REPRODUTIBILIDADE DOS RESULTADOS DE ANTICORPOS ANTI- HIV EM AMOSTRAS DE SORO ARMAZENADAS POR PERÍODOS DE DOIS A DEZOITO ANOS.
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- Sônia Palma Martins
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1 REPRODUTIBILIDADE DOS RESULTADOS DE ANTICORPOS ANTI- HIV EM AMOSTRAS DE SORO ARMAZENADAS POR PERÍODOS DE DOIS A DEZOITO ANOS. Castejon MJ, Yamashiro R, Oliveira CC, Oliveira CAF, Ueda M Instituto Adolfo Lutz São o Paulo
2 Os anticorpos possuem um papel fundamental no sorodiagnóstico, e constituem os mais difundidos biomarcadores empregados na detecção e confirmação de diversas doenças. O estudo retrospectivo foi proposto para verificar a reprodutibilidade dos resultados de anticorpos anti-hiv para avaliar a estabilidade dos soros armazenados a -20ºC durante período de dois a dezoito anos. Casuística stica e Métodos: M Os 845 soros utilizados foram provenientes de amostras remanescentes da rotina diagnóstica para detecção de anticorpos anti-hiv, referentes ao período de 1988 a 2004, os quais estavam armazenados em freezer a -20ºC. Em 2006, a estabilidade das amostras de soro foi avaliada por meio de ELISA/EIA (Vironostika HIV Uni-Form Plus O - Biomérieux ou Murex HIV O - Abbott), IFI (BioManguinhos Fiocruz), e Western blot (HIV blot Genelabs Diagnostics) para detecção de anticorpos anti-hiv. Na análise da estabilidade dos soros por meio da reprodutibilidade dos resultados no ELISA/EIA, as amostras foram agrupadas por período de tempo de armazenamento de tal forma, que o nº de amostras em cada bloco fosse maior do que 100. As amostras com resultados reagentes ou indeterminados no ELISA/EIA foram inicialmente avaliadas pela técnica de IFI-HIV-1, e na ocorrência de resultados indeterminados ou negativos foram analisadas por WB. A interpretação dos níveis de concordância, conforme os valores Kappa (k), foi feita de acordo com o proposto por Altman (1999), adaptada de Landis e Koch (1977), segundo o qual, o valor k < 0,20 representa reprodutibilidade pobre, de 0,21 a 0,40 regular, 0,41 a 0,60 moderada, 0,61 a 0,80 boa, e de 0,81 a 1,00 concordância muito boa.
3 Resultados: Na avaliação efetuada em 2006, das 845 amostras que foram submetidas ao ELISA/EIA, 385 (45,6%) apresentaram resultados não reagentes, 425 (50,3%) reagentes e 35 (4,1%) indeterminados. Os 460 (54,4%) soros com resultados reagentes (425) e indeterminados (35) no ELISA/EIA seguiram para a etapa confirmatória, realizada pelo ensaio de IFI. Porém, somente em 326 (70,9%) amostras analisadas pode-se avaliar a reprodutibilidade por apresentarem resultados anteriores nesta metodologia, tendo os seguintes resultados: 28 (8,6%) negativos, 225 (69%) positivos e 73 (22,4%) indeterminados. Seguindo-se os critérios descritos na metodologia deste estudo, os 28 soros com resultados negativo (n = 28) e indeterminado (n = 73) no ensaio de IFI seriam analisados no WB. Contudo, dos 101 soros, 49 (48,5%) não foram investigados quanto à reprodutibilidade por não terem sido analisados anteriormente pela técnica de WB. Os dados referentes à reprodutibilidade das amostras em cada metodologia são mostrados na Tabela 1. 