Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 20

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1 Abril 2010 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 20 Versão 1 Para a detecção de 18 genotipos de alto risco do vírus do papiloma humano (HPV) por hibridação inversa QIAGEN GmbH, QIAGEN Straße 1 D-40724, Hilden R PT Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Tecnologia de tratamento de amostras e ensaios de biologia molecular QIAGEN é o fornecedor líder de tecnologias inovadoras para o tratamento de amostras e ensaios de biologia molecular, permitindo o isolamento e detecção de qualquer conteúdo biológico. Os nossos avanços, com produtos e serviços de alta qualidade garantem o sucesso desde a amostra ao resultado. QIAGEN aposta nos seguintes procedimentos: Purificação do DNA, RNA e proteínas Ensaios com ácidos nucleicos e proteínas Investigação com microrna e RNAi Automatização de tecnologias de tratamento de amostras e ensaios de biologia molecular A nossa missão é ajudá-lo a cumprir os seus objectivos com sucesso Para mais informações, visite

3 Conteúdo Composição do kit 4 Símbolos 5 Armazenamento 6 Fim a que se destina 6 Limitações da utilização do produto 6 Controlo de qualidade 6 Assistência técnica 6 Informação de segurança 7 Introdução 9 Principio 9 Características de desempenho 12 Equipamentos e reagentes fornecidos pelo utilizador 20 Notas importantes 21 Preparação de reagentes para o procedimento manual 21 Preparação dos reagentes para o procedimento automatizado 23 Protocolos 1: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento manual Hibridização 25 2: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento manual Lavagem rigorosa 28 3: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento manual Desenvolvimento da cor 30 4: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento automatizado 32 Guia de resolução de problemas 37 Apêndice A: Interpretação de resultados 42 Apêndice B: Controlo de contaminação das PCRs 44 Bibliografia 45 Informação para encomendas 49 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010 3

4 Composição do kit Teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção (20) Referencia no Numero de reacções 20 Tiras de HPV de alto risco 20 DS Solução de desnaturação 250 μl HS Solução de hibridação 85 ml SW Solução de lavagem rigorosa 2 x 105 ml C Conjugado 100x 550 μl CD Diluente do conjugado 55 ml S Substrato 100x 550 μl SB Tampão do substrato 110 ml RS Solução de lavagem 5x 75 ml 3B Tampão 3B 220 μl Dispositivo para incubação 3 Folhas de registo de dados 2 Manual do utilizador 1 4 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

5 Símbolos <N> Conteúdo suficiente para <N> testes Dispositivo médico para diagnostico in vitro Conformidade Europeia Referência Fabricante Código do lote Número de material Nota importante Limitações de temperatura Prazo de validade Consultar manual do utilizador Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010 5

6 Armazenamento O teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção deve ser armazenado imediatamente após recepção a 20ºC. Assegure-se que armazena o kit longe de qualquer fonte de DNA contaminante, especialmente produtos de DNA amplificado. Todos os reagentes são estáveis até ao fim do prazo de validade sobre estas condições. As tiras de HPV de alto risco são estáveis até ao fim do prazo de validade quando armazenadas entre 2 8 C. Fim a que se destina O teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção é uma ensaio de hibridação inversa in vitro que utiliza amplimeros GP5+/6+ para a identificação qualitativa individual dos tipos de HPV de alto risco seguintes: 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, e 82. A utilização deste teste está indicada como teste reflexo para mulheres que obtiveram um resultado positivo com o teste digene HC2 High-Risk HPV DNA. Limitações da utilização do produto Este teste foi validado para o uso de amostras colhidas em STM Specimen Transport Media (STM) e solução de PreservCyt. Análises efectuadas a partir de outros meios de colheita podem conduzir a resultados falsos positivos ou falsos negativos. Este produto deve ser utilizado por pessoal com formação em tecnologia de PCR. Devem cumprir-se as recomendações do layout do laboratório e dos procedimentos de modo a evitar resultados falsos e contaminações de DNA. As incubações da hibridação e da lavagem rigorosa do procedimento manual do teste devem realizar-se a uma temperatura exacta de 50ºC para evitar resultados falsos positivos ou falsos negativos. A temperatura do banho-maria deve ser verificada com um termómetro calibrado. Controlo de qualidade Em cumprimentos com o Sistema de Gestão e Garantia de Qualidade com Certificação ISO, cada lote do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção é testado de acordo com as especificações pré definidas para garantir a uniformidade da qualidade dos produtos. Assistência técnica Na QIAGEN, nós orgulhamo-nos da qualidade e disponibilidade do nosso suporte técnico. O nosso Departamento do Serviço Técnico é composto por cientistas muito experientes com extensa experiência teórica e pratica em 6 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

7 Tecnologia de tratamento de amostras e ensaios de biologia molecular com os produtos da QIAGEN. Se tiver alguma questão ou dificuldade com o teste relacionada com o teste digene HPV Genotyping RH, kit detecção ou qualquer outro produto da QIAGEN em geral, por favor não hesite em contactar-nos. Os clientes da QIAGEN são a maior fonte de informação relativamente à utilização avançada e especializada dos nossos produtos. Esta informação é muito útil para outros cientistas bem como para os investigadores da QIAGEN. Nós gostaríamos de ser contactados se tiver alguma sugestão em relação à performance do produto, novas aplicações ou técnicas. Para assistência técnica e mais informações por favor consulte o nosso Centro de Suporte Técnico em ou telefone para um dos nossos departamentos de Serviço técnico ou entre em contacto com o distribuidor local. Informação de segurança Sempre que trabalhe com produtos químicos, utilize bata de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de protecção. Para mais informações, consulte as fichas de segurança dos materiais correspondentes (material safety data sheets (MSDSs). Estes estão disponíveis online em formato PDF em onde pode encontrar, ver e imprimir a ficha de segurança de cada kit e componentes. As seguintes frases sobre riscos e segurança aplicam-se aos componentes do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção. Solução de desnaturação (DS) Contém hidróxido de sódio: irritante. Frases de risco e de segurança:* R36/38, S26-36/37/ Conjugado, 100x (C) * R36/38: Irritante para os olhos e pele; R43: pode causar sensibilização em contacto com a pele; S24: Evitar o contacto com a pele; S26: Em caso de contacto com os olhos, lavar imediatamente e com muita agua siga os conselhos do seu médico; S36/37/39: Usar roupa de protecção adequada,luvas e protecção para os olhos e cara; S45: Em caso de acidente ou se não se sentir bem, procure um medico imediatamente (mostrar o rotulo se possivel). Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010 7

8 Contém ProClin 300 (5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one, 2-methyl-4- isothiazolin-3-one): irritante. Frases de risco e de segurança:* R43, S24-36/37/ Informação para emergências disponível 24 Pode obter informação de emergência médica em inglês, francês e alemão 24 horas por dia em: Centro de Informação Toxicológica de Mainz, Alemanha Tel: * R43: pode causar sensibilização em contacto com a pele; S24: Evitar o contacto com a pele; S36/37/39: Usar roupa de protecção adequada,luvas e protecção para os olhos e cara; S45: Em caso de acidente ou se não se sentir bem, procure um medico imediatamente (mostrar o rotulo se possivel). 8 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

