Bases Moleculares da Hiperplasia Adrenal Congênita

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1 Bases Moleculares da Hiperplasia Adrenal Congênita Molecular Bases of Congenital Adrenal Hyperplasia. Congenital adrenal hiperplasia (CAH) is a recessive autossomic disease caused by inherited defects in cortisol biosynthesis. The manifestations are caused both by the deficient synthesis of cortisol, and sometimes of aldosterone, and by accumulation of the precursor steroids. The objective of this review is to present the molecular mechanisms of the main enzymatic defects involved in the etiopathogenesis of CAH. Deficiency of 21-hydroxylase (21OH) accounts for more than 95% of all cases of CAH. The human genome contains two CYP genes: one active, CYP21, and a pseudogene, CYP21P. Both are highly homologous (98%), facilitating recombination events during meiosis, leading to duplication and/or deletion or conversion of these genes. Additionally, point mutations have also been described. Deficiency of 11β-hydroxylase (11βOH) is caused by mutations in the CYP11B1 gene, and accounts for 5% of all cases. Some mutations are recurrent, and mainly located on exons 6-8, which is considered a hot-spot area in CYP11B1 gene. Deficiency of 17α-hydroxylase (17OH) is caused by mutations in the CYP17 gene, producing a truncated or impaired protein. These mutations have been described in patients with combined defiatualização RESUMO Hiperplasia adrenal congênita (HAC) é uma doença autossômica recessiva decorrente da alteração de enzimas que participam da síntese do cortisol. As manifestações podem ser causadas pela deficiência do cortisol e, em alguns casos, aldosterona e pelo acúmulo de precursores. O objetivo desta revisão é apresentar os mecanismos moleculares dos principais defeitos enzimáticos envolvidos na etiopatogênese da HAC. A deficiência da 21-hidroxilase (21OH) ocorre em 95% dos casos de HAC. Existem dois genes que codificam o P450c21: um ativo, CYP21, e um pseudogene CYP21P. Ambos são altamente homólogos (98%), o que favorece o emparelhamento desigual dos cromossomos homólogos durante a meiose, levando a duplicações e/ou deleções ou conversões desses genes. Adicionalmente, foram também descritas mutações de ponto, muitas delas presentes no pseudogene sugerindo microconversões. Mutações no gene CYP11B1 causam HAC por deficiência da 11βhidroxilase, forma esta que corresponde a 5% dos casos. Algumas mutações são recorrentes, situando-se principalmente entre os exons 6-8 que representaria uma área hot-spot no gene CYP11B1. A deficiência de 17-hidroxilase é causada por mutações no gene CYP17, que codificam uma proteína alterada, levando a deficiência total ou parcial de 17- hidroxilação e 17,20-liase ou deficiência isolada de 17,20-liase. Finalmente, deficiência de 3β-HSD é causada por mutações no gene HSD3B2, que codifica a enzima 3β-HSD tipo II e estas mutações têm sido associadas tanto com a forma clássica como com a forma não clássica da deficiência da 3β-HSD. (Arq Bras Endocrinol Metab 2002;46/4: ) Descritores: Hiperplasia adrenal congênita; Deficiência de 21-hidroxilase; Deficiência de 11β-hidroxilase; Deficiência de 17-hidroxilase; Deficiência de 3β-HSD Maricilda Pallandi de Mello Tânia A.S.S. Bachega Marivânia da Costa-Santos Lívia Mara Mermejo Margaret de Castro Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) UNICAMP (MPM), Campinas, SP; Laboratório de Hormônios e Genética Molecular, Disciplina de Endocrinologia, Hospital das Clínicas FMUSP (TASSB); Universidade Federal de São Paulo -UNIFESP/EPM (MC-S), São Paulo, SP; e Divisão de Endocrinologia, Departamento de Clínica Médica - FMRP-USP (LMM, MC), Ribeirão Preto, SP. ABSTRACT Recebido em 29/07/2002 Aceito em 02/08/

2 ciencies of 17OH and 17,20-lyase or with isolated 17,20-lyase. Finally, CAH caused by 3β-HSD deficiency is the consequence of mutations in the gene HSD3B2 that encodes 3β-HSD type II. In the classical form of the disease nonsense mutations, insertion and deletions have been described, while in non classical forms, mutations result in diminished enzyme affinity and loss of enzyme activity. (Arq Bras Endocrinol Metab 2002;46/4: ) Keywords: Congenital adrenal hyperplasia; 21- hydroxylase deficiency; 11β-hydroxylase deficiency; 17-hydroxylase deficiency; 3β-HSD deficiency HIPERPLASIA ADRENAL CONGÊNITA POR DEFICIÊNCIA DA 21-HIDROXILASE AHIPERPLASIA ADRENAL CONGÊNITA (HAC) por deficiência da 21-hidroxilase (21OH) é o mais freqüente dos defeitos enzimáticos adrenais, ocorrendo em 95% dos casos de HAC (1). A enzima 21OH participa da síntese dos glico e dos mineralocorticóides. Sua ação é converter a progesterona em desoxicorticosterona (DOC) e a 17OH-progesterona (17OHP) em 11-desoxicortisol (S), que por sua vez é convertido em cortisol sob ação da 11-hidroxilase (11OH). A redução da atividade da 21OH com decorrente diminuição da síntese de cortisol resulta em estimulação crônica do córtex adrenal pelo ACTH com hiperplasia adrenal e superprodução dos precursores do cortisol. Estes precursores são desviados para a biossíntese dos andrógenos, que não necessita da atividade da 21OH, causando os sinais de virilização característicos em indivíduos com esta deficiência enzimática. Tradicionalmente é classificada em duas formas clínicas: clássica, que inclui os subgrupos perdedora de sal e virilizante simples; e não clássica, que inclui os subgrupos sintomática e assintomática (ou críptica). A forma virilizante simples caracteriza-se por graus variados de virilização pré-natal da genitália externa no sexo feminino e virilização pós-natal em ambos os sexos, com aumento do clitóris ou pênis, pubarca precoce e avanço da idade óssea com prejuízo na estatura final. A forma perdedora de sal, além da hiperprodução androgênica da forma anterior, apresenta deficiência mais severa na produção de aldosterona levando à desidratação com hiponatremia e hiperpotassemia nos primeiros 30 dias de vida que, se não tratada, resulta em choque e óbito. A forma de início tardio sintomática não apresenta virilização pré-natal e os sintomas iniciam-se em épocas variáveis, resultando em pubarca precoce, amenorréia primária ou secundária, hirsutismo, acne e infertilidade. A forma não clássica assintomática apresenta o mesmo perfil hormonal da forma sintomática, porém sem manifestações clínicas, sendo geralmente diagnosticada na investigação dos familiares de um paciente (2). Os programas de rastreamento neonatais sugerem uma freqüência da forma clássica em 1:5.000 a 1: nascimentos na maioria das populações caucasianas, enquanto que a forma não clássica ocorre aproximadamente em 1 a 2% da população geral (3,4). Estas formas não representam diferentes doenças, mas um contínuo espectro na severidade da