ESTUDO DO COMPORTAMENTO ELETROQUÍMICO DE FITOESTROGÊNIOS E A DETERMINAÇÃO DESTES EM MATRIZES ALIMENTARES UTILIZANDO MÉTODOS ELETROANALÍTICOS
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- Juan Frade Chaplin
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1 Serviço Público Federal Ministério da Educação Fundação Universidade Federal de Mato Grosso do Sul Centro de Ciências Exatas e Tecnologia Programa de Pós Graduação em Química - Doutorado ESTUDO DO COMPORTAMENTO ELETROQUÍMICO DE FITOESTROGÊNIOS E A DETERMINAÇÃO DESTES EM MATRIZES ALIMENTARES UTILIZANDO MÉTODOS ELETROANALÍTICOS Daniela Kárin Fogliatto Orientador: Prof. Dr. Valdir Souza Ferreira CAMPO GRANDE - MS 2013
2 Serviço Público Federal Ministério da Educação Fundação Universidade Federal de Mato Grosso do Sul Centro de Ciências Exatas e Tecnologia Programa de Pós Graduação em Química - Doutorado ESTUDO DO COMPORTAMENTO ELETROQUÍMICO DE FITOESTROGÊNIOS E A DETERMINAÇÃO DESTES EM MATRIZES ALIMENTARES UTILIZANDO MÉTODOS ELETROANALÍTICOS. Daniela Kárin Fogliatto Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Química Nível de Doutorado - da Universidade Federal do Mato Grosso do Sul para obtenção do título de Doutor em Química (área de concentração: Química). Orientador: Prof. Dr. Valdir Souza Ferreira Colaboradores: Prof(a). Dr(a). Giovana Cristina Giannesi Dr. Antonio Marcos Jacques Barbosa CAMPO GRANDE - MS 2013
3 Dedico especialmente este trabalho: À Deus, sabendo que esta dedicação nada Lhe acrescenta, mas em profunda gratidão ao Seu auxílio; À minha mãe, Dirce, por sua doação e amor; E ao meu esposo, Raphael, pela paciência e compreensão!
4 TzÜtwxv ÅxÇàÉá Ao professor Dr. Valdir Souza Ferreira, pelo direcionamento nas pesquisas, auxílio, pela liberdade de realizar este trabalho e pela amizade. Aos professores doutores que aceitaram o convite de participar desta banca, acrescentando em meu aprendizado e nesta pesquisa com os seus conhecimentos. À Dr a. Giovanna Giannesi, do departamento de bioquímica, que se dispôs tão atenciosamente a contribuir com minha pesquisa. Ao professor Dr. Gilberto Maia que foi muito solícito, sanando minhas dúvidas e auxiliando com materiais, artigos e todo o necessário para me enriquecer no ensino da química. A todos os professores que permanecem com carinho em minhas lembranças, todos responsáveis por meu aprimoramento profissional e crescimento pessoal. À Tatianne, obrigada pela orientação e disponibilidade em ajudar sempre. Ao Antonio Marcos, pela contribuição neste trabalho. Aos meus colegas de laboratório agradeço pelos momentos de descontração, conversas, companhia e aprendizado juntos. Aos meus eternos amigos de graduação que compartilharam tantos momentos de minha vida, serão guardados com muito carinho. Ao Ademar, Celestino e professor Dr. Lincoln que foram muito atenciosos, contribuindo para a regularização de todo o processo de fechamento deste doutorado, muito obrigada. A minha tia Nilma e minha madrinha Enedina, pelo carinho todo especial, pela dedicação de mãe e as orações. À minha mãe Dirce, que a vida toda me ensinou os verdadeiros valores não com palavras, mas com ações. Agradeço porque ela me conduziu em uma fé cristã demonstrando-me que toda a força necessária para realização de meus projetos de vida está nas Mãos de Deus, eis a raíz que levou a conclusão deste trabalho hoje! Aos meus irmãos, Katia e Marcos, por saber que sempre poderei contar com eles, pela força e eterna amizade. Ao Raphael, meu esposo, pelo enorme carinho dedicado, pelas palavras de incentivo e fé e pela felicidade de partilhar uma vida em companheirismo e amor. À CAPES, CNPq e Fundect, pela bolsa de estudo e auxílios financeiros concedidos.