9 Introdução O teste digene HPV Genotyping RH consiste em 2 kits: o teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação e o teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção. O teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção permite realizar uma identificação fiável dos genotipos de lato risco do vírus do papiloma humano (HPV) por hibridação inversa. Os produtos de PCR no procedimento de hibridação inversa são obtidos a partir do DNA Template por amplificação da sequencia L1 usando o teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação. Principio A identificação dos genotipos do HPV baseia-se num procedimento de hibridação inversa. Os amplicons biotinilados desnaturados, que são resultado da amplificação de parte da região L1 com o conjunto de primers GP5+/6+, são hibridizados com sondas oligonucleotidicas específicas, que se imobilizam em forma de bandas paralelas em tiras de membrana (Figura 1). Após a hibridação e a lavagem rigorosa, adiciona-se fosfatase alcalina conjugada com estreptavidina, que liga a um qualquer híbrido biotinilado que está presente. A incubação com o cromogénio BCIP/NBT dá origem a um precipitado arroxeado que permite realizar uma interpretação visual dos resultados. Como o controlo interno para a presença de DNA amplificável após o isolamento, um fragmento do gene da betaglobina humana coamplifica-se com o DNA do HPV em forma de PCR multiplex. A última banda da sonda da tira contém uma sonda capaz de detectar o amplimero da betaglobina linha marcadora Banda de controlo do conjugado HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV Banda de controlo da β-globin Figura 1. Esquema da tira da genotipagem. Uma linha marcadora situada na parte superior da tira é colocada para orientação. Duas bandas de controlo (Banda de controlo do conjugado, Banda de controlo da β-globin) estão incluídas. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010 9

10 Figura 2. Fluxo de trabalho do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção, procedimento manual Hibridação em banho-maria com agitação a 50 C, tampa fechada Solução de desnaturação (DS) 10 μl adicionar a cada cuvete de ensaio Tampão 3B (3B) 10 μl adicionar à solução de desnaturação (DS) Produto amplificado 10 μl adicionar à solução de desnaturação (DS) Incubação à temperatura ambiente; 5 minutos Solução de hibridação (HS) * 2 ml adicionar à amostra desnaturada e agitar suavemente Tira de HPV 1 tira adicionar a cada cuvete de ensaio *(preaquecida) Incubação a 50 C; 60 minutos Lavagem rigorosa em banho-maria com agitação a 50 C, tampa fechada Sol. lavagem rigorosa (SW) * 2x2 ml lavar as tiras 2 vezes durante 10 a 20 segundos Sol. lavagem rigorosa (SW) * 2 ml adicionar a cada cuvete de ensaio *(preaquecida) Incubação a 50 C; 30 minutos Preparar uma solução de lavagem e uma solução de conjugado Desenvolvimento de cor no agitador, à temperatura ambiente Solução de lavagem 1x 2x2 ml lavar as tiras 2 vezes durante 1 minuto (Sol. lavagem concentrada (RS), diluída na proporção de 1/5 em água) Solução de conjugado 2 ml Adicionar a cada cuvete de ensaio (Conjugado concentrado, diluído na proporção de 1/100 em diluente do conjugado [CD]) Incubação à temperatura ambiente; 30 minutos Preparar a solução do substrato (continua na próxima página) 10 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

11 Figura 2. Fluxo de trabalho do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção, procedimento manual (continuação da página anterior) Desenvolvimento de cor no agitador, à temperatura ambiente Solução de lavagem 1x 2x2 ml Lavar as tiras 2 vezes durante 1 minuto (Sol. Lavagem concentrada (RS), diluída na proporção de 1/5 em água) Tampão de substrato (SB) 2 ml lavar as tiras 1 vezes durante 1 minuto Solução de substrato 2 ml adicionar a cada cuvete de ensaio (substrato concentrado, diluído na proporção de 1/100 em tampão de substrato [SB]) Incubação à temperatura ambiente; 30 minutos Agua destilada 2x2 ml adicionar às cuvetes do tabuleiro de incubação Incubação à temperatura ambiente; 3 minutos Interpretação e armazenamento das tiras Esta informação do procedimento do teste pode ser utilizado como guia. Não deve ser utilizado como substituição do protocolo detalhado descrito neste manual. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

12 Características de desempenho Sensibilidade analítica Foram efectuadas várias determinações formais do limite de detecção (LOD) para os genotipos do HPV 16, HPV 18, e HPV 45. O limite de detecção pode ser analisado na tabela 1. Tabela 1. Sensibilidade analítica: limite de detecção (LOD) para os genotipos HPV 16, 18, e 45 Genotipo Concentração LOD (copias/pcr) HPV16 4 HPV18 8 HPV45 23 Para os restantes 15 genotipos, analisaram-se os passos de diluição e determinou-se a concentração com a qual se obtinha 100% de resultados positivos. Os resultados podem ser analisados na Tabela 2. Tabela 2. Sensibilidade: Concentração Limite de detecção (LOD) em função do genotipo Genotipo Concentração LOD (copias/pcr) HPV HPV31 10 HPV33 10 HPV35 10 Tabela continua na próxima página. 12 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

13 Tabela 2. Continuação Genotipo Concentração LOD (copias/pcr) HPV HPV HPV HPV HPV56 10 HPV HPV HPV HPV68a HPV HPV HPV82MM HPV82IS Especificidade analítica pratica Os amplimeros dos 18 genotipos do HPV e dos 2 subtipos objecto do ensaio (i.e., HPV 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68 (68a), 73, 82MM4 (82IS39)) mostraram um padrão correcto na tira, confirmando assim a identificação do tipo de HPV correcto. Para demonstrar se houve alguma reacção cruzada foram utilizados quantidades elevadas de amplimeros (obtidos de HPV copias por PCR dos HPV (sub) tipos 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 61, Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

14 66, 67, 68 e 68a), 69, 71, 72, 73, 81, 82 (MM4 e IS39)). Nenhuma das sondas mostrou qualquer reacção com amplimeros do tipo de HPV objecto do ensaio. A especificidade do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção é garantida pela selecção das sondas, assim como pela selecção de condições rigorosas das reacções. As sondas foram analisadas para detectar possíveis homologias relativamente a todas as sequências publicadas em bancos de genes mediante análises de comparação de sequências. Foi garantida a detectabilidade de todas as cadeias relevantes. Ainda foram analisados os microrganismos presentes habitualmente na zona ano genital da mulher. Nenhum dos patogénicos testados foi reactivo (ver Tabela 3). A presença destes microrganismos não reduz a sensibilidade na detecção dos genotipos de alto risco do HPV. Tabela 3. Microrganismos patogénicos que podem potenciar reacções cruzadas Microrganismos patogénicos Acinetobacter anitratus Acinetobacter lwoffi Bacteroides fragilis Escherichia coli (HB101) Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Lactobacillus acidophilus Mobiluncus curtisii Mobiluncus mulieris 14 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