deficiência da 21OH. Genética Molecular A 21-hidroxilação é mediada por uma enzima mitocondrial específica denominada P450c21; seu gene codificador está localizado no locus do complexo principal de histocompatibilidade humana no braço curto do cromossomo 6, 6p21, especificamente dentro do locus do HLA classe III (5). Devido à íntima relação da 21OH com os genes do complexo HLA, observou-se que indivíduos afetados de uma mesma irmandade eram quase que invariavelmente HLA idênticos (6). Por esta razão, antes do advento da clonagem do gene da 21OH, a tipagem do HLA foi muito utilizada no diagnóstico pré-natal das gestações de risco. Não existe um haplótipo que seja diagnóstico de uma forma clínica específica da deficiência da 21OH. Entretanto, algumas correlações podem ser feitas: o HLA-Bw47; DR7 está presente em 20% a 25% dos alelos da forma clássica e o HLA-B14; DR1 está presente em 70% dos alelos da forma não clássica, principalmente em judeus do leste europeu (7,8). Essas combinações recebem o nome de haplótipos. Posteriormente, com a clonagem dos genes da 21OH foram descobertas as mutações que esses haplótipos carregavam. Existem dois genes para o P450c21, um pseudogene CYP21P e um gene ativo CYP21. Ambos contêm 10 exons, suas seqüências são 98% idênticas nos exons e 96% idênticas nos introns (9). O CYP21P é um pseudogene porque não codifica uma proteína devido à presença de várias mutações, sendo as mais comuns: deleção de 8 pares de bases no exon 3, inserção de T no exon 7 (as quais geram uma alteração na matriz de leitura), e uma substituição de C por T no exon 8 (que cria um "codon" prematuro de parada da leitura). O gene CYP21 codifica uma proteína com 494 aminoácidos. Os genes CYP21 e CYP21P se estendem sobre uma região de aproximadamente 30Kb, adjacentes e alternando com os genes C4A e C4B que codificam o quarto componente do complemento sérico (5,10). Recentemente foram descobertos outros pares de genes XA, XB, YA, YB, ZA e ZB (figura 1) (11). Os genes XA e XB sobrepõem-se ao último exon do 458

3 Figura 1. Diagrama da região C4/CYP21/TN-X no braço curto do cromossomo 6. As setas indicam o sentido da transcrição. CYP21P e CYP21 respectivamente. Estes genes são transcritos em sentido oposto aos genes da 21OH e XB codifica uma importante matriz protéica extracelular. Os genes YA e YB superpõem-se aos genes CYP21P e CYP21 e o YA usa o promotor do CYP21P, sugerindo que o pseudogene possa ter alguma função no córtex adrenal. Os genes ZA e ZB apresentam transcritos adrenais, mas como os dos genes YA e YB, suas funções ainda não são conhecidas. Esta região de genes duplicados C4A-ZA-CYP21P-XA-YA; C4B- ZB-CYP21-XB-YB apresenta um extremo grau de identidade de nucleotídeos e favorece o emparelhamento desigual dos cromossomos homólogos durante a meiose, o que pode levar ao aparecimento de duplicações e/ou deleções desses genes. A técnica de Southern blotting seguida de hibridação com sonda específica permite a verificação do número de cópias de um gene. Através desta metodologia podemos pesquisar a deleção do gene CYP21, que foi a primeira mutação descrita responsável pela deficiência da 21OH. Em decorrência de um emparelhamento desigual dos cromossomos durante a meiose, ocorre a formação de um alelo com duplicação da unidade C4B-CYP21 e outro com perda desta unidade, que é o alelo responsável pela HAC-21OH (10,12) (figura 2). Em 98,2% dos casos a deleção compreende 30Kb estendendo-se de algum ponto entre os exons 3 e 8 do CYP21P, através do C4B até o ponto correspondente no CYP21. Assim, o alelo resultante é um híbrido onde a porção 5 apresenta a seqüência do CYP21P e seu extremo 3 a seqüência do CYP21. Estima-se que as deleções do gene CYP21 ocorram em 25% dos alelos nas formas perdedoras de sal em diversas populações caucasianas e do oeste europeu. Baixa freqüência de deleções têm sido restritas a populações específicas tais como: nas populações mexicana e japonesa com freqüência <2%, na população argentina com freqüência de 7% (13-15). No Brasil, onde a maioria da população tem ascendência portuguesa e casamentos interraciais com negros e índios são freqüentes, também observamos uma freqüência baixa de deleções, da ordem de 4% e de 7% em dois estudos populacionais (16,17). Figura 2. Esquema de crossing-over desigual durante a meiose entre os genes C4 e CYP21, gerando um alelo com duplicação do C4B e CYP21 (I) e outro alelo com deleção do C4B e CYP21 (II). A segunda mutação descrita na HAC-21OH foi a conversão gênica, que também ocorre por um emparelhamento desigual dos genes durante a meiose. Neste caso ocorre a troca de somente uma fita de DNA entre os genes CYP21 e CYP21P, transferindo seqüências deletérias do pseudogene para o gene ativo (18) (figura 3). A freqüência das conversões varia de 10 a 15% entre as diversas populações, estando presente principalmente na forma clássica (tabela 1). Na população brasileira sua freqüência foi de 17% em estudo que incluiu pacientes com a forma clássica (16) e de 7% em estudo que incluiu as três formas clínicas da HAC-21OH (17). A freqüência menor de mutações do tipo grandes rearranjos na nossa população sugere freqüência maior das mutações de ponto. São descritas também deleções e duplicações do pseudogene envolvendo principalmente o gene C4B, os quais aparecem também na população normal, não sendo portanto causa da doença. Estes rearranjos são considerados como pré-mutação, por facilitar o emparelhamento desigual dos genes durante a meiose. Estudos populacionais demonstraram que em 65 a 90% dos alelos estudados em pacientes com HAC-21OH não foram evidenciadas as grandes mutações do tipo deleção do CYP21 e conversão gênica, indicando que deveria existir outro tipo de alteração responsável pela patologia. Através do seqüenciamento destes genes e posteriores estudos de atividade enzimática in vitro evidenciou-se a presença de mutações de ponto, que quando em homozigose ou heterozigose composta poderiam ser responsáveis pela deficiência da 21OH (19). Atualmente estas mutações podem ser facilmente identificadas através de técnicas de rastreamento como hibridação oligo-específica (20) ou reação de polimerização em cadeia (PCR) alelo-específico (21). Foram descritas mais de 40 mutações de ponto responsáveis pela deficiência da 21OH (22). Destas, 9 são as mais freqüentes nas diversas populações estu- 459