5 A todos que contribuíram para realização desse trabalho, MUITO OBRIGADA!
6 O que é estulto no mundo, Deus o escolheu para confundir os sábios; e o que é fraco no mundo, Deus o escolheu para confundir os fortes; e o que é vil e desprezível no mundo, Deus o escolheu, como também aquelas coisas que nada são, para destruir as que são. 1 Coríntios 1: Pois a loucura de Deus é mais sábia do que os homens, e a fraqueza de Deus é mais forte do que os homens. 1 Coríntios 1:25.
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8 Sumário vii SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS... xi LISTA DE TABELAS... xxviii LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS... xxxi RESUMO... xxxiii 1. INTRODUÇÃO Isoflavonas Mecanismo de ação Prevenção de câncer Redução do risco de doenças cardiovasculares e colesterol LDL Prevenção de doenças ósseas Agente anti-estafilocócica Efeitos adversos Métodos de extração das isoflavonas Hidrólise ácida Hidrólise enzimática Análise de isoflavonas Métodos cromatográficos Métodos eletroanalíticos O uso das técnicas eletroquímicas Cronocoulometria Voltametria Cíclica Voltametria de Onda Quadrada Eletrodos sólidos de amálgama Surfactantes Uso de surfactantes em estudos eletroquímicos OBJETIVOS Geral Específicos PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Preparo dos reagentes e soluções... 39
9 Sumário viii Soluções utilizadas nos estudos em eletroquímica Soluções para determinação da atividade enzimática Soluções para quantificação de proteínas Método Lowry Especificações gerais dos equipamentos Produção da enzima β-glucosidase Microrganismos Produção de β-glucosidase microbiana por fermentação em meio semi-sólido (FMSS) Determinação da atividade de β-glucosidase Quantificação de proteínas pelo Método Lowry Purificação parcial da β-glucosidase Hidrólise enzimática dos padrões de isoflavonas glicosiladas Preparo das amostras Extração Hidrólise Preparo do eletrodo sólido de amálgama de prata Medidas eletroquímicas Medidas cronocoulométricas Medidas cromatográficas RESULTADOS E DISCUSSÃO Comportamento eletroquímico das isoflavonas daidzeína e genisteína em eletrodo de Hg Estudo da interação e comportamento de redução da daidzeína e da genisteína em presença do surfactante BCTA Influência da velocidade de varredura de potencial por VC Diagnóstico do processo eletródico Estudo da interação e comportamento de redução da daidzeína e da genisteína em presença do surfactante DSS Influência da velocidade de varredura de potencial por VC Diagnóstico do processo eletródico Desenvolvimento de metodologia para determinação simultânea de
10 Sumário ix daidzeína e genisteína utilizando eletrodo sólido de amálgama de prata Comportamento de redução das isoflavonas daidzeína e genisteína e o uso de surfactantes Influência do tipo de eletrólito suporte e ph do meio Influência dos parâmetros instrumentais Estudo do tempo de deposição (t ac ) Estudo do potencial de deposição (E ac ) Estudo da amplitude dos pulsos (E sw ) Estudo da frequência de aplicação dos pulsos (f) Influência do incremento de varredura ( E s ) Parâmetros otimizados do método Curva analítica para análise simultânea de daidzeína e genisteína Obtenção da enzima β-glucosidase e otimização das condições para uso em hidrólise Produção da enzima β-glucosidase por fermentação semi-sólida Purificação parcial dos extratos brutos enzimáticos Perfis voltamétricos dos extratos enzimáticos de β-glicosidase e estudos de hidrólise nos padrões das isoflavonas glicosiladas Aplicação de metodologias eletroanalíticas na determinação das isoflavonas agliconas em produtos de soja Cromatografia líquida de alta eficiência como metodologia comparativa para validação de métodos Curvas analíticas para daidzeína e genisteína Análise de daidzeína e genisteína em produtos de soja por CLAE- UV Desenvolvimento de metodologia para determinação simultânea de biochanina A e formononetina utilizando eletrodo de amálgama de prata Influência do tipo de eletrólito suporte e ph do meio Influência dos parâmetros instrumentais Estudo do tempo de deposição (t ac ) Estudo do potencial de deposição (E ac ) Estudo da amplitude dos pulsos (E sw ) Estudo da frequência de aplicação dos pulsos (f)