15 Precisão Inicialmente, um painel de 10 amostras diferentes, contendo plasmideos de todos os 20 genotipos e subtipos do HPV coberto por este ensaio, foi testado com uma concentração 10 vezes superior ao limite de detecção previsto, em triplicado, em 3 dias diferentes e por 2 operadores e uma vez com outros 2 números de lotes do kit, para um total de 24 pontos de dados por amostras. Todos os resultados de genotipagem foram idênticos. De seguida, o DNA purificado de um total de 92 amostras foi testado por 2 operadores usando 3 lotes do kit. Os resultados foram classificados como idênticos (100% coincidência de genotipos), compatíveis (pelo menos um genotipo em comum) ou discordantes (sem coincidência de genotipos). Entre os dois operadores a percentagem de concordância nos resultados idênticos/compatíveis foi de 98% e 100%. Ao comparar os diferentes lotes de kits que usaram os dois operadores (i.e., comparando todos os 6 resultados), a percentagem de concordância de resultados idênticos/compatíveis foi de 93%. Finalmente, a selecção das 25 amostras do painel mencionado anteriormente foi testada em duplicado por dois operadores (analise entre operadores) num segundo centro de análises. Os resultados foram outra vez classificados em idênticos (100% coincidência de genotipos), compatíveis (pelo menos um genotipo em comum) ou discordantes (sem coincidência de genotipos) O operador 1 mostrou 100% de concordância nos resultados idênticos nas análises em duplicado nas 25 amostras. O operador 2 alcançou 93% de concordância nos resultados idênticos (23/25 amostras) nas amostras em duplicado, com 2 amostras com resultados de genotipagem compatíveis. Entre os dois operadores a percentagem de resultados idênticos foi de 88% e a percentagem de resultados compatíveis foi de 12%. Não foram observados resultados discordantes. Quando comparados os 10 resultados de cada uma das 25 amostras no painel inter-laboratorial (1º e 2º centro), a percentagem de concordância em resultados idênticos/compatíveis foi de 100% com 72% de resultados idênticos e 28% de resultados compatíveis. Não se observaram resultados discordantes. Em resumo, de forma a analisar o grau de concordância entre os resultados, uma série de amostras artificiais contendo todos os tipos de HPV cobertos por este ensaio e 92 amostras clínicas foram testadas mediante amostragem múltipla. Cada amostra foi ensaiada em réplicas em diferentes dias e diferentes operadores. Também foram testados lotes diferentes. Os resultados mostraram 100% de genotipos idênticos nas amostras artificiais e mais de 95% de resultados idêntico se compatíveis para as amostras clínicas. Exactidão Analisaram-se aliquotas de DNA purificado de um total de 108 amostras consistentes em 50 amostras HC2-positivas colhidas em STM, 50 amostras Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

16 HC2-positivas colhidas em PC e 8 amostras HC2-negativas colhidas em STM utilizando o teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção e o Sistema Free University RLB (1). Os resultados foram classificados como idênticos (100% coincidência de genotipos), compatíveis (pelo menos um genotipo em comum) ou discordantes (sem coincidência de genotipos). As discrepâncias (resultados de genotipagem discordantes) foram resolvidas repetindo ambos os ensaios e em caso da persistência da discrepância, mediante outra analise com um terceiro ensaio sensível de genotipagem e detecção do HPV [SPF10-LiPA 25 (versão1)]. A comparação mostrou 80% de resultados de genotipagem idênticos, 11% de resultados compatíveis e 9% de resultados de genotipagem discordantes. Repetindo ambos os ensaios resolveram-se 5 das 10 amostras discrepantes. A análise com SPF10-LiPA 25 (versão 1) resolveu outras 3 amostras discrepantes deixando apenas 2 amostras discrepantes. Na primeira destas amostras discrepantes, foi identificado um HPV45 pelo teste da digene HPV Genotyping RH, kit de detecção onde a linha de transferência inversa (reverse line blot (RLB)) foi negativa. Na segunda amostra foi identificado um HPV58 com o sistema de RLB e o resultado do teste da digene HPV Genotyping RH, kit de detecção foi negativo. Em resumo, para analisar o grau de concordância comparou-se o teste to digene HPV Genotyping RH, kit de detecção com o teste HPV RLB, que oferece um valor de referencia aceitável. Paralelamente foram testadas 108 amostras clínicas e os resultados foram classificados em idênticos, compatíveis ou discordantes. As amostras discordantes foram resolvidas através da análise com SPF10-LiPA 25 (versão 1). Os resultados mostraram um nível muito baixo de amostras discrepantes (2%) após resolução das amostras discrepantes iniciais. Ver Tabela 4. Tabela 4. Comparação do teste de genotipagem do HPV com o ensaio HPV RLB Analise de Exactidão % Amostras clínicas Idênticas 80 Compatíveis 18 Discrepantes 2 Solidez A capacidade do teste para se manter sem ser afectado por variações deliberadas em parâmetros metodológicos relevantes foi avalisada da seguinte forma. Amplificaram-se amostras em duplicado dos genotipos do HPV 16, 18, 16 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

17 45, e 52 com concentração 10 vezes superior ao limite de detecção da PCR com condições de PCR acima 1,0ºC ou 1,0ºC abaixo. A detecção do HPV através da utilização do kit RH não sofreu qualquer influencia quando comparada com as condições normais dos ciclos. Analisaram-se amplimeros com uma concentração próxima ao limite de detecção do teste RH a temperaturas de hibridação mais altas para investigar a possibilidade de perca dos sinais. A análise a uma temperatura máxima especificada de 50,5ºC não influenciou o resultado e a analise a 51,0ºC (que excede as especificações do teste) provocou o aparecimento de umas bandas de sondas reactivas ligeiramente mais ténues mas sem perca de sinal. Analisaram-se concentrações elevadas de amplimeros a temperaturas de hibridação mais baixas para investigar possíveis reacções cruzadas. A análise realizou-se a 49,5ºC (que é o limite mínimo de temperatura indicado para a hibridação), e a 49,0ºC (que está abaixo da especificação); não se observaram reacções cruzadas. A redução de todos os tempos de incubação do procedimento do RHA em 5 minutos gerou umas bandas de sondas reactivas ligeiramente mais ténues mas sem perda de sinal enquanto que o prolongamento de todos os tempos de incubação em 5 minutos não teve qualquer efeito visível. Substâncias interferentes Analisou-se o efeito do sangue e de outros possíveis interferentes com o teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção. A presença das substâncias (descritas na Tabela 5) não causou resultados falsos-positivos. Além disso, a presença de substâncias não provocou diminuição da sensibilidade dos vírus HPV. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

18 Tabela 5. Substâncias interferentes Substancias Sangue Creme hidratante Anestésico hemorroidal Pó de talco Creme antifungico Lubrificante vaginal Análise diagnostica O Teste digene HPV Genotyping RH foi comparado com o do sistema Free University RLB (1) num multicentro de estudo. Desta forma, 267 amostras cervicais positivas com o teste da digene HC2 High Risk HPV DNA foram seleccionadas. As amostras foram colhidas em meios de STM e PreservCyt. O DNA destas amostras foi isolado tanto manualmente com o kit QIAamp MinElute Virus Spin como automaticamente no EZ1 Advanced com o kit EZ1 DSP Virus. Das 267 amostras, 254 das HC2 positivas foram também positivas para um dos 18 tipos de alto risco do HPV pelo teste digene HPV Genotyping RH. Os testes da genotipagem foram comparados e os resultados classificados como idênticos (100% coincidência de genotipos), compatíveis (pelo menos um genotipo em comum) ou discordantes (sem coincidência de genotipos). A percentagem de concordância de resultados idênticos/compatíveis entre os testes de genotipagem foi de 95,5 % (255 das 267 amostras) com 82,0 % dos resultados idênticos e 13,5 % compatíveis (ver Tabela 6). 4,5 % (12 das 267 amostras) dos resultados da genotipagem foram discordantes. 18 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