4 Figura 3. Esquema de emparelhamento desigual durante a meiose entre CYP21P e CYP21 ocorrendo troca de apenas um fio da molécula de DNA, transferindo seqüências deletérias do pseudogene para o CYP21. Tabela 1. Freqüência (%) dos grandes rearranjos no gene CYP21 em diversas populações. País Alelos (n) Deleção Conversão CYP21 Inglaterra* 40 22,5** França ,0 7,7 Estados Unidos ,0 5,0 Japão* 46 2,2 4,3 Suécia ,8** Argentina México 106 <1 Brazil *UNICAMP 41 7,3 17,1 Brazil USP 186 4,0 7 * Apenas forma clássica, **% de conversões e deleções Dados obtidos das referências 25, 26. dadas (tabela 2) e estão presentes normalmente no pseudogene, sugerindo que foram transferidas para o gene ativo através de eventos de microconversões, devidas ao emparelhamento desigual destes genes durante a meiose (23,24). A substituição de uma adenina por guanina no nucleotídeo 668 do intron 2 constitui a mutação mais freqüente causadora da deficiência da 21OH. Esta mutação cria um novo sinal de término do intron e 19 nucleotídeos que deveriam ser retirados são retidos no RNAm alterando toda a rede de leitura, impedindo a síntese de uma proteína ativa. Ocorre entre 26 a 42% dos alelos de indivíduos afetados por HAC. A maioria dos pacientes homo ou hemizigotos para esta mutação tem a forma perdedora de sal. Ocasionalmente, a apresentação da perda de sal pode ser retardada para alguns meses de vida nos portadores desta mutação. Em um paciente de nossa amostra, homozigoto para esta mutação, a primeira crise ocorreu com seis meses de vida. A deleção de 8 pares de bases no exon 3 leva também a uma alteração na rede de leitura e codifica uma enzima completamente ineficiente, sendo encontrada em 3 a 10% dos alelos das formas perdedoras de sal. Um grupo de 3 mutações ocorre ao mesmo tempo (cluster) no exon 6 nos codons 236, 237 e 239 e causa a substituição de 3 aminoácidos: Ile, Val, Met Asn, Glu, Lis, respectivamente. Confere grave deficiência enzimática estando portanto mais associada à forma perdedora de sal. Ocorre com uma freqüência de 3 a 17% entre todos os alelos. A mutação Q318X é devida a uma substituição de citosina por timina, cria um codon prematuro de parada de leitura e gera uma proteína truncada que é inefetiva. Ocorre em 4 a 7% dos alelos da forma perdedora de sal. A mutação R356W decorrente de uma substituição de citosina por guanina altera a ligação da enzima com o substrato e ocorre em 14% dos alelos. A mutação I172N resulta de uma substituição de timina por adenina, originando a troca de um aminoácido polar por um não polar e interrompendo a ligação da enzima com o retículo endoplasmático. A atividade da enzima ao redor de 3% permite que seja produzida uma pequena quantidade de aldosterona, suficiente para impedir a crise de perda de sal, o que faz com que esta mutação esteja associada à forma virilizante simples. Apresenta-se numa freqüência de 5 a 10% dos alelos afetados. Duas mutações de menor gravidade, P30L e V281L, estão mais associadas à forma de início tardio. A mutação P30L no exon 1 ocorre devido à troca de uma citosina por uma timina e está presente em 17% dos alelos nas formas de início tardio. A mutação V281L é devida a uma substituição de guanina por timina causando uma troca conservativa de aminoácidos, o que origina uma mudança na conformação da proteína, reduzindo sua atividade enzimática. Sua freqüência nas formas de início tardio associada ao HLA-B14 varia de 78 a 84% dos alelos. A mutação P30L em geral tem expressão clínica mais grave do que a mutação V281L, todas as nossas pacientes portadoras desta mutação apresentaram clitoromegalia. A tabela 3 apresenta dados referentes às mutações de ponto em diversas populações. A freqüência das mutações de ponto em dois estudos populacionais brasileiros foi semelhante (25,26). As mutações mais freqüentes foram I2 splice, I172N e V281L e estiveram associadas significativamente com as formas perdedora de sal, virilizante simples e não clássica respectivamente (p<0,01) (25). Em geral as freqüências descritas em outros estudos não diferem das nossas, poucos casos onde diferenças foram observadas podem refletir variações individuais da amostra ou diferenças populacionais (26). 460

5 Tabela 2. Mutações de ponto mais freqüentes no gene CYP21, localização e atividade enzimática. Mutação Localização Atividade (%) Presença no Forma pseudogene Clínica Pro30Leu exon Sim NC I2 splice íntron 2 mínima Sim PS/VS del 8pb exon 3 0 Sim PS Ile172Asn exon Sim VS Cluster exon 6 0 Sim PS Val281Leu exon Sim NC Inserção de T exon 7 0 Sim PS Gli318stop exon 8 0 Sim PS Arg356Trp exon 8 2 Sim PS/VS Pro453Ser exon Sim NC PS: forma perdedora de sal, VS: forma virilizante simples, NC: forma não clássica Tabela 3. Freqüência (%) das mutações de ponto no gene CYP21 em diversas populações. Países Alelos P30L I 2 sp Del 8bp I172N Cluster V281L ins T Q318X 356W N exon 1 intron 2 exon 3 exon 4 exon 6 Exon 7 exon 7 Exon 8 exon 8 França 182 ** ** ** Estados Unidos 158 2, ,3 8,9 2,5 5,7 7,5 Japão* 46 ** 37 ** 24 ** ** ** 19,5 6,5 Suécia 186 1,6 30,5 1, ,5 3,2 4,3 Argentina 72 ** 18 2,7 15,3 0 ** ** 13,8 5,5 Brasil * UNICAMP 74 ** 24,7 1, ,1 5,8 11,3 8,2 Brasil USP 228 2,7 18,3 2,7 15 0,5 14,5% ** 4,8 8,6 *só forma clássica; **não estudado; Dados obtidos das referências 25,26. O gene CYP21 pode ser convertido em grandes segmentos do pseudogene contendo duas ou mais mutações de ponto, ou ainda, um mesmo alelo pode receber eventos diferentes de microconversão ao longo das gerações. Em nossa amostra, 6% dos alelos apresentaram duas ou três mutações de ponto. Por este motivo, recomenda-se, para adequado diagnóstico molecular, pesquisar no mínimo as nove mutações de ponto derivadas do pseudogene em todos os pacientes. Também é importante a segregação das mutações no DNA dos pais. Além de caracterizar a distribuição das mutações por alelo, permite diferenciar homozigose de hemizigose (indivíduos que têm uma mutação de ponto em um alelo e deleção no outro alelo). A pesquisa dos grandes rearranjos e das 9 mutações de ponto mais freqüentes são responsáveis por 80 a 85% dos alelos na população brasileira (25,26). Os demais alelos devem apresentar mutações novas, as quais não foram identificadas por terem sido empregadas técnicas de estudo dirigidas para mutações específicas. Estudos de seqüenciamento do gene CYP21 têm identificado mutações novas nas diferentes populações (22). De forma geral as mutações novas não estão presentes no pseudogene e representam eventos mutagênicos casuais, sendo descritas em casos isolados. Na população brasileira foram identificadas as mutações G424S e H28+C (27,28). A mutação G424S foi identificada em 7 pacientes portadores da forma virilizante simples, em desequilíbrio de ligação com o HLA-DR17 e deleção dos genes CYP21P e C4A. A presença do mesmo haplótipo em todos os portadores da mutação sugere uma origem comum ou seja, efeito de gene fundador. A mutação H28+C foi identificada em homozigose em uma menina portadora da forma perdedora de sal. Ocorreu a inserção de um nucletídeo C no codon 28, levando a uma alteração de toda a rede de leitura e a formação de uma parada prematura de leitura no codon 78, gerando uma proteína truncada. Ambas mutações não foram encontradas no estudo do pseudogene, sugerindo que não são provenientes de eventos de microconversão. Outras mutações novas em pacientes brasileiros estão em estudo quanto à possibilidade de gene fundador. Como a nossa população apresenta grau alto de miscigenação, é provável que estas sejam identificadas também em outras populações. Estudos de seqüenciamento complementando as técnicas anteriores identificaram mutações em 100% dos alelos da forma clássica, enquanto que a forma não clássica, em nossa amostra, permanece ainda com fre- 461

