de sementes potencialmente viáveis obtidas nos tratamento manuais de polinização cruzada e autopolinização. Tratamentos Flores Frutos Sementes Polinização cruzada (54%) 3301 (82,52%) Autopolinização manual (31,9%) 1738 (57,93%) Emasculação Polinização aberta (10,7%) - 64

68 Figura 1. Phymatidium delicatulum (Orchidaceae: Oncidiinae). A, Inflorescência. B, Uma do gênero Trigonopedia Moure 1941 coletando óleo em uma flor. 65

69 Discussão As flores Phymatidium delicatulum são fragrantes e permanecem abertas por um período relativamente longo de 15 dias. Tais características têm sido observadas em flores de outras espécies de Oncidiinae como em Grobya amherstiae Lindl., Trichocentrum pumilum Lindl., e Gomesa bifolia (Sims) M.W. Chase & N.H. Willians (Mickeliunas et al. 2006, Pansarin & Pansarin 2011, Torreta et al. 2011). De acordo com Endress (1998), essa características podem estar relacionadas com compensação por espécies raramente polinizadas ou espécies que recebem visitas imprecisas dos seus polinizadores. Os calos glandulares presentes na superfície do labelo em suas flores é, de acordo com Reis et al. (2006) elaióforo do tipo tricomático. Os elaióforos do tipo tricomático estão presentes também sobre o labelo de Phymatidium falcifolium Lindl. (Toscano de Brito 2007), e em espécies do gênero Ornithocephalus Hook. e Zygostates Lindl. (Toscano de Brito 2001). Entretanto, estas estruturas podem ainda ocorrer sobre a coluna ou outras partes das flores de algumas espécies, conforme documentado em Z. grandiflora (Lindl.) Mansf., Z. lunata Lindl. e O. gladiatus Hook. por Pacek et al. (2012). O óleo produzido e secretado pelas flores de Phymatidium delicatulum é coletado por abelhas da tribo Tapinotaspidini, que são os únicos polinizadores desta espécie na área de estudo. Abelhas Tapinotaspidini são conhecidas como polinizadores de várias outras espécies de orquídeas que oferecem óleo como recurso. Na espécie Grobya amherstiae, por exemplo, abelhas Paratetrapedia fervida Smith 1879 foram documentadas como polinizadores, e em Trichocentrum pumilum os polinizadores foram Lophopedia nigrispinis Vachal 1909, além da espécie Tetrapedia diversipes Klung 1810 (Mickeliunas et al. 2006, Pansarin & Pansarin 2011). Abelhas do gênero Paratetrapedia também foram documentadas visitando as flores de algumas espécies de Oncidium (Buchmann 1987, Singer & Cocucci 1999). Além disso, 66

70 abelhas da espécie Paratetrapedia testacea Smith 1854 foram observadas como polinizadores de Ornithocephalus ciliatus Lindl. e O. cf. patentilobus C. Schweinf. no Peru. E na América Central, abelhas P. calcarata Cresson 1878 foram documentadas como polinizadores de Ornithocephalus bicornis Lind. E O. powellii Schltr. no Panamá (Van der Cingel 2001, Toscano de Brito 2001). O comportamento, o processo de polinização e coleta de óleo observado aqui para P. delicatulum é muito similar ao documentado em outras espécies de orquídeas polinizadas por abelhas coletoras de óleo (e.g. Singer & Cocucci 1999, Mickeliunas et al. 2006, Pansarin et al. 2008, Torretta et al. 2011, Pansarin & Pansarin 2011), com exceção da espécie Grobya amherstiae, na qual o mecanismo de polinização compreende o arremesso da abelha contra a coluna devido ao processo de articulação/desarticulação do labelo (Veja Mickeliunas et al. 2006), que é similar ao documentado em espécies do gênero Pleurothallis R.Br. e Bulbophyllum que são polinizadas por moscas (Borba & Semir 1998, Borba et al. 2001). Nossos resultados fornecem evidências de que Phymatidium delicatulum é uma espécie autocompatível, porém dependente de um polinizador para transferência de pólen. Não há desenvolvimento de frutos em flores emasculadas ou submetidas aos testes de autopolinização espontânea. A autocompatibilidade é pela primeira vez documantada para o gênero Phymatidium. No entanto, em Oncidiinae, apesar de baixo, o desenvolvimento de frutos originados por autopolinização manual foi observada na espécie Gomesa bifolia por Torreta et al. (2011). Por outro lado, a autocompatibilidade não é uma característica comum entre as espécies da subtribo Oncidiinae, considerando que a auto-incompatibilidade tem sido documentada em várias outras espécies do grupo (e.g. Tremblay et al. 2005, Singer et al. 2006, Carvalho & Machado 2006, Alcátara et al. 2006, Parra-Tabla et al e Pansarin & Pansarin 2011). 67