19 Tabela 6. Comparação dos resultados de genotipagem obtidos com o teste digene HPV Genotyping RH e o sistema Free University RLB em 267 exsudados cervicais positivos por HC2. Concordância N=267 (%) Resultados idênticos 219 (82,0) Resultados compatíveis 36 (13,5) Resultados discordantes 12 (4,5) Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

20 Equipamentos e reagentes fornecidos pelo utilizador Sempre que trabalhe com produtos químicos, utilize bata de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de protecção. Para mais informações, consulte as fichas de segurança dos materiais correspondentes (material safety data sheets (MSDSs), disponíveis pelo fornecedor do produto. Para todos os protocolos Agua destilada e desionizada Pipetas* e pontas descartáveis com filtros (1 20 μl, μl, e μl) Pinças para manipulação das tiras Provetas graduadas (10 ml, 25 ml, 50 ml, e 100 ml) Protocolo Manual Banho-maria* com tampa inclinada e plataforma de agitação (80 rpm); capaz de atingir 50 ± 0,5 C Dispositivo de aspiração Termómetro calibrado* Agitador orbital ou plataforma de balanço Temporizador de laboratório, 2 horas (±1 minute) Opcional: Multidispensador (por exemplo, Finnpipette Stepper da Thermo Electron, ver Protocolo Automatizado Analisador ProfiBlot 48 T (Tecan Trading, AG; ver Tubos cónicos de 50 ml * Assegure-se que os equipamentos foram verificados e calibrado de acordo as recomendações do fabricante. Esta não é uma lista completa de fornecedores e não inclui vários fornecedores importantes de produtos biológicos 20 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

21 Notas importantes Preparação de reagentes para o procedimento manual Solução de lavagem 1x Preparar uma diluição 1/5 da solução de lavagem 5x (RS) adicionando uma parte de solução de lavagem 5x (RS) em 4 partes de água destilada ou desionizada. Preparar 8 ml de solução de lavagem diluída (1x) para cada cuvete de reacção mais 10 ml adicionais (ver Tabela 7). Tabela 7. Preparação da solução de lavagem 1x (para o processo manual) No. de tiras Volume da solução de lavagem 5x (RS) (ml) Volume de água (ml) Volume total (ml) Tampão de substrato (SB) Use 2 ml de tampão de substrato (SB) para cada tira mais um extra de 5 ml para cada corrida. Para reduzir o excesso de tampão de substrato necessário (SB) para cada corrida utilize um tubo cónico de 50 ml e coloque dentro de um contentor do analisador ProfiBlot 48 T. Solução de conjugado e de substrato Para obter as soluções de trabalho de conjugado e substrato, dilua o conjugado 100x (C) ou o substrato 100x (S) em proporção de 1/100 em Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

22 diluente de conjugado (CD) ou tampão de substrato (SB), respectivamente. Prepare 2 ml de solução de conjugado ou solução de substrato para cada teste mais 2 ml extras (ver tabelas 8 e 9). Utilize exclusivamente recipientes limpos que tenham sido passados por agua destilada para a preparação destas soluções. Tabela 8. Preparação da solução de conjugado (para o procedimento manual) Numero de tiras Volume do diluente do conjugado (CD) (ml) Volume de conjugado 100x (C) (μl) Tabela 9. Preparação da solução de substrato (para o procedimento manual) No. de tiras Volume tampão de susbtrato (SB) (ml) Volume de substrato 100x (S) (μl) Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

23 Preparação dos reagentes para o procedimento automatizado Solução de lavagem 1x Prepare uma diluição de 1/5 da solução de lavagem 5x (RS) adicionando uma parte da solução de lavagem (RS) a 4 partes de água destilada ou desionizada. Prepare 10 ml de solução de lavagem diluída (1x) para cada tira mais 55 ml extra (ver Tabela 10, abaixo). Tabela 10. Preparação da solução de lavagem 1x (para procedimento automatizado) No. de tiras Volume de solução de lavagem 5x (RS) (ml) Volume de água (ml) Volume total (ml) Tampão de substrato (SB) Use 2 ml de tampão de substrato (SB) para cada tira mais um extra de 5 ml para cada corrida. Para reduzir o excesso de tampão de substrato necessário (SB) para cada corrida utilize um tubo cónico de 50 ml e coloque dentro de um contentor do analisador ProfiBlot 48 T. Solução de conjugado e de substrato Para obter as soluções de trabalho de conjugado e substrato, dilua o conjugado 100x (C) ou o substrato 100x (S) em proporção de 1/100 em diluente de conjugado (CD) ou tampão de substrato (SB), respectivamente. Prepare 2 ml de solução de conjugado ou solução de substrato para cada teste mais 5 ml extras (ver tabelas 11 e 12). Para reduzir o excesso de tampão de substrato necessário (SB) para cada corrida utilize um tubo cónico de 50 ml e Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

24 coloque dentro de um contentor do analisador ProfiBlot 48 T.Utilize exclusivamente recipientes limpos que tenham sido passados por agua destilada para a preparação destas soluções. Tabela 11. Preparação da solução de conjugado (para procedimento automatizado) No. de tiras Volume de diluente do conjugado (CD) (ml) Volume do conjugado 100x (C) (μl) Tabela 12. Preparação da solução de substrato (para procedimento automatizado) No. de tiras Volume de tampão de substrato (SB) (ml) Volume de substrato 100x (S) (μl) Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

25 Protocolo 1: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento manual Hibridização Notas importantes antes de começar Não use reagentes que já tenham ultrapassado o seu prazo de validade. Não misture reagentes de lotes diferentes. O frasco contendo a solução de desnaturação (DS) deve ser fechado imediatamente após a sua utilização; a exposição prolongada ao ar provoca a sua rápida deterioração. Antes de os usar, coloque todos os reagentes e os tubos de plástico que contém as tiras de teste a uma temperatura entre os 2 e os 8 C. Durante os vários passos da incubação, as tiras de teste devem ficar na mesma cuvete. Procedimentos a adoptar antes de começar Coloque todos os reagentes e os tubos de plástico que contém as tiras de teste à temperatura ambiente (15 25 C). Aqueça em banho-maria a solução de hibridização (HS) e a solução de lavagem rigorosa (SW) a, pelo menos, 37 C. Certifique-se que não ultrapassa a temperatura de 50 C da hibridização. Todos os cristais devem estar dissolvidos antes de serem usados. Prepare um banho-maria a 50 C, com tampa inclinada e plataforma de agitação. Certifique-se que a temperatura da água é de 50 ± 0,5 C. Controle a temperatura usando para o efeito um termómetro calibrado. Durante a incubação, defina a velocidade de agitação do banho no máximo possível de forma a evitar o derrame de líquidos. Ajuste o nível de água do banho-maria de forma a que este esteja entre um terço e metade da altura do teste. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