6 qüência alta (23%) de alelos sem mutações identificadas (29). Nenhum paciente portador de forma não clássica e com valor da 17OHP pós-acth <17ng/mL teve seu genótipo definido. Em outros estudos populacionais, onde significante número de pacientes com a forma não clássica foi estudado, esta forma clínica também apresenta porcentagem alta de alelos sem mutações identificadas. Estes dados sugerem que o atual critério diagnóstico desta forma clínica, 17OHP >10ng/mL, possa estar superestimando o seu diagnóstico (30). Para investigar esta possibilidade, foi realizado o estudo de 59 heterozigotos obrigatórios quanto à presença de manifestações hiperandrogênicas, valores da 17OHP pós-acth e pesquisa de mutações no gene CYP21. Manifestações hiperandrogênicas foram encontradas em 10% dos heterozigotos, em freqüência semelhante à da população normal. Identificamos dois indivíduos sem manifestações hiperandrogênicas e com valores da 17OHP pós-acth de 11 e de 15ng/mL, os quais são valores diagnósticos da forma não clássica da 21OH. Para afastar a possibilidade de serem afetados pela forma não clássica assintomática, foi realizado o seqüenciamento do gene CYP21 destes indivíduos, e confirmou-se a presença de apenas uma mutação em heterozigose, Q318X e G424S, respectivamente. Observa-se que existe uma superposição dos valores da 17OHP pós- ACTH entre os indivíduos heterozigotos para mutações com severo comprometimento da atividade enzimática e os portadores da forma não clássica (31). Assim, como heterozigose para a 21OH não causa manifestações hiperandrogênicas, sugerimos que estes pacientes não devem ser tratados com glicocorticóide. O estudo molecular do gene CYP21 está indicado para se diferenciar heterozigose de forma não clássica da 21OH nos indivíduos com manifestações hiperandrogênicas e com valores da 17OHP pós-acth entre 10 e 17ng/mL. Correlação do Genótipo com Fenótipo Os estudos de mutagênese in vitro permitiram quantificar a redução da atividade enzimática conferida por cada mutação (19,32) e sua correlação com as diferentes formas clínicas da doença. Speiser e cols. (20) dividiram as mutações em três grupos de acordo com a gravidade do comprometimento da atividade enzimática e correlacionaram com as diferentes formas clínicas. O grupo A (severo comprometimento) incluiu mutações com atividade enzimática ausente ou mínima. O grupo B (moderado comprometimento) incluiu a mutação I172N que confere entre 3 a 7% de atividade enzimática. O grupo C (leve comprometimento) incluiu as mutações P30L e V281L, as quais conferem atividade enzimática > 18%. A HAC-21OH é uma doença com herança autossômica recessiva causada por várias mutações que estão presentes com freqüência alta na população. Por este motivo, os indivíduos afetados apresentam geralmente mutações diferentes em cada um dos alelos (heterozigotos compostos) e uma minoria são homozigotos para uma mutação. A forma clínica no heterozigoto composto é conferida pelo alelo com maior atividade enzimática. Assim, indivíduos com o genótipo severo/severo apresentam, principalmente, a forma perdedora de sal, com os genótipos severo/moderado e moderado/moderado apresentam, principalmente, a forma virilizante simples e os com os genótipos severo/leve, moderado/leve e leve/leve apresentam, principalmente, a forma não clássica. Existe boa correlação do genótipo com o fenótipo. Em amostra de 93 pacientes com deficiência da 21-hidroxilase foi observado 62% de correlação do genótipo severo/severo com a forma perdedora de sal. Isto porque 60% dos pacientes deste grupo possuíam a mutação I2 splice em pelo menos um alelo. Estudos in vitro da mutação do I2 splice demonstram splicing alternativos resultando em níveis variados de 21-hidroxilase normal, o que explicaria sua associação também com a forma virilizante simples (19). Houve 96% de correlação dos genótipos severo/moderado e moderado/moderado com a forma virilizante simples e 88% de correlação dos genótipos severo/leve, moderado/leve e leve/leve com a forma não clássica. Estas correlações também ocorreram de forma estatisticamente significativa com os valores hormonais basais da 17OH-progesterona e da testosterona, os quais se traduziram no grau de virilização da genitália externa (25). Estudos de correlação do genótipo com o fenótipo (20,21,33) verificaram que nem sempre ocorre a associação esperada. Os fatores que podem ser responsáveis por esta disparidade são a presença de mutações raras no mesmo alelo, bem como atividade de 21- hidroxilação extra-adrenal mediada por outras enzimas além da P450c21. Outros fatores que podem ser responsáveis por esta ausência de correlação e que devem ser estudados são anormalidades em regiões promotoras e regulatórias do gene CYP21, atividade de fatores de transcrição e de proteínas transportadoras. A deficiência da 21-hidroxilase é uma doença que apresenta um complexo mecanismo molecular, por apresentar um gene ativo e um pseudogene altamente homólogos, localizados em uma região de genes duplicados que favorece eventos mutagênicos. 462

7 Entretanto, apresenta bem elucidado seu mecanismo fisiológico e os conhecimentos de biologia molecular num futuro próximo poderão ser direcionados para a terapia gênica. Já foi realizado estudo com terapia gênica em camundongos com completa ausência da atividade da 21-hidroxilase e esta possibilitou restauração da capacidade de secreção de cortisol durante 40 dias (34). Mas, até o momento, na prática clínica são consolidadas as seguintes aplicações do estudo molecular do gene CYP21: 1) aconselhamento genético; 2) diagnóstico pré-natal das gestações de risco para a forma clássica; 3) na diferenciação entre heterozigose de forma não clássica da 21-hidroxilase; 4) em parceiro de paciente com as diferentes formas clínicas para se determinar a probabilidade de terem filhos afetados com a forma clássica. Diagnóstico Prenatal A principal complicação da HAC-21OH é a virilização intra-útero da genitália externa de fetos femininos afetados. O diagnóstico pré-natal vem sendo utilizado há duas décadas em gestações de risco, isto é, de mães que já possuem uma criança com a forma clássica da