UTILIZAÇÃO DE MEMBRANAS PLANAS NA CONCENTRAÇÃO DE ENZIMAS BROMELINAS DA POLPA DE ABACAXI (Ananas comosos L. )

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1 ISSN UTILIZAÇÃO DE MEMBRANAS PLANAS NA CONCENTRAÇÃO DE ENZIMAS BROMELINAS DA POLPA DE ABACAXI (Ananas comosos L. ) Francisco Luiz Gumes Lopes1, João Baptista Severo Júnior2, José Carlos Curvelo Santana1, Roberto Rodrigues de Souza3, Elias Basile Tambourgi4 RESUMO O Brasil é um dos grandes produtores mundiais de abacaxi (Ananas comosos), sobretudo das espécies Pérola e Smooth Caienne. Estes são fontes da enzima proteolítica bromelina (EC ), um produto de alto valor comercial, que não é produzido no país. A bromelina é uma hidrolase encontrada em todas as espécies do gênero Bromeliaceae, com massa molar próxima de 31 kda, muito utilizada pela indústria de alimentos, pela medicina e também em procedimentos técnicos de análises clínicas laboratoriais. O processo de separação por membrana é uma alternativa entre os processos de separação existentes para recuperar, concentrar e até purificar macromoléculas. O trabalho objetivou recuperar a enzima bromelina obtida a partir do abacaxi utilizando processos de separação por membranas planas. Os resultados mostraram que nas menores pressões transmembrana há uma menor perda da atividade enzimática da bromelina, indicando que a melhor pressão para ser utilizada neste processo é a,5 Kgf/cm 2. Conclui-se que é possível recuperar a enzima bromelina através da utilização de membranas, tendo como conseqüência uma agregação de valor ao produto, bem como foi possível identificar condições operacionais que minimizem e até mesmo eliminem a perda da atividade da enzima em estudo. Palavras chave: Ananas comosos, bromelina, atividade enzimática, membranas planas. UTILIZATION OF PLAIN MEMBRANES IN BROMELINS ENZYMES CONCENTRATION FROM PINEAPPLE (Ananas comosos) PULP ABSTRACT Brazil is a great pineapple world-wide producer (Ananas comosus), mainly of Pérola and Smooth cayenne species. These are sources of the bromelin enzyme (EC ), a valuable product, that isn t manufactured in this country. Bromelian is a hydrolase found in all the species of generic bromeliaceae, with molar mass of 31 kda, much utilized by food industry, medicine and in laboratory clinic analyses. Membrane separation process is an alternative among other separation process, recovering and purifying, macromolecules. The work aimed to recover the pineapple bromelin enzyme by plain membrane separation process. The results showed there is a low loss of the enzymatic activity of bromelin enzyme in low pressures, it introduces that the best pressure to be used in utilizing this process is,5 Kgf/cm 2. We conclude that is possible to recover the bromelin enzyme through the plain membrane, aggregating value to the product, beyond of it was possible to identify the operation conditions that reduce and until eliminate the loss of enzymatic activity of the studied enzyme. Keywords: Ananas comosos, bromelian, enzymatic activity, plain membranes. Protocolo 728 de 23/5/24 1 Doutorandos em Engenharia Química Departamento de Engenharia e Sistemas Químicos da FEQ / UNICAMP jccurvelo@yahoo.com.br. 1 Graduando em Engenharia Química pelo Departamento de Engenharia Química do CCET/ UFS. 1 Professor do Departamento de Engenharia Química do CCET/ UFS, Cid. Universitária Prof. Aloísio de Campos, S/N, Rosa Elze, São Cristóvão SE, CEP: 491- Tel: rrsouza@ufs.br 1 Professor do Departamento de Engenharia e Sistemas Químicos da FEQ / UNICAMP, Cid. Universitária Zeferino Vaz, Rua Albert Einstein, S/N, Barão Geraldo, Campinas SP, Caixa Postal: 666, , Tel: xx