1 Caso sejam utilizados critérios de avaliação mais rígidos para o ELISA/EIA (períodos em que o valor do índice k 0,8), assegurando o mais alto nível de estabilidade dos soros, o tempo ideal de armazenamento foi de 12 anos (a partir de 1994), com média de concordância observada de aproximadamente 93%. Para IFI, por meio da própria característica técnica de visualização da reação foi detectada contaminação fúngica em alguns soros analisados. Esta ocorrência, além de prejudicar o desempenho do teste, é indicativa de monitoramento inadequado destas amostras. Desta forma, os resultados foram mais reprodutíveis (k = 0,65) em amostras coletadas a partir de 2003, sendo, portanto, a estabilidade mantida por 4 anos. Na análise dos resultados obtidos nas 52 amostras de soro pela metodologia de WB (1988 a 2004) a reprodutibilidade foi considerada boa (k = 0,63). Quando subdivididos em 2 períodos a 1997 e 1998 a 2004 houve uma queda significativa deste índice (k = 0,52), e a reprodutibilidade foi classificada como moderada. Em função disto, não foi possível
4 estabelecer o tempo exato de armazenamento em que as amostras de soro apresentaram bom nível de estabilidade Na Tabela 2 estão apresentados os números de amostras com os resultados originais e os detectados em Tabela 1. Avaliação da reprodutibilidade dos resultados das amostras de soro agrupadas em diferentes períodos de tempo nas metodologias ELISA/EIA, IFI e WB Período (Ano) N de amostras (n) Índice Kappa (k) IC (95%) de k Valor-p Grau de concordância N de resultados concordantes Concordância observada p (%) IC (95%) de p ELISA/EIA ,71 [0,59; 0,83] 0,000 Boa ,46 [80,19; 89,78] ,61 [0,44; 0,78] 0,000 Boa 83 82,18 [73,30; 89,08] ,87 [0,72; 1,02] 0,000 Muito boa ,38 [87,81; 96,93] ,94 [0,78; 1,10] 0,000 Muito boa ,41 [92,63; 99,46] ,80 [0,67; 0,93] 0,000 Boa ,19 [85,67; 95,10] ,80 [0,65; 0,95] 0,000 Boa 94 88,68 [81,06; 94,01] ,80 [0,74; 0,86] 0,000 Boa ,47 [87,20; 91,46] IFI ,1 [0,02; 018] 0,012 Pobre 76 71,7 [62,12; 80,02] ,24 [0,12; 0,36] 0,000 Regular 77 74,76 [65,24; 82,80] ,53 [0,37; 0,69] 0,000 M oderada 62 78,48 [67,80; 86,94] ,65 [0,42; 088] 0,000 Boa 32 84,21 [68,75; 93,98] ,35 [0,27; 0,43] 0,000 Regular ,77 [70,74; 80,32] WB ,52 [0,18; 0,86] 0,001 M oderada 20 76,92 [56,35; 91,03] ,52 [0,17; 0,87] 0,002 M oderada 22 84,62 [65,13; 95,64] ,63 [0,38; 0,88] 0,000 Boa 42 80,77 [67,47; 90,37] IC: intervalo de confiança
5 Tabela 2. Número de amostras com resultados reagente/positivo, não reagente/negativo e indeterminado detectados anteriormente e aqueles obtidos em 2006, conforme a metodologia utilizada. Resultado (categórico) ELISA/EIA* Número de amostras (n) IFI WB Anterior 2006 Anterior 2006 Anterior 2006 Não Reagente*/ Negativo Reagente*/Positivo Indeterminado Total *ELISA/EIA: resultado reagente e não reagente Conclusão: o: No que diz respeito à sorologia para HIV, as amostras de soro foram estáveis por 18 anos no ELISA/EIA e por 4 anos na técnica de IFI, no entanto, para a metodologia de Western blot não foi possível determinar o tempo de estabilidade dos anticorpos anti-hiv. A combinação do conhecimento sobre a estabilidade do componente e a escolha da metodologia de ensaio são essenciais para compreender as limitações que possam ocorrer, quando na utilização dessas amostras em estudos futuros.
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