deficiência da 21-hidroxilase, com o objetivo de instituir a terapêutica a fim de suprimir a adrenal fetal e evitar a virilização da genitália externa em fetos femininos afetados. Inicialmente o diagnóstico pré-natal foi realizado através de determinações da 17OH-progesterona ou da tipagem do HLA a partir da 15ª semana de gestação (35,36). Entretanto estas metodologias ocasionalmente forneciam resultados falso negativos, nas formas clínicas de menor gravidade quando se utilizava a dosagem hormonal (37) ou mesmo na tipagem do HLA por eventos de recombinação intra- HLA. O inconveniente destes testes que utilizam a amniocentese é que são realizados tardiamente, somente a partir da 15ª semana de gestação, quando já pode ter ocorrido a virilização da genitália externa. O aprimoramento das técnicas de identificação das mutações responsáveis pela deficiência da 21- hidroxilase associado à metodologia de biópsia de vilo coriônico permitiu sua aplicação clínica em testes de diagnóstico pré-natal, melhorando a sensibilidade e precocidade diagnóstica. A extração de DNA obtido de tecido de vilo coriônico possibilitou o diagnóstico genético a partir da 10ª semana de gestação, tornando possível a intervenção terapêutica. Como a diferenciação da genitália pode iniciar-se antes da 10ª semana de gestação, o tratamento deve ser iniciado assim que se confirmar a gestação (4ª a 5ª semana). O protocolo de tratamento pré-natal seguido mundialmente consiste em orientar as mães de risco para procurar o médico com uma a duas semanas de atraso menstrual. Após a confirmação da gestação, pelo βhcg positivo, deve ser iniciada a terapia com dexametasona, na dose de 20µg/Kg/dia, dividida em três vezes. A partir da 10ª a 12ª semana de gestação realizase a biópsia de vilo coriônico para análise da determinação do sexo e estudo dos genes CYP21. Em caso de sexo masculino não há risco de problemas na genitália e a terapia deve ser suspensa. Em caso de sexo feminino prossegue-se o tratamento e o estudo para determinação no feto das mutações presentes no caso índex. Se o feto apresentar mutações em ambos alelos deve-se continuar a terapêutica até o nascimento, caso contrário o tratamento é interrompido. Durante a gestação a supressão adrenal fetal deve ser avaliada periodicamente com dosagens de estriol urinário. Em caso de feto masculino sugere-se também a investigação das mutações, o que possibilitaria o início da terapêutica de reposição, nos casos afetados, logo após o nascimento, podendo-se evitar a crise de perda de sal. A figura 4 apresenta o diagrama da conduta diagnóstica e terapêutica em gestações de risco para a HAC -21OH. A vantagem do diagnóstico através do estudo de vilosidade coriônica é a sua precocidade, o que permite interromper precocemente a exposição da mãe à dexametasona em caso do feto não afetado. Speiser e cols. (38), estudando 24 gestações de risco com técnicas gene-específicas como Southern blotting, PCR e hibridação alelo-específico para as 9 mutações de ponto mais freqüentes, demonstraram serem estes métodos bastante eficientes, pois foram detectadas mutações em 95% dos cromossomos estudados com uma eficácia de 96% confirmada em exame pós-natal. Erro com o diagnóstico molecular ocorreu em 5%. Este erro Figura 4. Diagrama da conduta diagnóstica e terapêutica em gestações de risco para a HAC -21OH. 463

8 pode ser decorrente de cross-contaminação das amostras se não for realizado rigoroso controle na execução da reação. Também pode ocorrer falha de amplificação de um alelo (allelic dropout) normal ou mutante durante a PCR. Para minimizar este problema, o estudo de microssatélites altamente polimórficos que flanqueiam o gene da 21-hidroxilase tem sido utilizado no diagnóstico pré-natal em adjunto ao estudo molecular do gene CYP21 (39). Aproximadamente 70% das meninas tratadas pré-natalmente nascem com genitália externa normal ou ligeiramente virilizada, não necessitando de cirurgia plástica. São descritas falhas da terapia, através de meninas que nasceram mais virilizadas necessitando de correção cirúrgica. As causas que poderiam contribuir para a falha da terapêutica pré-natal são: 1) início tardio da terapia; 2) dose inadequada de dexametasona; 3) interrupção da terapia no meio da gestação; 4) não aderência; 5) passagem transplacentária do glicocorticóide, que pode ser influenciada pela sua afinidade pela transcortina; e 6) a função esteroidogênica adrenal fetal pode não ser regulada somente pelo ACTH em fases precoces da gestação. Não é referida na literatura a presença de complicações fetais decorrentes do tratamento com dexametasona. A incidência de abortos espontâneos foi igual à da população geral. Da mesma forma não foram encontradas alterações nos parâmetros antropométricos (altura, peso e perímetro cefálico ao nascimento); porém a maioria destas crianças ainda não alcançou a estatura final ou a idade puberal para conclusões finais serem estabelecidas. É observada uma freqüência maior de abortos após a biópsia de vilo corial, para evitar isto a biópsia deve ser realizada apenas por profissionais com experiência, entre a 10ª e 12ª semana de gestação (22). Com relação às mães, em geral a terapia é bem tolerada sendo citadas complicações em 4 a 9% dos casos. Ocorrem queixas de ganho excessivo de peso apesar do uso de dieta hipocalórica e hipossódica. Também são referidas estrias violáceas, crescimento de pêlos em rosto, hiperglicemia, hipertensão e fácies cushingóide. A maioria dos efeitos colaterais desaparecem com a interrupção da terapia. O tratamento pré-natal deve ser considerado apenas para as mães sadias e estas devem ser cuidadosamente monitoradas quanto ao ganho de peso, pressão arterial e à tolerância à glicose (40). No serviço de Endocrinologia da FMUSP foram acompanhadas 22 gestações de risco para a deficiência da 21-hidroxilase, sendo que dentre elas ocorreu um aborto no primeiro trimestre não relacionado à biópsia de vilo, 21 gestações chegaram a termo. No momento do diagnóstico da gestação as mães iniciaram a terapêutica com dexametasona 20µg/kg/dia. Duas delas apresentaram excessivo ganho de peso nos primeiros 3 meses da gestação. Foi predito que em 11 gestações o feto era do sexo feminino, dentre elas três afetadas pela forma clássica e foi mantida a terapia prénatal com dexametasona. Em todas o diagnóstico foi confirmado após o nascimento e as meninas nasceram com genitália externa normal, mostrando a eficácia do tratamento (41). Em 10 gestações foi predito que o feto era do sexo masculino, sendo um afetado pela forma perdedora de sal. A terapia pré-natal com dexametasona foi descontinuada e logo após o nascimento o diagnóstico foi confirmado, possibilitando a instituição da terapia com glico e mineralocorticóide antes da