71 O período de floração de P. delicatulum é um período em que os níveis de precipitação são muito elevados na Serra do Japi. Estas adversidades climáticas podem afetar negativamente as atividades das abelhas ás flores, refletindo no sucesso reprodutivo de algumas espécies como observado aqui para P. delicatulum e já documentado anteriormente em outras espécies de orquídeas que demonstraram baixa frutificação em condições naturais (e.g. Mickeliunas et al. 2006, Pansarin et al. 2008, Pansarin & Pansarin 2010). Em muitas espécies alógamas o baixo desenvolvimento de frutos em condições naturais pode ser atribuído a escassez de polinizadores e, consequentemente, a baixa transferência de pólen entre os indivídividuos da população (e.g. Janzen et al. 1980, Schemske 1980, Ackerman & Oliver 1985, Zimmerman & Aide 1989, Ackerman & Montalvo 1990, Calvo 1990). Nos tratamentos manuais de polinização de Phymatidium delicatulum, os frutos apresentaram uma taxa de sementes potencialmente viáveis relativamente baixas. Resultados similares também foram observados em outras espécies do gênero Eulophia R. Br., Cattleya Lindl., Laelia Lindl., Pleurothallis e Pseudolaelia Porto & Brade (Lock & Profita 1975, Stort & Martins 1980, Stort & Galdino 1984, Borba et al. 2001, Borba & Braga 2003). 68

72 Conclusão A espéciephymatidium delicatulumsão ervas epífitas desprovidas de pseudobulbos, com folhas lineares de ápice agudo. Apresentam inflorescências racemosas e suas flores são fragrantes se abrem no verão, de dezembro a fevereiro e, quando intactas, permanecem abertas por até15 dias. Suas flores são de coloração predominantemente branca e apresentam calosidades verdes sobre o labelo, no qual se encontram os elaióforos. Nossos estudos revelaram que dentro da subtribo Oncidiinae a espécie Phymatidium delicatlum é uma das poucas especies que apresentam autocompatíbilidade, porém não autógama dependente de um polinizador. No entanto, o óleo comestível produzido pelas suas flores é coletado por abelhas Tapinotaspidini das espécies Tetrapedia amplitarsis e Trigonopedia sp., que são seus únicos polinizadores. As suas visitas às flores de Phymatidium delicatulum que são pouco frequentes, ocorreram em intervalos irregulares e somente em dias ensolarados. Em condições naturais a taxa de frutificação foi considerada relativamente baixa. Os frutos estão deiscentes no outono, de março a abril. A taxa de sementes potencialmente viáveis nos frutos provenientes dos tratamentos de autopolinização manual foi considerada relativamente baixa e nos frutos originados dos tratamentos manuais de polinização cruzada regular. 69

73 Referências Bibliográficas. Alcántara, S. Semir J. & Solferin V.N Low genetic structure in an epiphytic Orchidaceae (Oncidium hookeri) in the Atlantic rainforest of south-eastern Brazil. Annals of Botany. 98: Ackerman, J.D. & Montalvo, A.M Short-andlong-term limitations to fruit production in a tropical orchid. Ecology. 71: Ackerman, J.D. & Oliver J.C Reproductive biology of Oncidium variegatum: moon phases, pollination, and fruit set. American Orchid Society Bulletin. 54: Barros, F.D.E. Vinhos F. Rodrigues V.T. Barbarena F.F.V.A. Fraga C.N. Pessoa E.M. & Foster W Orchidaceae in Lista de Espécies da flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. ( Borba, E.L. & Braga P.I.S Biologia reprodutiva de Pseudolaelia corcovadensis (Orchidaceae): melitofilia e autocompatibilidade em uma Laeliinae basal. Revista Brasileira de Botânica. 26: Borba, E.L. Semir J Wind-assisted fly pollination in three Bulbophyllum (Orchidaceae) species occurring in the Brazilian campos rupestres. Lindleyana. 13: Borba, E.L. Shepherd G.J. & Semir J Reproductive systems and crossing potential in three species of Bulbophyllum (Orchidaceae) occurring in Brazilian campo rupestre vegetation. Plant Systematics and Evolution. 217:

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80 Capítulo 3 Biologia reprodutiva de Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay (Orchidaceae: Spiranthinae): uma espécie protândrica polinizada por abelhas. 77

81 Resumo Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay apresenta hábito terrícola e ocorre em áreas de Cerrado e a Mata Atlântica, das regiões sul, sudeste e centro-oeste do Brasil. Os estudos sobre a sua biologia reprodutiva e polinização foram desenvolvidos na Reserva Biológica Serra do Japi, no município de Jundiaí, e no Parque Estadual de Vassununga, no município de Santa Rita do Passa Quatro, estado de São Paulo. Mesadenella cuspidata possui inflorescência racemosa com flores espiraladamente dispostas. Suas flores, que são protândricas, apresestam coloração branca e exalam uma fragrância adocicada composta por 16 voláteis diferentes. Além disso, elas apresetam um nectário em forma de bojo formado pela união das sépalas laterais e o labelo que armazena X= 1,43 ± 0,87 de néctar com uma concentração X= 39,50% ± 5,98 de açúcar. O néctar produzido pelas suas flores é coletado por abelhas Augochlorella tredecim Vachal 1911, Osiris sp. Smith 1854 e Rhathymus friese Ducke 1907 que são seus polinizadores. Mesadenella cuspidata é autocompatível, porém não autógama. As flores submetidas à autopolinização manual resultaram em 66,6% de frutos e as subemtidas a polinização cruzada resultaram em 86,6% de frutos. A taxa de sementes potencialmente dos frutos provenientes destes tratamentos foi de 78,7% em autopolinização manual e 70,9% nos frutos de polinização cruzada. Em condições naturais, no ano de 2013 as flores resultaram em 74,1% de frutos e em 2014 a taxa de frutificação foi de 62,4%. Palavras-chave: Spiranthinae, fragrâncias florais, polinizadores, forrageamento, autocompatibilidade. 78

82 Abstract Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay is terrestrial and accur in areas of Cerrado and Atlantic Forest, occurring in Southern, Southeastern, Central-western Brazil. The reproductive biology and pollination of this species were developed in the Biological Reserve of Serra do Japi, in the municipality of Jundiaí and Parque Estadual de Vassunga, in the municipality of Santa Rita do Passa Quatro. Mesadenella cuspidata possesses an apical raceme with flowers arranged in spiral. Its flowers are protandrous, have white coloration and emit a sweet fragrance composed of 16 different substances. Moreover, they a nectaryshaped bunt forms by the union of the lateral sepals and the lip that stores X= 1.43 ± 0.87 nectar with X= 39.50% ± 5.98 of sugar concentration. The nectar produced by the flowers is collected by bees Augochlorella tredecim Vachal 1911, Osiris sp. Smith 1854 and Rhathymus friese Ducke 1907 which are their pollinators. Mesadenella cuspidate is selfcompatible, but not autogamous. Flower submitted to manual self-pollintion resulted in 66.6% of fruit and submitted to cross-pollintion resulted in 86.6% of fruit. The rate of potentially seed the fruit from these treatments was 78.7% in manual self-polination and 70.9% for cross-pollination fruits. Key-words: Spiranthinae, floral fragrances, pollinators, foraging, Self-compatibility. 79