2 34 Utilização de membranas planas na concentração de enzimas bromelinas da polpa de abacaxi INTRODUÇÃO O Brasil é um dos grandes produtores mundiais de abacaxi (Ananas comosos), sobretudo das espécies Pérola e Smooth Caienne. O abacaxi fruto é a parte comercializável da planta, sendo a polpa em calda e o suco pasteurizado os principais produtos industrializados. No Estado de Sergipe, a abacaxicultura tem sido uma alternativa para a agricultura regional, tradicionalmente, voltada para o cultivo de mandioca, milho e feijão. O abacaxi é fonte da enzima proteolítica bromelina, um produto de alto valor comercial, que não é produzido no Brasil. Esta é encontrada no fruto, no talo, no caule, nas folhas e nas raízes do abacaxizeiro e, em todas as espécies do gênero Bromeliaceae, com massa molar próxima de 31 kda (Martins et al., 1992). No talo, tem-se uma enzima sulfidrílica que recebe o nome de bromelina do talo e tem o número sistemático EC , enquanto que, no fruto tem-se uma proteína ácida que é chamada de bromelina do fruto ou, simplesmente, bromelina, com o número sistemático EC (César, 2; Bertevelo, 21). A bromelina não está presente nos primeiros estágios de desenvolvimento do fruto, porém, seu nível aumenta, rapidamente, mantendo-se elevado até o amadurecimento, onde tem um pequeno decréscimo. Esta é uma das vantagens da utilização das proteases do abacaxi em comparação com outras proteases vegetais. O abacaxi é o único fruto que possui concentrações, relativamente, altas de proteases, no estado maduro (César, 2; Bertevelo, 21). A bromelina é utilizada na indústria de alimentos, na indústria cervejeira, na medicina, na indústria farmacêutica brasileira e, também, no uso em procedimentos técnicos de análises clínico-laboratoriais (César, 2; Freiman & Srursabaa, 1999; Freiman & Srursabaa, 1996). O processo de separação, utilizando membranas, é uma alternativa aos processos de separação existentes, que vem sendo muito difundido, nos últimos anos. Uma membrana pode ser definida como uma barreira que separa duas fases e que restringe total ou parcialmente o transporte de uma ou várias espécies químicas presentes na fase. A membrana controla a taxa de transporte relativo de várias espécies e, como toda separação, fornece um produto menos concentrado de certos componentes e um outro produto mais concentrado nestes componentes (Cheryan, 1986; Noble & Way, 1993). A filtração tangencial ocorre, quando o fluxo da suspensão ou solução alimentada for paralelo à membrana e perpendicular ao fluxo de permeado. Dessa forma, a espessura da camada depositada não aumenta indefinidamente, devido às tensões de corte originadas pelo fluxo tangencial à superfície da membrana, atingindo-se um estado estacionário que permite uma operação em contínuo. Os processos que envolvem filtração tangencial são usados para recuperar. concentrar ou purificar soluções. Um dos principais módulos de membranas mais utilizadas em filtração tangencial é o módulo de membranas planas de placas e quadros (Santos, 1996). O trabalho objetivou recuperar a enzima bromelina obtida, a partir da polpa do abacaxizeiro, utilizando processos de separação por membranas planas, avaliando as melhores condições operacionais que resultem em maiores valores de proteína total e de atividade, contribuindo para agregação de valor para este produto agrícola. MATERIAIS E MÉTODOS Obtenção da Enzima A enzima foi obtida, a partir do suco concentrado da polpa do abacaxi (Ananas comosos), preparado em condições de pressão e temperatura ambiente, depois de realizada uma filtração inicial, utilizando-se uma camada de algodão para retenção de sólidos dispersos, e em seguida, o ph do meio foi ajustado para 7,5 com tampão fosfato. Preparo das Soluções Tampão Foram preparados tampões fosfato 1 mol/l, a partir de soluções de estoque de fosfato monobásico de potássio e fosfato dibásico de sódio, conforme descrito por Morita & Assumpção (1986). Determinação da Concentração de Proteína Total A determinação da concentração de proteína total no permeado e no concentrado foi realizada através do método de Bradford (1976).