crise de perda de sal. A terapêutica pré-natal ainda é controversa. Por ser uma metodologia recente ainda não existem dados com relação à puberdade, estatura final e perfil psicológico das crianças submetidas ao tratamento. Somente um entre 8 fetos será uma menina afetada pela deficiência da 21-hidroxilase, sendo assim, sete gestações serão submetidas desnecessariamente ao tratamento com dexametasona, antes que seja determinado o sexo e o genótipo. Por outro lado, a terapia é importante porque permite a ocorrência de uma genitália externa normal evitando ou diminuindo o trauma cirúrgico, evitando erros de atribuição do sexo ao nascimento e ainda por evitar a ação excessiva de andrógenos no cérebro feminino fetal, que poderia ser responsável por um dimorfismo sexual cerebral fetal. Dados da literatura referem que meninas com deficiência da 21-hidroxilase se casam menos, têm menos filhos, têm menor interesse sexual e maior incidência de lesbianismo. Estas complicações podem ser resultado do imprinting de andrógenos no cérebro pré e/ou pós-natal, como também do trauma cirúrgico da genitoplastia. O consenso adotado hoje em dia é que os benefícios da terapia pré-natal suplantam os riscos. Até que estas crianças submetidas ao tratamento com dexametasona pré-natal, afetadas ou não, atinjam a idade adulta e possam ser tomadas conclusões definitivas, este tratamento deve ser empregado apenas em hospitais-escola. As mães devem ser informadas sobre os potenciais riscos da terapia e também quanto à possibilidade da falta de benefícios. Hiperplasia Congênita de Adrenal por Deficiência de 11β-Hidroxilase A deficiência da 11β-hidroxilase (11β-OH) foi primeiramente relatada por Eberlein e Bongiovani em Na maioria dos países corresponde a no máximo 464

9 5% dos casos de hiperplasia congênita da adrenal, com freqüência em torno de 1: nascimentos (42). No entanto, em populações com alto grau de endogamia uma freqüência maior é registrada: 1: em Israel, 1: em judeus provenientes do Marrocos (43) e pode chegar a mais de 25% dos casos de HCA na Arábia Saudita (44). Na deficiência de 11β-OH, além dos sinais de hiperandrogenismo, um sinal clínico importante é a hipertensão arterial com alcalose hipercalêmica devida ao excesso de produção de deoxicorticosterona (DOC), o que a distingue da deficiência da 21-OH. Entretanto a hipertensão arterial pode ou não estar presente e é observada em 30-60% dos casos (42,43). A hipertensão, muitas vezes, só se manifesta nas fases mais tardias da infância ou adolescência e é atribuída ao excesso de DOC. A perda de sal na deficiência de 11β- OH pode ocorrer na infância, quando os níveis de DOC ainda são relativamente baixos e há maior vulnerabilidade à perda de sal. A perda de sal também pode ocorrer após o tratamento com glicocorticóides, que suprimem a DOC. O diagnóstico da forma clássica da deficiência da 11β-OH é feito pela constatação de níveis basais elevados de três hormônios principais: 11- deoxicortisol sérico, DOC e da substância S-tetrahidro-urinária (THS). Em alguns casos ocorre a deficiência da 11β-OH denominada não clássica ou parcial. Esta é uma etiologia relativamente incomum. Entretanto, a sutileza com que esta variante se manifesta e as dificuldades associadas com o seu diagnóstico podem retardar sua identificação e resultar em uma redução significante na estatura adulta se não tratada precocemente com reposição hormonal. O diagnóstico da forma não clássica da deficiência da 11β-OH é baseado em elevação do 11-desoxicortisol em pelo menos 3 vezes os valores máximos obtidos pelo percentil 95% da população após estímulo com ACTH exógeno. Genética Molecular A enzima 11β-OH é uma das enzimas da família do citocromo P-450 chamada CYP11. Em humanos há 2 isoenzimas, uma responsável pela síntese de cortisol e outra pela aldosterona. A CYP11B1 catalisa a conversão de 11-desoxicortisol a cortisol na camada fasciculada, demonstrada em estudos de cultura de células e por hibridização in situ (45), a CYP11B2, por sua vez, age na conversão de desoxicorticosterona (DOC) a corticosterona, 18-hidroxicorticosterona e aldosterona na camada glomerulosa (46-49). Mutações no gene CYP11B1, que codifica a enzima 11β-hidroxilase (11β-OH), causam HCA, ao passo que as mutações no gene CYP11B2, que codifica a enzima CYP11B2, são as causas da deficiência de corticosterona metil oxidase ou deficiência da aldosterona sintase. Por outro lado, a síndrome conhecida como hiperaldosteronismo supressível por glicocorticóides é resultado de uma recombinação intergênica, justapondo-se o promotor do CYP11B1 com seqüências codificadoras do CYP11B2 formando um gene híbrido (50,51). Neste processo o gameta resultante apresenta o gene híbrido CYP11B1/CYP11B2 intercalado aos genes CYP11B2 e CYP11B1. Nesses casos uma questão que se levanta é porquê um alelo que possui três cópias gênicas, duas delas com estrutura molecular inalterada, estaria produzindo um fenótipo alterado devido a uma cópia gênica quimérica. O gameta com deleção no locus de CYP11B, gerado como produto recíproco no processo de cruzamento desigual, produzindo o híbrido CYP11B2/CYP11B1 deve produzir a deficiência de 11β-OH (52,53). Apenas recentemente foram descritos dois pacientes com deficiência de 11β-OH apresentando deleções com a formação de genes quiméricos deste tipo (54,55). Mutações deletérias no gene CYP11B1, entretanto, são encontradas nas análises de DNA de pacientes com deficiência de 11β-OH e são correlacionadas com alterações em resíduos importantes para a atividade enzimática ou com interrupções da transcrição normal do gene gerando mrna alterados e, conseqüentemente, proteínas truncadas (52,56-62). Algumas mutações são recorrentes, principalmente, em certos grupos étnicos com alto grau de endogamia (judeus iranianos e marroquinos), o que sugere um forte efeito fundador na origem e irradiação dos alelos mutantes (63). No Brasil a mutação Q356X foi a primeira a ser descrita em um paciente da raça negra (64). Posteriormente, a mesma mutação foi encontrada em outros cinco pacientes brasileiros negros não relacionados indicando um possível efeito fundador nesse grupo étnico na população brasileira (65). A mutação Q356X havia sido anteriormente descrita em pacientes americanos de origem africana (52,66). A tabela 4 resume as principais mutações descritas e suas prováveis ações na transcrição e ação catalítica da enzima. Curiosamente, 15/36 das mutações deletérias para a hidroxilação em c11 da 11β-OH estão situadas entre os exons 6-8 (52), formando um cluster de mutações no gene CYP11B1. Duas possibilidades têm sido levantadas para explicar essa concentração: mutações nessas regiões aconteceriam com a mesma freqüência que no resto dos exons, porém teriam maior probabilidade de serem deletérias na atividade enzimática, ou a região do cluster representaria uma 465