26 Processo Figura 3. Instruções de Pipetagem. 1: Na cuvete junte 10 μl da solução de desnaturação (DS) +10 μl de tampão 3B (3B); 2: Misture por pipetagem e junte 10 μl de DNA amplificado; 3: Junte a solução de hibridização (HS); 4: Coloque a tira na cuvete. 1. Dispense 10 μl de solução de desnaturação (DS) no canto superior no número necessário de cuvetes de teste (uma cuvete por tira) (ver Figura 3, 1). 2. Feche o frasco de solução de desnaturação (DS) imediatamente após o uso. 3. Junte 10 μl de tampão 3B (3B) à solução de desnaturação (DS) (ver Figura 3, 1). 4. Junte 10 μl de produto amplificado biotinilado à cuvete com a solução de desnaturação (DS) e o tampão 3B (3B). 5. Misture cuidadosamente, pipetando algumas vezes (ver Figura 3, 2). Tome cuidado para não contaminar as cuvetes contíguas durante a pipetagem. Use pontas e filtros novos para cada amostra. 6. Incube à temperatura ambiente (15 25 C) por 5 min. 7. Com as pinças, retire o número necessário de tiras de teste do tubo (uma tira por amostra). Com um lápis, escreva o número de identificação da colheita acima da linha de marcação da tira. Não use qualquer outro meio de escrita, para além do lápis. Manuseie as tiras apenas acima da linha de marcação e com pinças. Utilize luvas. Manuseie sempre as tiras em cima de papel. 8. Agite a solução de hibridização (HS) pré-aquecida. 9. Cuidadosamente junte 2 ml a solução de hibridização ao produto amplificado desnaturado em cada cuvete (ver Figura 3, 3). Misture, agitando cuidadosamente. Tome cuidado para não contaminar as cuvetes contíguas durante a pipetagem. 26 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

27 10. Coloque imediatamente a tira na cuvete (ver Figura 3, 4). A tira deve estar completamente submergida na solução. Use luvas descartáveis sem pó e pinças. 11. Coloque o tabuleiro no banho-maria com agitação, feche a tampa e faça a incubação a 50 C por 60 min. Não tape o tabuleiro. A existência de condensação pode resultar em contaminação entre as cuvetes. Não utilize um agitador de ar quente para a incubação. Transferências de calor podem provocar resultados aberrantes. A meio da incubação, certifique-se que a temperatura da água é de 50 ± 0,5 C. Controle a temperatura usando para o efeito um termómetro calibrado. 12. Continue para o Protocolo 2: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento manual Lavagem rigorosa. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

28 Protocolo 2: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento manual Lavagem rigorosa Notas importantes antes de começar Se completou Protocolo 1: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimiento manual Hibridização, execute este protocolo de seguida. Se está a executar este protocolo, de seguida terá de executar Protocolo 3: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimiento manual Desenvolvimento da cor. Processo 1. Após a hibridização, retire o tabuleiro do banho-maria. 2. Segure o tabuleiro num ângulo que lhe permita aspirar o líquido da cuvete com uma pipeta, preferencialmente acoplada a um aspirador de vácuo. Tenha cuidado para, ao aspirar, não danificar a superfície da tira abaixo da linha de marcação. 3. Junte 2 ml de solução de lavagem rigorosa (SW) pré-aquecida a cada cuvete, e lave agitando o tabuleiro à temperatura ambiente (15 25 C) por s. Assegure-se de que toda a tira é bem lavada pela completa imersão na solução. 4. Aspire a solução de cada cuvete. 5. Repita a sequência de lavagem, seguindo as instruções dos passos 3 e 4 desta secção. Não deixe que as tiras sequem entre as duas sequências de lavagem. Siga para o passo 6 depois de repetir os passos 3 e Aspire a solução. 7. Junte 2 ml de solução de lavagem rigorosa (SW) pré-aquecida a cada tira. 8. Incube a 50 C no banho-maria com agitador por 30 min. Certifique-se que a tampa do banho-maria permanece fechada durante a incubação. Não tape o tabuleiro. A existência de condensação pode resultar em contaminação entre as cuvetes. Não utilize um agitador de ar quente para a incubação. Transferências de calor podem provocar resultados aberrantes. 28 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

29 9. No curso da incubação prevista no passo 4 do Protocolo 1: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento manual Hibridização, prepare a solução de lavagem e a solução de conjugado de acordo com as instruções em Preparação de reagentes para o procedimento manual, na página No final da incubação, aspire a solução de lavagem rigorosa (SW). 11. Continue para Protocolo 3: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento manual Desenvolvimento da cor. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

30 Protocolo 3: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento manual Desenvolvimento da cor Notas importantes antes de começar Se completou Protocolo 2: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimiento manual Lavagem rigorosa, execute este protocolo de seguida. Neste protocolo, todas as incubações são efectuadas à temperatura ambiente (15 25 C). Processo 1. Junte 2 ml da solução de lavagem 1x a cada cuvete e incube numa plataforma balançante por 1 min. 2. Aspire a solução. 3. Junte 2 ml da solução de lavagem 1x a cada cuvete e incube numa plataforma balançante por 1 min. 4. Aspire a solução. 5. Junte 2 ml de solução de conjugado a cada cuvete incube numa plataforma balançante por 30 min. 6. Durante a incubação, prepare a solução de substrato (ver página 21) Proteja a solução de substrato da luz. 7. No fim da incubação, aspire a solução. 8. Junte 2 ml da solução de lavagem 1x a cada cuvete e incube numa plataforma balançante por 1 min. 9. Aspire a solução. Repita o passo 8 uma vez mais, no total de duas lavagens com 2 ml da solução de lavagem 1x. 10. Junte 2 ml de tampão de substrato (SB) a cada cuvete e incube numa plataforma balançante por 1 min. 11. Aspire a solução. 12. Junte 2 ml de solução substrato a cada cuvete, cubra as cuvetes com uma folha de alumínio e incube numa plataforma balançante por 30 min. 13. No fim da incubação, aspire a solução. 14. Para parar o desenvolvimento de cor, junte 2 ml de água destilada a cada cuvete e incube numa plataforma balançante por 3 min. 15. Aspire a solução. 30 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

31 16. Junte 2 ml de água destilada a cada cuvete e incube numa plataforma balançante por, pelo menos, 3 min. 17. Com as pinças remova as tiras das cuvetes e coloque-as em papel absorvente. 18. Deixe que as tiras sequem completamente. Alinhe a linha de controlo do conjugado à linha correspondente da folha de resultados e cole a tira à folha. Não faça qualquer interpretação visual sem que as tiras estejam completamente secas. 19. Armazene à temperatura ambiente em local escuro. 20. Não é necessário executar Protocolo 4: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento automatizado. Continue directamente para o Guia de resolução de problemas deste manual. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

32 Protocolo 4: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento automatizado Notas importantes antes de começar Se vai executar o protocolo automatizado, não necessita passar pelos protocolos manuais de 1 3. Não use reagentes que já tenham ultrapassado o seu prazo de validade. Não misture reagentes de lotes diferentes. Procedimentos a adoptar antes de começar Coloque todos os reagentes à temperatura ambiente (15 25 C). Aqueça em banho-maria a solução de hibridização (HS) a, pelo menos, 37 C. Certifique-se que a temperatura não ultrapassa os 50 C da hibridização. Todos os cristais devem estar dissolvidos antes de serem usados. Use 2 ml de solução de hibridização (HS) mais um extra de 15 ml para cada corrida. Aqueça em banho-maria a solução de lavagem rigorosa (SW) a, pelo menos, 37 C. Certifique-se que não ultrapassa a temperatura de 50 C da hibridização. Todos os cristais devem estar dissolvidos antes de serem usados. Use 6 ml de solução de lavagem rigorosa (SW) mais um extra de 30 ml para cada corrida. Prepare 10 ml de solução de lavagem 1x para cada tira e 55 ml adicionais (para mais informações ver Tabela 9, página 22). Prepare 2 ml de solução de conjugado e de solução de substrato para cada tira e ainda 5 ml adicionais (para mais informações ver Tabelas 10 e 11, páginas 23 e 24, respectivamente). Use apenas recipientes limpos e lavados com água destilada para a preparação das soluções de conjugado e substrato. Siga as instruções seguintes (Tabela 13, página seguinte) para ligar a tubagem dos canais do ProfiBlot aos tampões. 32 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