3 Utilização de membranas planas na concentração de enzimas bromelinas da polpa de abacaxi Determinação da Atividade Enzimática Foram realizadas análises, tanto no permeado quanto no concentrado, pelo método descrito por Murachi (1976) e Baldini (1993), através da hidrólise enzimática da caseína a 1,2% (p/v) ph 7,5, com leitura de absorbância a 28 nm a 35 o C durante 1 minutos, seguindose de precipitação do substrato não hidrolisado com solução de ácido tricloroacético (TCA). Sistema de Membrana Foram utilizados módulos de membranas constituídos por suportes planos, comportando uma folha de membrana em cada um dos lados e espaçadores colocados, alternadamente, entre os suportes, com o fluxo de alimentação circulando, tangencialmente, à superfície da membrana. O fluxo de permeado circulou entre os espaçadores e recolhido em canais apropriados, foram realizados experimentos de microfiltração da enzima bromelina utilizando membranas de polivinila com área de,225 m 2 e tamanho dos poros igual a,1 µm. As pressões utilizadas foram,5;,1 e,15 kgf/cm 2. RESULTADOS E DISCUSSÃO Fluxo do No processo de separação por membrana, temos, ao longo do tempo, a formação de uma camada limite sobre a superfície da membrana que dificulta a transferência do produto que se deseja separar. Na Figura 1, pode-se observar que todos os fluxos tiveram o mesmo comportamento, que estão em consonância com a literatura (Cheryan, 1993; Noble & Way, 1986; Santos, 1996). Para a maior pressão, observa-se que há um maior fluxo inicial, tornando o processo mais rápido, enquanto que para o menor valor da pressão transmembrana, observa-se um menor fluxo e um maior tempo de operação. Estas diferenças afetam a característica do produto de modo que se deve compatibilizar as condições operacionais com as do produto que se deseja recuperar (Santos, 1996). 1 Fluxo de (L/h.m 2 ) 8 6 2,15 kgf/cm 2,1 kgf/cm 2,5 kgf/cm Tempo (min) Figura 1 Fluxo do versus Tempo Proteína Total O acompanhamento desta variável, durante todo o processo de recuperação da enzima bromelina deve-se ao fato de podermos verificar como estar ocorrendo a transferência da enzima do concentrado para o permeado em função do tempo de operação e das condições operacionais, conforme mostra as Figuras 2 a 4. Analisando-se as Figuras 2, 3 e 4 pode-se concluir que, independentemente, da pressão transmembrana, a concentração de proteína total, no permeado, ao final do processo, não varia tanto, uma vez que esta variável é a força motriz do fenômeno de transferência neste processo. Assim, a conseqüência principal se reflete no tempo de operação do processo e

4 36 Utilização de membranas planas na concentração de enzimas bromelinas da polpa de abacaxi conseqüentemente na viabilidade econômica (Cheryan, 1993; Santos, 1996). 2 2 Concentração (mg/l) Tempo (minutos) Figura 2 Concentração de Proteína Total versus Tempo (Vazão = 5,48 L/h ; Pressão Transmembrana =,5 kgf/cm 2 ) 2 2 Concentração (mg/l) Tempo (minutos) Figura 3 Concentração de Proteína Total versus Tempo (Vazão = 5,48 L/h ; Pressão Transmembrana =,1 kgf/cm 2 )

5 Utilização de membranas planas na concentração de enzimas bromelinas da polpa de abacaxi Concentração (mg/l) Tempo (minutos) Figura 4 Concentração de Proteína Total versus Tempo (Vazão = 5,48 L/h ; Pressão Transmembrana =,15 kgf/cm 2 ) Atividade Enzimática Esta é a principal variável a ser avaliada, uma vez que, no caso de enzimas, não adianta ter elevadas eficiências de separação, se o produto obtido não tiver atividade, ou seja, se o produto perder sua função catalítica (Murachi, 1976). Na Tabela 1, pode-se observar que a maior atividade enzimática por unidade de volume foi obtida para a pressão transmembrana de,1 Kgf/cm 2, entretanto esta variável por si só