10 Tabela 4. Mutações mais freqüentes no gene CYP11B1, localização e atividade enzimática. Mutação Tipo de Mutação Efeito na Proteína Referência Q19X exon 1 nonsense: gcaa Taa proteína truncada não funcional exon 1 frameshift: deleção 1 bp- proteína anômala não funcional 52 P42S exon 1 missense: gccc Tcc redução atividade enzimática (37%) exon 2 frameshift: deleção 28bp proteína anômala não funcional W116X exon 2 nonsense: tgg tag proteína truncada não funcional 58 i121 exon 2 frameshift: inserção 5bp- proteína anômala não funcional 59 V129M exon2 missense: Gtg Atg atividade enzimática nula 61 N133H exon3 missense: Aat Cat redução atividade enzimática (15%) 72 K174X exon3 nonsense: Aag Tag proteína truncada não funcional 52 W247X exon 4 nonsense: tgg tag proteína truncada não funcional 61 G267R exon 4 missense: cggc Cgc alteração do sítio de splicing 70 G267S exon 4 missense: cggc Agc alteração do sítio de splicing 69 G267D exon 5 missense: ggc gac alteração do sítio de splicing 70 T318M exon 5 missense: acg atg altera sítio de transferência de T318R exon 5 missense: acg agg próton nas hidroxilações em c11 52 T318T exon 5 missense: acg acc66 68 T319M exon 6 missense: acg atg redução atividade enzimática (17%) 72 A331V exon 6 missense: gct gtt atividade enzimática nula 61 Q338X exon6 nonsense: Cag Tag proteína truncada não funcional 52 Q356X exon 6 nonsense: Cag Tag proteína truncada não funcional 52,66,64 E371G exon 6 missense: gag ggg altera interação com a proteína 61 oxi-redutora adrenodoxina R374Q exon 6 missense: cgg cag altera sítio de ligação à adrenotoxina 52 (proteína oxi-redutora de P450c11) R384Q exon 7 missense: cga caa altera sítio de ligação ao substrato 52 (11-desoxicortisol) R384G exon 7 missense: Cga Gga altera sítio de ligação ao substrato 60 (11-desoxicortisol) i394 exon 7 frameshift: inserção 2b proteína anômala não funcional 57 i404 exon 8 frameshift: inserção 1 bp proteína truncada não funcional 71 Y423X exon 8 nonsense: tata tag proteína truncada não funcional 72 R427H exon 8 missense: cgc cac altera ligação ao grupo heme 70 V441G exon 8 missense: gtg ggg altera estrutura secundária da região 52 de ligação ao grupo heme R448H exon 8 missense: cgc cac altera sítio de ligação ao ferro do 56 grupo não protéico heme. R448C exon 8 missence: Cgc Tgc atividade enzimática nula 61 i464 exon 8 inserção ctg inframe proteína anômala não funcional 61 C494F exon 9 missense: tgc ttc envolvida com a transferência 70 de elétrons para o grupo heme área hot-spot no gene de CYP11B1, estando por alguma razão mais susceptível a mutações. Na verdade, quatro das oito mutações pontuais mais freqüentes (T318M, R374Q, R384Q e R448H) são transições CpG TpG, sendo este o grupo de transições mais comuns nos eventos de mutações pontuais do genoma humano (67). Sugestivamente, 49% (23/49) dos dinucleotídios CpG das regiões codificadoras de CYP11B1 estão dentro da região que engloba os exon 6 ao 8. Se comparado ao genoma, em geral, que apresenta 1,5% de CpG (67), a região do cluster de mutações de CYP11B1 apresenta uma porcentagem duas vezes maior (~3%) dessa composição nucleotídica, sugerindo que a alta taxa mutacional nessa região possa ser devida a uma área hot-spot (52). No entanto, o fato da região entre os exons 6 8 codificar domínios importantes para a ação enzimática, como o de ligação ao substrato à adrenodoxina, entre os codons , e o de ligação ao grupo heme, entre os codons , reforça a primeira hipótese. Outra característica interessante que se observa nesse quadro de mutações é a ocorrência de várias mutações em um mesmo codon. Os codons 384 e 448, por exemplo, apresentam duas mutações diferentes, respectivamente. Outros dois codons que parecem ser alvos de múltiplas mutações são os codons 267 e 318 que, coincidentemente, fazem parte da seqüência consenso doadora de splicing, dos exons 4 e 5, respectivamente. Portanto, a expressão biológica de mutações nestes codons se deve mais a um processo de splicing anômalo do que a uma alteração na atividade enzimática causada por uma troca de aminoácido. Esta afirmação encontra respaldo em um trabalho publicado recentemente, no qual foi demonstrado que uma 466

11 mutação conservativa no codon 318 (T(ACG) a T(ACC)) provocou a eliminação dos exons 3-7 no mrna isolado da glândula adrenal da paciente (68). Num estudo realizado no Brasil foi identificada uma terceira mutação no codon 267, que troca uma glicina por serina (69). O códon 267 é formado pelo último nucleotídeo do éxon 4 e pelos dois primeiros nucleotídeos do éxon 5. Portanto, duas mutações, G267S e G267R, resultam, respectivamente, da troca de G A e G C no último nucleotídeo do éxon 4. Por outro lado, a mutação G267D ocorre no primeiro nucleotídeo do éxon 5. Desta forma, além de provocarem a troca do aminoácido, ocorrem na seqüência consenso do sítio doador e aceptor de splice do íntron 4 e podem afetar o processo para a formação do RNAm (70). Uma nova mutação foi encontrada em uma paciente de origem árabe no Brasil. Trata-se da inserção de uma citosina no éxon 8; isto faz com que o quadro de leitura para a síntese protéica sofra um deslocamento, a arginina do códon 404 é substituída por uma prolina e na posição 421 aparece um códon de terminação (71). Considera-se que a proteína produzida a partir do gene mutado seja anômala e tenha, portanto, sua atividade enzimática comprometida. Hiperplasia Adrenal Congênita por Deficiência de 17-Hidroxilase/17,20 liase A deficiência de 17-hidroxilase (D17OH) foi descrita pela primeira vez em 1966 (73). A paciente com 27 anos, cariótipo 46XX, apresentava ausência de desenvolvimento puberal e hipertensão arterial, com níveis diminuídos de cortisol, aldosterona e potássio. Considerada uma doença muito rara, a D17OH é comumente reportada na literatura através de casos isolados. Sua incidência estimada é de 1: (74), provavelmente, 1% de todos os casos de hiperplasia adrenal congênita (HAC). O bloqueio enzimático da 17- hidroxilase impede a produção de cortisol pela zona fasciculada adrenal e o conseqüente aumento do ACTH estimula a hipersecreção dos precursores imediatos ao bloqueio enzimático, como progesterona, desoxicorticosterona (DOC) e corticosterona (B) e, também, de esteróides com secreção geralmente limitada como 18OH-B, 18OH-DOC e 19-nor-DOC) (75). A ação mineralocorticóide exercida pela DOC é responsável pelos achados clínicos de hipertensão e hipocalemia, na presença de supressão do sistema renina-angiotensina-aldosterona. A deficiência dos esteróides gonadais, por sua vez, determina a ausência de desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários no paciente 46XX ou presença de