83 Introdução A subtribo Spiranthinae Lindl. compreende cerca de 40 gêneros e 470 espécies distribuídas quase que exclusivamente pelas Américas (Salazar 2003). Suas flores compartilham algumas características comuns em várias espécies como polínias divisíveis, e um nectário profundo em forma de bojo, formado pela união das sépalas e a base de labelo (Dressler 1993). O néctar representa a principal recompensa produzida pelas flores de várias espécies desse grupo (Catling 1983, 1987, Catling & Catling 1991, Singer & Sazima 1999), e esse composto é importante para uma grande diversidade de animais como abelhas das famílias Halictidae, Megachilidae e Apidae (e.g. Singer & Sazima 1999, 2000), mariposas da família Noctuidae (e.g. Singer 2002), além de beija-flores das subfamílias Trochilinae e Phaethorninae (e.g. Darwin 1877, Singer & Sazima 1999, 2000). O gênero Mesadenella Schltr. compreende cerca de 7 espécies amplamente distribuídas pelo Brasil. No estado de São Paulo, entretanto, ocorrem somente duas espécies, que são M. atroviridis (Barb. Rodr.) Garay e M. cuspidata (Lindl.) Garay. Mesadenella cuspidata apresenta habito terrícola, habitam o Cerrado e a Mata Atlântica, ocorrendo entre as regiões sul, sudeste, centro-oeste do Brasil (Barros et al. 2014). A biologia da espécie é pouco compreendida e trabalhos envolvendo o gênero são escassos. Todavia, em relação aos polinizadores e sistema reprodutivo da espécie, abelhas Halictidae já haviam sido observadas visitando suas flores anteriormente por Pansarin & Pansarin (2010). E em dados não publicados, Singer (2002), documenta que as flores de M. cuspidata são protândricas. O presente estudo teve como objetivo estudar a biologia reprodutiva de Mesadenella cuspidata, analisando a sua fenologia e sistema reprodutivo, os mecanismos de polinização e protandria, o seu sucesso no desenvolvimento de frutos em 80

84 condições naturais, a taxa de sementes com embriões viáveis, além de analises sobre a composição química da fragrância presente nas suas flores. 81

85 Material e Métodos Área de estudos Os estudos sobre a biologia reprodutiva de Mesadenella cuspista foram desenvolvidos na Reserva Biológica Serra do Japi, no município de Jundiaí, estado de São Paulo, cujas coordenadas geográficas são 23º15`S e 46º58`W aproximadamente; e no Parque Estadual de Vassununga, no município de Santa Rita do Passa Quatro, estado de São Paulo, cujas coordenadas geográficas são 21 41`S e 47 34`W aproximadamente. A Reserva Biológica Serra do japi é predominantementecoberta por florestas semidecíduas mesofíticas. A região é caracterizada por elevações que variam entre m de altitude e temperaturas médias anuais de 15,7º C e 19,2ºC. A sazonalidade é bem marcada, com seca no inverno de abril a setembro e uma estação chuvosa de outubro a março. O Parque estadual de Vassununga é composto por seis glebas isoladas, que juntos totalizam 1732,14 ha. (Secretaria do Meio Ambiente de São Paulo 1998). A cobertura vegetal predominante, com exceção da gleba Pé de Gigante (cerrado) é classificada como floresta estacional semidecidual (Veloso 1992). A região é caracterizada por altitudes com 760 metros. O clima predominante, segundo a classificação de Köppen (1948), é o Cwa, isto é, subtropical úmido, com verões quentes e chuvosos, invernos frios e secos com temperatura média de 22º C. Estudos sobre fenologia As observações sobre a fenologia foram realizadas sobre 10 indivíduos no município de Santa Rita do Passa Quatro interior do estado de São Paulo. Para cada indivíduo foi observado o desenvolvimento das inflorescências, botões e flores, o período de antese, a longevidade floral e a deiscência dos frutos. As observações foram realizadas durante oito expedições na população de estudo, entre janeiro de 2013 e abril de

86 Análise química dos compostos voláteis Para a realização do headspace com microextração em fase sólida (HS-SPME) dos voláteis florais as flores foram colocadas separadamente em um frasco de vidro de 20 ml e submetidos a temperatura constante de 35ºC por 60 minutos. Durante esse período, a fibra de sílica fundida coberta com 10µm de polidimetilsiloxano (PDMS) (Supelco Inc., Bellefont, PA) foi inserida no frasco e exposta ao headspace floral. A análise dos compostos voláteis foi realizada usando um cromatógrafo a gás acoplado a um espectrômetro de massa QP 2010 Shimadzu. Um detector de espectrometria com fonte de ionização por elétrons (EI-MS) foi operado sob a temperatura da fonte a 250ºC, uma corrente de emissão de 60 µa e uma energia de ionização de 70 e V. O tempo global de corrida foi registrado em modo de varredura completo ( m/z de variação de massa) e uma proporção de leitura de 0.30 scan s -1. Os compostos foram dissolvidos termicamente da fibra SPME no injetor por 2 minutos a 250ºC, com modo de injeção em splitless. Esses compostos foram separados em uma coluna capilar DB-5MS (J & W Agilent) de 30 m x 0,24 mm, sendo a espessura do filme de 0,25µm, com He (79,7 kpa) como gás de arraste e fluxo de 1,3 ml min -1. A temperatura do GC se iniciou a 60ºC, e aumentou linearmente 30ºC por minuto até atingir 240ºC, durante 60 minutos. Os dados de cromatografia foram analisados com o software GC-MS Solution e os compostos voláteis foram identificados com a biblioteca NIST 62, Wiley 7 e FFNSC 1.3, por comparação dos espectros de MS. Além disso, os índices de retenção de Kováts (KI) de cada composto foram calculados de acordo com a fórmula de Kováts (Robards et al. 1994). As áreas de cada pico das cromatogramas foram integradas para determinar a abundância relativa de cada composto. 83