não permite avaliar o grau de separação obtido. Para se ter um indicador do grau de separação, utiliza-se a atividade enzimática específica que consiste na razão entre a atividade e a concentração de proteína no final do processo. Assim, por esta análise, tem-se que o grau de separação para a menor pressão transmembrana é de 3 vezes, enquanto que para a intermediária e a maior são de 4 e,6 vezes, respectivamente. Isto mostra que mesmo ocorrendo elevada transferência de proteína total, não significa que houve a recuperação da proteína específica, neste caso a bromelina. Os valores obtidos para os fluxos de permeado, assim como para a proteína total e a atividade enzimática estão em consonância com a literatura, mostrando ser possível a recuperação e até mesmo a purificação da enzima bromelina obtida do abacaxi (Ananas comosos) (Bertevelo, 21; Freiman & Srursabaa, 1999, Freiman & Srursabaa, 1996). Tabela 1 Atividade enzimática da Bromelina Pressão Atividade Enzimática (U/mL) Transmembranar (Kgf/cm 2 ) Inicial Final Final Global,5 6,134 1,447 12,38 2,373,1 4,773 3,558 6,45 6,277,15 3,934 3,153,23 2,112 CONCLUSÃO Neste estudo, pode-se concluir que a menor pressão transmembranar resultou num maior grau de separação, mostrando que, no caso de macromoléculas, deve-se operar com condições operacionais que não descaracterizem a molécula de interesse. No sistema de membrana plana, tem-se o efeito da perda de carga muito mais elevado o que contribui para que a pressão não seja elevada evitando a desnaturação da enzima durante o processo de separação. REFERÊNCIA S BIBLIOGRÁFICAS Baldini, V. L. S. et al. Ocorrência da bromelina e cultivares de abacaxizeiro.

6 38 Utilização de membranas planas na concentração de enzimas bromelinas da polpa de abacaxi Colet. ITAL, v. 23, n.1, p , Campinas, Bertevelo, L. A. Estudo do processo de recuperação e separação de bromelina utilizando sistema de duas fases aquosas em micro-coluna de extração. Tese de Doutorado. Campinas, SP, Brasil,FEQ/UNICAMP, 21. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein. Utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem , Cesar, A. C. W. Otimização dos parâmetros de extração líquido-líquido em duas fases aquosas na recuperação da bromelina presente no abacaxi. Dissertação de Mestrado. Campinas, SP, Brasil, FEQ/UNICAMP, 2. Cheryan, M. Ultrafiltration Handbook, Lancaster, Technomic Publishing Company, Inc Freiman, L. O. & Srursabaa, A. U. O. Determinação de proteína total e escore de aminoácidos de bromelinas extraídas dos resíduos do abacaxizeiro. Ciência e Tecnologia de Alimentos, vol. 19, n. 2, Freiman, L. O. & Srursabaa, A. U. O. Aproveitamento dos resíduos da agroindústria do abacaxi (Ananas comosus (L) Merril) para a produção de bromelina. Ciência e Tecnologia de Alimentos, vol. 16, n. 3, pg , Martins, Z. J. de et al. Processamento: produtos e subprodutos, características e utilização. In Instituto de Tecnologia de Alimentos. Abacaxi, cultura, matéria prima, processamento e aspectos econômicos. 2 ed. Campinas ITAL. pp. 165 a 219 (Série Frutas Tropicais n o 2), Morita, T. & Assumpção, R. M. V. (Eds.). Manual de Soluções, Reagentes e Solventes. Padronização Preparação Purificação. Edgard Blücher Ltda, 2ª ed., São Paulo SP, Brasil, Murachi, T. Bromelain enzyme. In: LORAND, L: Methods in Enzymology, v. XLV, p , New York, Academic Press, Noble, R. D. & Way, J. D. Description of facilitated transport and enviromental applications. Membrane processes in separation and purification. London, Kluwer Academic Publishers (Nato ASI Series, v. 272). Santos, J. A. L. Estudo de separação de uma proteína recombinante por processos de membranas, Tese de Doutorado. Lisboa, Universidade Técnica de Lisboa Instituto Superior Técnico, 1996.