pseudohemafroditismo masculino. Alguns aspectos relacionados à fisiopatologia da HAC por D17OH ainda não estão totalmente elucidados, como: 1) níveis elevados de aldosterona em alguns pacientes japoneses (76); 2) os possíveis casos de deficiência parcial da enzima, com genitália ambígua, menarca, níveis pressóricos ou de potássio dentro da normalidade; 3) definição clínica e laboratorial da deficiência isolada de 17,20 liase (77); e 4) a associação de achados fortuitos como restos de tecido adrenal em testículo (78), mielolipoma (79), adenoma adrenal (80), gônadas disgenéticas e desenvolvimento incompleto de ductos müllerianos (81). Genética Molecular Vinte anos após a descrição do primeiro paciente com D17OH, o gene CYP17, constituído por 13kb, 8 exons e 7 introns, foi mapeado no cromossomo 10q24- q25 (82) e, desde então, o entendimento das bases moleculares desta doença, de herança autossômica recessiva, tem se intensificado. Trinta e nove mutações que afetam o gene estrutural do citocromo P450c17 foram descritas na literatura (tabela 5). A maioria dessas mutações (56%) constitui-se por substituições simples de bases, que promovem a troca de um aminoácido ou introduzem um códon de parada de transcrição do RNAm. Doze deleções que afetam o gene CYP17 (31% das mutações) promovem frameshift, com conseqüente expressão de uma proteína muito truncada. A maior mutação descrita no gene CYP17 é uma extensa deleção que acomete três membros de uma mesma família italiana (83). A deleção de 518 pb associada à inserção de 469 pb de DNA não humano acomete o exon II, todo o intron II e parte do exon III. Dois outros pacientes italianos apresentam homozigose para deleção de 24 pb, excluindo os aminoácidos (84). As demais mutações consistem em pequenas duplicações e ainda, duas mutações do tipo splice, que substituem G T no intron 2 (85) e G A no intron 7 (86), afetando o sítio doador para o splice do RNAm. O gene CYP17 humano é responsável pela codificação de uma única enzima - o citocromo P450c17, que exerce atividades de 17-hidroxilação e 17,20 liase nos tecidos adrenais e gônadas. Os seus fatores de transcrição ainda não foram totalmente elucidados. Baseando-se em estudos com roedores, possíveis sítios de interação com o SF-1 e com alguns receptores nucleares (COUP-TF, NGF-IB e fatores esteroidogênicos 1 e 2) (87), foram identificados na região promotora do gene CYP17. Experimentos com células adrenais Y1 de camundongo (88) demonstraram que as regiões 235/ 184 e -184/ 104 desempenham papel essencial na transcrição primária do gene e na sua expressão induzida por hormônio, respectivamente. Estudos 467

12 Tabela 5. Mutações no gene CYP17. N de pacientes/ Exon/ Função de 17- Nº País de origem Mutações Intron hidroxilação Função de 17,20 Referências Canadá Dup 4 pb (480) VIII NS NS Japão W17X I NS NS Japão Del F (53 ou 54) I < 37% < 8% Japão Dup 7 pb (120) II NS NS Guamanian S106P II Zero Zero Itália Del 518pb + Ins 469 pb II - III Zero? Zero? 83 (7) e (8) 1 - Canadá (7) R239X e (8) P342T IV e VI (7) Zero? e (8) 40-45% (7) Zero? e (8) 40-45% 76 (9) e (10) 1 - Suíça (9) Q461X e (10) R496CVIII e VIII (9) Traços e (10) 10% (9) Traços e (10) 10 % Tailândia Del 9 pb ( ) VIII Zero Zero Japão Del TG (300 e 301) V NS NS 108 (13) e (14) 1 - Caucasiano (13) Y64S e (14) Dup 3pb (112) I e II (13) 15% e (14) Traços? 109 (7) e (15) 1 - Reino Unido (7) R239X e (15) E194X IV e III (15) Zero? (15) Zero? Japão H373L VI Zero Zero Alemanha R440H VIII Zero Zero Caucasiano G90D I NS NS Japão Del G (438) VIII Zero? Zero? Canadá R96W I 4,1% 0,8% Japão G_A (Intron 7) Intron VII Zero? Zero? Brasil R347H VI 65% < 5% Brasil R358Q VI 65% < 5% 101 (24) e (25) 1 - Israel (24) Del T (46) e (25) F417CI e VIII (24) Zero e (25) 26% (24) Zero e (25) 0,70% 114 (2) e (26) 1 - Japão (2) W17X e (26) G_T (Intron2) I e Intron II (26) Zero? (26) Zero? Japão Del C (131) I Zero? Zero? Japão M1I I Zero Zero Turquia R35L I 38% 33% Itália Del 24 bp I < 1% < 1% 84 (31) e (32) 1 - Turquia (31) N177D e (32) R496H III e VIII (31) 10% e (32) 33% (31) 10% e (32) 20% Itália Del 3 pb (330 ou 331) I < 1% < 1% 84 (3) e (34) 1 - Japão (3) Del 3pb (53 ou 54) e (34) Y329X I e VI (3) 10% e (34) < 1% (3) 12% e (34) < 1% 84 (11) e (35) 1 - China (11) Del 9pb ( ) e (35) P409R VIII e VII (35) 2,9% (35) 4,9% 117 (36) e (37) 1 - Japão (36) Del T (243) e (37) R415CIV e VIII (36) Zero e (37) 8% (36) Zero e (37) 10% 118 (16) e (38) 1 - Japão (16) H373L e (38) Del T (247) VI e IV (38) Zero (38) Zero Itália F93CI 10% 10% 120 A numeração das mutações obedece à ordem cronológica de publicação em literatura indexada. NS = Estudo de função enzimática não realizado. Zero? (estudo de função enzimática não realizado, provável ausência de atividade). As mutações numeradas entre parênteses indicam os casos de heterozigose composta. recentes com células humanas adrenais NCI-H295A comprovaram que os elementos Sp1 e Sp3 interagem com a região promotora do gene CYP17, especificamente nos sítios 227/-184, assim como as proteínas NF-1C, atuam em sítios mais proximais ( 178/-152 e 107/-85), ambos exercendo papel essencial na transcrição do gene, na espécie humana (87). Entretanto, até o momento, não há relato de mutação que afete a região promotora do gene CYP17 e apresente, por conseguinte, expressão clínica de D17OH. O citocromo P450c17, codificado pelo gene CYP17, se localiza no retículo endoplasmático liso. O mesmo RNAm de 2.1kb se expressa tanto em adrenais como em gônadas (89) e codifica uma proteína constituída por 508 aminoácidos, peso molecular de 57kd. Os citocromos P-450 necessitam de ancoramento adequado à membrana microssomal, ligação de substrato, oxigênio e grupo heme, assim como transferência de elétrons, para o exercício adequado de suas funções. A ação do citocromo P450c17 é modulada por vários fatores específicos: 1) o tipo de substrato disponível, interfere diretamente na eficiência de catálise da enzima; 2) o tecido alvo e a espécie animal; 3) a disponibilidade do citocromo b5 e adrenodoxina redutase (90); e 4) a transferência de elétrons na presença de fosforilação (84). A 17-hidroxilação de pregnenolona e progesterona é realizada com a mesma eficiência metabólica pelo citocromo P450c17. Entretanto, a quebra do carbono na posição 17,20 é 50 vezes mais eficiente para a formação de DHEA do que androstenediona, e depende diretamente da ação do citocromo b5, como foi demonstrado em estudos realizados em diferentes tipos de células e organismos (91,92). O citocromo b5 atua como um cofator alostérico (91), ao contrário do citocromo adrenodoxina redutase que atua por transferência de elétrons. A presença do citocromo b5 tem a capacidade de aumentar em até 10 vezes a função de 17,20 liase, mas ainda mantêm a preferência para 468