33 Tabela 13. Colocação dos tampões no ProfiBlot 48T Canal Solução 1 Solução de hibridização 2 Solução de lavagem rigorosa 3 Solução de lavagem 4 Diluente do conjugado 5 Tampão do substrato 6 Tampão do substrato Processo 1. Programe o ProfiBlot 48 T calibrado utilizando os parâmetros definidos na Tabela 14, nas duas próximas páginas. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

34 Tabela 14. A programação do ProfiBlot 48 T 1 INC 5 min Parâmetros Velocidade de agitação: 3 2 TEMP 49 C 3 DISP Canal μl Start Pos. 1 No. of Strips End 4 INC 60 min Velocidade de agitação: 3 5 WASH Canal μl Start Pos. 1 No. of Strips End 6 INC 3 min Velocidade de agitação: 3 7 WASH Canal μl Start Pos. 1 No. of Strips End 8 INC 3 min Velocidade de agitação: 3 9 WASH Canal μl Start Pos. 1 No. of Strips End 10 INC 30 min Velocidade de agitação: 3 11 WASH Canal μl Start Pos. 1 No. of Strips End 12 COOL 13 WASH Canal μl Start Pos. 1 No. of Strips End 14 WASH Canal μl Start Pos. 1 No. of Strips End 15 INC 30 min Velocidade de agitação: 3 16 WASH Canal μl Start Pos. 1 No. of Strips End 17 INC 3 min Velocidade de agitação: 3 18 WASH Canal μl Start Pos. 1 No. of Strips End Continua na próxima página. A temperatura de incubação é de 49 C. No processo manual, a hbridização é executada a 50 C para obter resultados semelhantes. 34 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

35 Tabela 14. Continuação 19 INC 3 min Parâmetros Velocidade de agitação: 3 20 WASH Canal μl Start Pos. 1 No. of Strips End 21 INC 3 min Velocidade de agitação: 3 22 WASH Canal μl 23 INC 30 min Velocidade de agitação: 3 24 WASH Canal μl Start Pos. 1 Start Pos No. of Strips End No. of Strips End 25 INC 3 min Velocidade de agitação: 3 26 WASH Canal μl Start Pos. 1 No. of Strips End 27 INC 10 min Velocidade de agitação: 3 28 ASP 29 END 2. Ligue o ProfiBlot 48 T e inicie a programação O aparelho iniciará o aquecimento até atingir a temperatura necessária. 3. Prepare os reagentes necessários à execução do teste; ver Preparação dos reagentes para o procedimento automatizado página 23, para mais informações. 4. Coloque os reagentes no ProfiBlot 48 T e insira os tubos nos tampões correctos conforme Tabela 13, página 33. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

36 5. Com as pinças, retire o número necessário de tiras do tubo (uma tira por amostra). Com um lápis, escreva o número de identificação da colheita acima da linha de marcação da tira. Não use qualquer outro meio de escrita, para além do lápis. Manuseie as tiras apenas acima da linha de marcação e com pinças. Utilize luvas. 6. Coloque cada tira no canto superior de cada cuvete. 7. Pipete 10 μl de solução de desnaturação (DS) no canto inferior de cada cuvete contendo uma tira. Feche o frasco imediatamente após o uso. Um multidispensador pode ser usado para distribuir a solução de desnaturação (DS). 8. Junte 10 μl de tampão 3B (3B) à solução de desnaturação (DS). 9. Junte 10 μl de produto amplificado biotinilado à solução de desnaturação (DS) na cuvete. Misture cuidadosamente, pipetando algumas vezes. Tome cuidado para não contaminar as cuvetes contíguos durante a pipetagem. Use pontas e filtros novos para cada amostra. 10. Coloque cuidadosamente o tabuleiro no ProfiBlot 48 T quando o aparelho tiver efectuado o aquecimento e estiver à temperatura correcta. 11. Quando a corrida tiver terminado, lave as tiras com água destilada por 5 min. 12. Com as pinças, remova as tiras das cuvetes e coloque-as em papel absorvente. 13. Deixe que as tiras sequem completamente. 14. Alinhe a linha de controlo do conjugado à linha correspondente da folha de resultados e cole a tira à folha. Não faça qualquer interpretação visual sem que as tiras estejam completamente secas. 15. Armazene à temperatura ambiente e em local escuro. 36 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

37 Guia de resolução de problemas Este guia pode vir a ser-lhe útil na resolução de alguns problemas que possam surgir. Para mais informações, veja também a página de Perguntas Frequentes no nosso Centro de Apoio Técnico: Os técnicos deste serviço da QIAGEN estão sempre ao seu dispor para o esclarecimento das suas questões relativas quer a informações e protocolos constantes deste manual mas também sobre amostras e tecnologias de ensaio (para informação sobre contactos, ver contracapa ou visite Comentários e sugestões Ausência ou sinal fraco em todas as tiras, incluindo a linha de controlo do conjugado a) Procedimento Manual: Quantidade incorrecta de conjugado ou de substrato Repita o protocolo de desenvolvimento de cor, usando as mesmas tiras. Prepare uma nova diluição de solução de lavagem 1x, solução de conjugado, e solução de substrato b) Procedimento Automatizado: Quantidade incorrecta de conjugado ou de substrato Repita o teste com novas tiras e tampões usando o mesmo material amplificado. Falso-negativo ou sinal muito fraco em todas as bandas de controlo, à excepção das bandas de controlo do conjugado a) Quantidade inadequada de material amplificado colocada para hibridização A concentração de material amplificado é demasiado baixa devido a uma amplificação ineficiente. Verifique a quantidade de produto amplificado correndo uma aliquota de 10 μl aliquota em gel de agarose a 2%. O tamanho do produto amplificado de HPV varia entre 139 e 148 bp, dependendo do tipo de HPV. Veja Amplificação ineficiente, página 38, para mais informações. O Amplimero de betaglobina tem um tamanho de 258 bp, mas provavelmente não será visível em gel. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

38 b) Solução de hibridização (HS) ou lavagem rigorosa (SW) não foram correctamente aquecidas ou misturadas c) Procedimento manual: A temperatura excedeu os 50 C durante a hibridização e a lavagem rigorosa Amplificação ineficiente a) DNA usado em quantidade excessiva b) DNA usado em quantidade insuficiente Comentários e sugestões Antes de usar, aqueça a solução de hibridização (HS) e de lavagem rigorosa (SW) a, pelo menos, 37 C em banho-maria. Assegure-se que a temperatura não ultrapassa os 50 C. Todos os cristais devem estar dissolvidos antes de serem usados. Certifique-se que faz o banho-maria à temperatura correcta. Verifique a PCR por electroforese de gel de agarose. Se foi adicionado demasiado DNA, vêse frequentemente um cultura de DNA no gel. Devido à baixa temperatura de anelização da PCR, é normal que se vejam, no gel, algumas bandas de fundo. Dilua o DNA e repita a amplificação juntando 10 vezes menos ADN. Repita a reacção de amplificação e adicione mais DNA. c) Problemas com o ADN Se necessário, repita a purificação de DNA. Repita a reacção de amplificação. d) Termociclador incorrectamente programado Sinais falsos positivos a) Temperatura durante a hibridização e a lavagem rigorosa demasiado baixa Verifique se foi escolhido o programa adequado. Se necessário, calibre o Termociclador. Sinais não especificados podem aparecer se a temperatura para a hibridização e a lavagem rigorosa for demasiado baixa. A temperatura deve ser de 50 ± 0,5 C. Certifique-se que programa o banho-maria correctamente. Feche sempre a tampa do banho-maria durante a incubação. 38 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