87 Estudos sobre morfologia floral Para a realização dos estudos sobre a morfologia floral, 30 flores frescas foram coletadas em seis indivíduos coletados previamente na população de estudo e mantido em cultivo em um orquidário. Suas estruturas foram medidas manualmente e analisadas sob um microscópio estereoscópico binocular utilizando um paquímetro. Foram observadas a forma, a simetria, o tamanho e o formato das peças florais, como pétalas, sépalas, labelo, coluna, antera e polinário. O material testemunho de Mesadenella cuspidata foi depositado no Orquidário do Laboratório de Biologia Molecular e Biossistemática de Plantas LBMBP (Laboratório de Biologia Molecular e Biossistemática de Plantas), FFCLRP USP Universidade de São Paulo ( org.br/manager/detail?setlang=pt&resource=lbmbp). Análises Histoquímicadas regiões produtoras de recursos Para a realização dos testes histoquímicos, secções transversais do nectário foram obtidos à mão livre de flores frescas e submersos em reagente de Fehling (Purvis et al.1964). Volume, concentração e produção de néctar O volume e a concentração de néctar das flores de Mesadenella cuspidata foram medidos utilizando uma seringa Hamilton de 10 µl e um refratômetro de bolso com lente Carl Zeiss (Jena, Alemanha) (Sazima et al. 2003). Foram utilizadas 66 flores. Visitantes florais e mecanismos de polinização 84

88 As observações para registros sobre o comportamento dos polinizadores, a frequência de visitas, os mecanismos de polinização e a captura dos polinizadores para posterior identificação foram realizados em 2013 e Durante o período de floração de 2013 as observações foram realizadas de 27 de janeiro a 03 de fevereiro. No período de floração de 2014 as observações foram realizadas de de março. As observações foram realizadas no período entre 08:00 e 16:00 h, totalizando 104 horas. Durante o período de observações, dois indivíduos com flores intactas foram marcadas no final de cada dia e checadas na manhã seguinte para verificar a possível ocorrência de polinização noturna. Para o registro dos polinizadores no campo, as fotos foram obtidas com uma câmera Nikon D80 D-SLR acoplada a uma lente Micro-Nikkor de 55 mm f2.8. Os detalhes dos polinizadores foram fotografados com um microscópio Leica Stereozoom S8 APO acoplado a um PC empregando IM50 Software de análise de imagem. Os insetos foram coletados utilizando uma rede entomológica, identificados e posteriormente depositados como vouchers na Coleção Camargo (RPSP) do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Sistema reprodutivo Para a realização dos estudos sobre o sistema reprodutivode Mesadenella cuspidata, seis indivíduos foram submetidos a três tratamentos experimentais: autopolinização manual (n=30 flores), polinização cruzada (n=30 flores) e emasculação (teste para apomixia) (n=30flores), sendo polinizadas cinco flores para cada tipo de tratamento, de modo que cada indivíduo fosse submetido a todos os tratamentos manuais. Além disso, observações sobre autopolinização espontânea (n=30 flores) foram realizadas. Os indivíduos utilizados nos tratamentos e nas observações sobre autopolinização espontânea foram coletados na Reserva 85

89 Biológica Serra do Japi e mantidos em cultivo no orquidário (LBMBP), tendo em vista que a retirada de indivíduos da população do Parque Estadual de Vassununga pudesse acometer as outras análises. Taxa de frutificação em condições naturais As informações sobre a taxa de frutificação em condições naturais foram obtidas no Parque Estadual de Vassununga em março de Foram amostrados 30 indivíduos da população de estudo, contando-se o número de flores produzidas e a quantidade de frutos desenvolvidos. Análise da viabilidade das sementes Para a análise sobre a viabilidade das sementes, frutos deiscentes foram obtidos das polinizações manuais. Uma amostra de 200 sementes por frutos foi analisada sob um microscópio de luz. As sementes foram classificadas em viáveis e não viáveis de acordo com o desenvolvimento dos embriões, sendo consideradas não viáveis as sementes sem embriões ou com embriões rudimentares (Pansarin et al. 2008). 86