39 b) DNA usado em quantidade excessiva Comentários e sugestões Verifique a PCR por electroforese de gel de agarose. Se foi adicionado demasiado DNA, vêse frequentemente uma cultura de DNA no gel. Devido à baixa temperatura de anelização da PCR, é normal que se vejam, no gel, algumas bandas em fundo. Dilua o ADN e repita a amplificação juntando 10 vezes menos DNA. c) Contaminação A existência de um padrão não especificado idêntico na maioria das tiras é indicador da existência de contaminação. A contaminação pode ocorrer durante o manuseamento das amostras clínicas, a purificação do DNA ou durante a PCR. Assim, repita a reacção de amplificação usando soluções acabadas de preparar e/ou repita o processo de purificação do DNA. Se o controlo negativo de DNA é negativo, mas as amostras continuam positivas, o mais provável é que a contaminação tenha ocorrido durante o manuseamento das amostras clínicas. d) Procedimento manual: solução de hibridização (HS) ou lavagem rigorosa (SW) não foram correctamente aquecidas ou misturadas Antes de usar, aqueça a solução de hibridização (HS) e a de lavagem rigorosa (SW) a, pelo menos, 37 C num banho-maria. Assegure-se que a temperatura não ultrapassa os 50 C. Todos os cristais devem estar dissolvidos antes de serem usados. Descoloração ou marcas brancas no centro da tira ou descoloração não uniforme a) Procedimento manual: Conjugado incorrectamente diluído ou excesso de conjugado mal lavado Repita o processo de desenvolvimento de cor usando as mesmas tiras. Aumente a velocidade e certifique-se as tiras estão completamente submergidas no reagente. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

40 Cor de fundo elevada a) Procedimento manual: Conjugado incorrectamente diluído ou excesso de conjugado mal lavado b) Procedimento manual: Tiras incubadas na solução de substrato tempo demais c) Procedimento automatizado: Preparação insuficiente de tampão d) Procedimento automatizado: Tubos que dispersam os tampões não colocados correctamente nos recipientes Comentários e sugestões Repita o teste com novas tiras começando com o passo da desnaturação (passo 7 do Protocolo 4: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento automatizado ou passo 1 do Protocolo 1: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento manual ). Use o mesmo material amplificado. Assegure-se que as tiras se movimentam nas cuvetes durante os passos de lavagem com solução de lavagem 1x no processo de desenvolvimento de cor. Lave as tiras por, pelo menos, 1 min. Repita o teste com novas tiras começando com o passo da desnaturação (passo 7 do Protocolo 4: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento automatizado ou passo 1 do Protocolo 1: Detecção do DNA amplificado do HPV, utilizando o procedimento manual Hibridização). Use o mesmo material amplificado. Assegure-se que as tiras se movimentam nas cuvetes durante os passos de lavagem com solução de lavagem 1x no processo de desenvolvimento de cor. Lave as tiras por, pelo menos, 1 min. Certifique-se que tem preparado tampão suficiente. Veja Preparação dos reagentes para o procedimento automatizado, página 23, para mais informações. Garantir que coloca os tubos correctamente nos recipientes contendo os tampões. 40 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

41 Comentários e sugestões e) Procedimento automatizado: Tiras deixadas demasiado tempo na solução de lavagem 1x As tiras não podem ser deixadas no equipamento mais do que de um dia para o outro. Repita o teste com novas tiras. Use o mesmo material amplificado. Sinais fracos para a sonda da betaglobina A PCR foi criada para a detecção óptima do HPV DNA. É possível que para alguns processos de preparação do DNA ou para alguns tipos de amostra, o sinal da betaglobina seja sempre fraco ou ausente, sem que isso determine a invalidade das amostras. Por favor contacte os serviços de apoio técnico. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

42 Apêndice A: Interpretação de resultados Resultado positivo A presença de uma banda visível é considerada uma reacção positiva. A interpretação do resultado do teste está directamente relacionada com o nome da sonda do tipo de HPV (por exemplo, a cor roxa na banda da sonda do HPV16 indica a presença de HPV tipo 16). Múltiplos tipos de HPV podem estar presentes numa única amostra. Controlo de qualidade A primeira linha positiva é a de controlo do conjugado (imediatamente abaixo da linha de marcador). Esta linha dá o controlo para a adição de conjugado reactivo e solução de substrato durante o processo de detecção. Deve ser sempre positivo e deve ter aproximadamente a mesma intensidade em cada tira do mesmo teste. Se a banda de controlo não é visível, o teste é inválido. A última linha de sonda é usada como controlo interno. Ela reage com o DNA genomico humano co-amplificado presente na amostra clínica. É usada como controlo interno para verificar a existência de inibições da PCR e se a colheita da amostra ou isolamento de DNA forma adequadas. Se o HPV estiver presente na amostra, a banda da betaglobina pode ser negativa devido à competição pela PCR, já que o DNA do HPV é preferencialmente amplificado Tabela 15. Análise de resultados Controlo do conjugado Resultado do HPV Betaglobina Resultado Observações Válido + + Válido O DNA do HPV é preferencialmente amplificado, resultando na ausência de sinal de betaglobin (competição da PCR) + + Válido Tabela continua na página seguinte. 42 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

43 Tabela 15. Continuação Controlo do Conjugado Resultado do HPV betaglobin Resultado Observações +/ +/ Inválido Repita o teste de detecção com o mesmo amplimero + Inválido Ou a purificação do DNA ou a PCR falharam. Repita todo o teste começando com a purificação do DNA, PCR e hibridização inversa usando a amostra original. Se obtiver o mesmo resultado contacte os serviços técnico. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