90 Resultados Mesadenella cuspidataéterrícola e apresenta folhas cuneiformes de coloração predominantemente verde a verde com maculas brancas, margem lisa e ápice agudo. Cada indivíduo produz uma inflorescência racemosa apical com flores espiraladamente dispostas. As flores de Mesadenella cuspidata se abrem nos meses de favereiro a abril, entre o verão e o outono e liberam uma fragrância adocicada nas horas mais quentes do dia que é composta por 16 voláteis diferentes que são: tetradecanol como mais abundante, apresentando uma porcentagem de área relativa de 38,78%, seguido por tridecanol com área relativa de 7,33%; pentacosano com 6,62%; tridecano com 5,72%; 1-tetradecanol com 5,52%; ácido octodecanóico com 5,18%; 3,11-tetradecadien-1-ol com4,84%; tridecan-1-ol com 3,82%; cis- 11-hexadecenol com 3,28%; 5-tetradecano com 2,77%; hexadecanal com 2,25%; ácido hexodecanóico com 1,93%; 9-tetradecenol 1,69%; dodecano com 1,4%; pentadecano e por ultimo, o menos abundante11-dodecenol com 0,93% (Fig. 1). Suas flores são pediceladas e ressupinadas de coloração predominantemente branca e amarela na parte central e permanecem abertas por um período de 15 dias. Suas pétalas (X= 2,08 ± 0,26 x 4,61 ± 0,44) são falcadas, inteiramente brancas, com margem lisa e ápice agudo; a sépala dorsal mede X= 2,21 ± 0,28 x 5,13 ± 0,61 apresenta coloração verde, margem lisa e ápice agudo; as sépalas laterais medem X= 2,61 ± 0,28 x 6,58 ± 0,76 são falcadas, apresentam coloração verde e branca com margem lisa e ápice agudo; o labelo mede X= 2,88 ± 0,53 x 5,96 ± 0,60 apresenta papilas, coloração branca e amarela com margem lisa e ápice agudo; a coluna (X= 1,1 ± 0,20 x 3,11 ± 0,38) apresenta coloração inteiramente branca com uma projeção no ápice; a antera (X= 0,53 ± 0,12 x 1,41 ± 0,18) apresenta coloração marrom; o polinário (X=0,53 ± 0,12 x 1,73 ± 0,33) é formado por duas polínias quebradiças, estipe e viscídio com a porção adesiva dorsal (Tabela 2). 87

91 As sépalas laterais fundem-se ao labelo em sua base para formar um nectário em forma de bojo que armazena em média X= 1,43 ± 0,87 de néctar com uma concentração média de X= 39,50% ± 5,98 de açúcar. O néctar é produzido e secretado por glândulas digitiformes que estão presentes sobre as margens do labelo em sua base (fig. 2A-B). A produção de néctar foi confirmada através dos testes histoquímicos, em cortes transversais do nectário (Fig. B) Suas flores são protândricas e a fase masculina (doadora de pólen) e a feminina (receptora de pólen) é separada pela mecânica de abertura das flores no processo da antese. No estádio masculino, as flores ainda no início da antese apresentam uma forma tubular com uma abertura estreita com X= 0,9 ± 0,05 mm diâm., período em que as flores não podem ser polinizadas, sendo possível somente a remoção do polinário através da abertura pelas abelhas (Fig. 1A-C-E). As flores permanecem na fase masculina por até 48 horas. No estádio feminino as flores se encontram completamente abertas, apresentando uma abertura com X=3,0 ± 0,03 mm diâm (Fig. 1B-D-F). Durante esta fase, as flores atuam como receptoras de pólen, podendo agir também como doadoras de pólen. A antese acontece durante um período de aproximadamente 72 h, até que as peças florais estejam completamente livres e o labelo com distensão completa em direção a base. As flores de Mesadenella cuspidata foram visitadas e polinizadas por abelhas cleptoparasitas fêmeas do gênero Osiris Smith 1854 (Fig. 2C), abelhas Halictidae da espécie Augochlorella tredecim Vachal 1911 (Fig.2D) e por abelhas clapetoparasitas fêmeas da espécie Rhathymus friese Ducke 1907 (Fig. 2E). Além disso, abelhas operárias da espécie Plebeia droryana Friese 1900 (Meliponini) também foram observadas pilhando néctar em suas flores (Fig. 2F). 88

92 As abelhas iniciam suas visitas às flores de Mesadenella cupidata por volta de 09:30, se estendendo por até 14:00 h aproximadamente. As abelhas da família Halictidae visitam as flores aleatórimente. Diferentemente, as abelhas Osiris sp. e Rhathymus friese visitam as flores de forma sistêmica, apresentando um comportamento de forrageio em rota.todas as espécies de abelhas na maioria das vezes visitaram uma ou mais raramente duas flores em um mesmo indivíduo, permanecendo nas flores de 5 a 10 segundos. As visitas têm início com a abelha pousando sobre uma flor. Em seguida, introduz a glossa em seu interior para alcançar o nectário e acessar o néctar. Neste momento, as peças bucais das abelhas entram em contato com o viscídio do polinário, que fica aderido a superfície da estrutura, sendo removido sem a antera, que fica retida na coluna. A polinização ocorreu quando uma abelha carregando um polinário visitou uma flor no estádio feminino. As abelhas visitam as flores somente em dias ensolarados e quentes. A espécie Mesadenella cuspidata é autocompatível, porém não autógama dependente de um polinizador. Nos tratamentos de emasculação e nas flores submetidas à autopolinização espontânea não houve desenvolvimento de frutos. As flores submetidas à autopolinização manual resultaram em 66,6% de frutos. E em polinização cruzada as flores resultaram em 86,6% de frutos. A taxa de sementes potencialmente viáveis nos frutos provenientes destes tratamentos foi de 78,7% em autopolinização manual e 70,9% nos frutos originados dos tratamentos manuais de polinização cruzada. Em condições naturais, no ano de 2013 os indivíduos em que as flores foram submetidas à polinização aberta resultaram em 74,1% de frutos e em 2014, 62,4% (Tabela 2). 89

93 Compostos voláteis 11-dodecenol pentadecano dodecano 9-tetradecenal acido hexadecanóico hexadecanal 5-tetradecano cis-11-hexadecenal trideca-1-ol 3,11-tetradecadien-1-ol acido octodecanóico 1-tetradecanol tridecano pentacosano tridecanol tetradecanol Abundância relativa (%) Figura 1: Abundância relativa dos compostos voláteis detectados na fragrância floral de Mesadenella cuspidata, no município de São Simão, São Paulo. 90

94 Tabela 1: Variação, Média (X) e desvio padrão (DP) das estruturas florais de Mesadenella cuspidata no Parque Estadual de Vassununga, município de Santa Rita do Passa Quatro - SP. Estruturas Comprimento (mm) Variação X DP Largura (mm) Variação X DP Pétalas 4,0-5,5 4,6 0,44 2,0-2,5 2,08 0,26 Labelo 5,0-6,5 5,96 0,60 2,0-3,5 2,88 0,53 Sépalas 6,0-7,5 6,58 0,76 2,5-3,0 2,61 0,28 Sépala dorsal 4,0-5,5 5,13 0,61 2,0-2,5 2,21 0,28 Coluna 2,0-3,5 3,11 0,38 1,0-1,5 1,1 0,20 Antera 1,0-1,5 1,41 0,18 0,5-1,5 0,53 0,12 Polinário 1,5-2,0 1,73 0,33 0,5-1,0 0,53 0,12 91

95 Figura 2:Protandria em flores de Mesadenella cuspidata. Vistas laterais, frontais e cortes longitudinais de flores em diferentes fases sexuais. A-C, Fase masculina (doadoras de pólen), em que a forma tubularda flor e abertura estreita evitam a polinização. B-D, Fase feminina, (receptoras de polén), em que as flores se encontram completamente abertas expondo o 92

96 estigma e permitindo o acesso. E, Corte lateral da flor na fase masculina. F, Corte lateral da flor na fase feminina. 93

97 Figura 3: Glândula produtora de néctar, flores e polinizadores de Mesadenella cupidata. A, Corte lateral da flor evidenciando uma glândula de néctar. B, Corte transversal das glândulas de néctar.c, Abelha do gênero Osiris polinizado. D, Abelha da família Halictidae 94