44 Apêndice B: Controlo de contaminação das PCRs É extremamente importante icluir, pelo menos, um controlo negative que não tenha o ácido nucleico template em todas as preparações de PCR para detectar possíveis contaminações. Para o controlo negative, apenas a banda de controlo do conjugado deve ser positiva. Recomendações de práticas laboratoriais Recomenda-se a seguinte sequência de operações: 1. Preparação e aliquotar as misturas de PCR 2. Preparacão de amostras (isolamento de DNA) 3. Amplificação 4. Análise dos produtos de PCR biotinilados por hibridização inversa O pessal de laboratório envolvido nos passos 3 e 4 não deve participar no mesmo dia no trabalho subsequente dos passos 1 e 2. Da mesma maneira, depois de ter participado no passo 2, o pessoal de laboratório não deve participar no trabalho subsequente para o passo 1, no mesmo dia. A fim de evitar a contaminação (por exemplo, com a produtos amplificados) das amostras e para evitar resultados falsos-positivos, todo o processo deve ser executado em três salas separadas, cada uma com o seu conjunto próprio de material e pipetas. Uma sala é necessária para a preparação de reagents, outra para a preparação de amostras, e a terceira para amplificação e detecção de produtos de PCR. Cada um dos equipamentos deve ser mantido na sala onde é utilizado e não deve ser movimentado entre as três salas. As pontas com filtros devem ser usadas na pipetagem para minimizar o risco de contaminação entre amostras. Por último, devem ser usadas luvas descartáveis e as mesmas devem ser mudadas com frequência. Sala 1: Esta sala deve ser usada apenas para armazenagem e preparação dos reagentes do PCR. Esta sala e os seus equipamentos não devem ser usados para os pordutos amplificados. O pessoal de laboratório deve usar uma bata limpa que não deverá ser usada fora desta sala. Luvas descartáveis devem ser usadas sempre. Sala 2: Esta sala deve sre usada para a preparação de amostras e nela não devem existir quaisquer pordutos amplificados. O pessoal de laboratório deve usar uma bata limpa que não deverá ser usada fora desta sala. Durante a preparação das amostras, devem ser usadas luvas descartáveis. Abra cuidadosamente os vials contendo as amostras processadas para evitar eventuais contaminações. Evite ter aberto em simultâneo mais do que um vial de reacção contendo a amostra. 44 Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

45 Sala 3: Esta sala deverá ser usada para a amplificação e detecção de produtos de PCR. O pessoal de laboratório deve usar uma bata limpa que não deverá ser usada fora desta sala. Quando trabalhar com produtos amplificados, devem sempre ser usadas luvas descartáveis. Os kits digene HC2 High-Risk HPV e o teste digene Genotyping RH, kit de detecção, podem ser executados na mesma sala. Neste caso, execute a preparação das amostras, desnaturação, e transferência para a placa de hibridização do teste HC2 antes de entrar no laboratórtio onde se efectuará as detecções dos testes HC2 e digene Genotyping RH (Sala 3). Isto impede a exposição aos produtos de amplificação usados na Sala 3, da amostra original que deverá ser processada na Sala 2. Em caso de contaminação, as bancadas, aparelhos e pipetas podem ser descontaminadas limpando-as com DNA AWAY e RNase AWAY (Molecular BioProducts) ou com uma diluição de 1/10 de lexivía vulgar.* Depois disso, as bancadas e pipetas deverão serl lavadass com agua livre de RNases. Precauções gerais Recomendamos que armazene o stock das soluções de PCR em aliquotas pequenas e que utilize aliquotas frescas para cada PCR. Bibliografia A QIAGEN mantém uma vasta e actualizada base de dados online de publicações científicas referente à utilização dos seus produtos. As várias opções de procura, permitem a pesquisa do artigo científico requerido ou por palavra-chave, ou pela aplicação técnica, ou por area de investigação, título, etc. Para uma listagem completa de bibliografia, visite online a QIAGEN Reference Database em contacte os Serviços Técnicos da QIAGEN ou o seu distribuidor local. Bibliografia citada 1. van den Brule, A. J., Pol R., Fransen-Daalmeije, N., Schouls, L. M., Meijer, C. J., and Snijders, P. J. (2002) GP5+/6+ PCR followed by reverse line blot * A maioria das lixivías comercializadas são soluções de cerca de 5,25% hipoclorito de sódio. O hipoclorito de sódio é irritante e deve ser manuseado com cuidado. Ao trabalhar com produtos quimícos use sempre uma bata, livas descartáveis e óculos protectors. Para mais informações consulte as fichas de segurança disponibilizadas pelos fornecedores destes artigos. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

46 analysis enables rapid and high-throughput identification of human papillomavirus genotypes. J Clin Microbiol 40, Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/2010

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49 Informação para encomendas Produto Conteúdo Ref.ª digene HPV Genotyping RH Kit (20) Teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação, teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção Produtos relacionados QIAamp MinElute Virus Spin Kit (50) Para 50 minipreps: 50 QIAamp MinElute colunas, QIAGEN Protease, tampão RNA transportador, tampões, tubos (2 ml) EZ1 DSP Virus Kit (48) Para 48 preparações de ácidos nucleicos virais: Cartuchos de reagentes precarregados, Pontas com filtro descartáveis, Suportes para pontas descartáveis,tubos de amostras, Tubos de eluição, Tampões, RNA transportador Para informações actualizadas sobre o licenciamento e avisos de segurança, consulte os respectivos manuais de utilização. Todos os manuais deutilização de artigos da QIAGEN estão também disponíveis em ou podem ser solicitados aos Serviços Técnicos da QIAGEN ou ao seu distribuidor local. Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção 4/

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51 Marcas comerciais: QIAGEN, QIAamp, digene, EZ1, HotStarTaq ; Hybrid Capture, MinElute (QIAGEN Group); Finnpipette (Thermo Electron OY); ThinPrep, PreservCyt (Hologic Corporation), Thermomixer (Eppendorf). Acordo de licença limitada A utilização deste produto implica por parte de qualquer comprador do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção a aceitação dos seguintes termos: 1. O teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção pode ser utilizado exclusivamente de acordo com as especificações do Manuel do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção e usando unicamente os componentes contidos dentro do kit. A QIAGEN não oferece licença alguma sobre nenhuma das suas propriedades intelectuais para utilizar ou incorporar os componentes contidos no kit com componentes não incluídos no mesmo, excepto de acordo com o descrito no manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção e em protocolos adicionais disponíveis em 2. A parte das licenças expressamente especificadas, a QIAGEN não garante que este kit nem a sua utilização não infrinjam direitos de terceiros. 3. Este kit e os seus componentes estão licenciados para uma única utilização e não podem ser reutilizados, reacondicionados nem vendidos. 4. A QIAGEN especificamente renuncia a qualquer outra licença, explícita ou implícita, diferente das licenças expressamente especificadas. 5. O comprador e o utilizador do kit aceitam não realizar nenhum passo que possa conduzir a acções que sejam proibidas nas especificações anteriores ou que possam facilitá-las. A QIAGEN reserve-se ao direito de accionar legalmente acções perante qualquer tribunal para o cumprimento das proibições especificadas neste Acordo de Licença limitado e recuperará todos os gastos envolvidos na investigação e os custos judiciais, incluindo honorários de advogado, em qualquer acção interposta para fazer cumprir este Acordo de garantia limitada ou qualquer outro direito de propriedade intelectual em relação a este kit e seus componentes. Para obter os termos da licença actualizados visite QIAGEN todos os direitos reservados

52 Austrália Orders Fax Technical Áustria Orders 0800/ Fax 0800/ Technical 0800/ Bélgica Orders Fax Technical Brasil Orders Fax Technical China Orders Fax Technical Dinamarca Orders Fax Technical Finlândia Orders Fax Technical França Orders Fax Technical Offers Alemanha Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Irlanda Orders Fax Technical Itália Orders Fax Technical Japão Telephone Fax Technical Coreia do Sul Orders Fax Technical Luxemburgo Orders Fax Technical México Orders Fax Technical Holanda Orders Fax Technical Noruega Orders Fax Technical Singapura Orders Fax Technical Espanha Orders Fax Technical Suécia Orders Fax Technical Suiça Orders Fax Technical Reino Unido Orders Fax Technical PT Sample & Assay Technologies