11 Sumário x Influência do incremento de varredura ( E s ) Parâmetros otimizados do método Curva analítica para análise simultânea de formononetina e biochanina A Aplicação da metodologia eletroanalítica desenvolvida na análise simultânea da formononetina e biochanina A em medicamento fitoterápico à base de extrato da planta Trifolium pratense CONSIDERAÇÕES FINAIS PERSPECTIVAS FUTURAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICE Cálculos para obtenção dos resultados por cronocoulometria Cronocoulometria com o surfactante catiônico BCTA Cronocoulometria com o surfactante aniônico DSS Cromatogramas dos produtos de soja analisados após hidrólise enzimática com β-glicosidase de Aspergillus niger (purificado com acetona 2 V) pela técnica CLAE-UV (conforme Song et al., 2008) Quadro de créditos cursados no doutorado em química
12 Lista de Figuras xi LISTA DE FIGURAS Figura 1: Estrutura química do estrogênio feminino, 17-β-estradiol, e a semelhança com as estruturas dos compostos fitoestrogênios: isoflavona, lignana, cumestano e lactona do ácido resorcílico Figura 2: Biossíntese dos flavonóides (DI CARLO et al., 1999) Figura 3: Estrutura planar básica dos flavonóides (núcleo flavano) Figura 4: Principais isoflavonas na forma aglicona contidas nas plantas Figura 5: As quatro formas químicas das três isoflavonas análogas contidas na soja (Adaptado de KING & BIGNELL, 2000) Figura 6: Esquema de hidrólises: básica, ácida e enzimática em derivados de isoflavonas (DELMONTE et al., 2006) Figura 7: Estrutura da 4,7-dimetoxi-3 -isoflavona sulfônica de sódio (DISS) Figura 8: Esboço do microchip de vidro utilizado e terminologias propostas: PS, reservatório de bombeamento; G, reservatório de calibração ou de genisteína; TI, reservatório de isoflavonas totais (ESCARPA et al., 2007) Figura 9: (A) Resposta de excitação para um salto de potencial. (B) Cronocoulograma: resposta monitorada de carga-tempo (KISSINGER & HEINEMAN, 1996) Figura 10: Efeito de adsorção das espécies eletroativas em cronocoulometria. (A) Curvas carga-tempo dos componentes individuais que contribuem para carga total (Q total ). (B) Gráficos de Q vs. t 1/2 para Q total e Q dc (KISSINGER & HEINEMAN, 1996) Figura 11: Técnica de voltametria cíclica. Perturbação aplicada e resposta ciclovoltamétrica Figura 12: Resposta ciclovoltamétrica obtida para sistemas reversíveis (a) e
13 Lista de Figuras xii irreversíveis (b) Figura 13: (A) Forma de aplicação do potencial e (B) parâmetros utilizados em VOQ (Adaptado de ALEIXO, 2003; SOUZA et al., 2003) Figura 14: Voltamogramas de onda quadrada teórico para um sistema reversível (A) e para um sistema totalmente irreversível (B) (SOUZA et al., 2003) Figura 15: Representação figurativa do surfactante em solução aquosa (interface arágua) e estruturas químicas dos surfactantes: (a) Catiônico: brometo de cetiltrimetilamônio (BCTA); (b) Aniônico: dodecil sulfato de sódio (SDS) e (c) Neutro: Triton X Figura 16: Processo de formação de micelas com o aumento da concentração de surfactante Figura 17: Microrganismos Aspergillus oryzae e Aspergillus niger utilizados na produção da enzima β-glicosidase Figura 18: Etapas de preparação do eletrodo sólido de amálgama de prata Figura 19: Voltamogramas cíclicos para uma solução de 3, mol.l -1 de daidzeína ( ) e uma solução de 3, mol.l -1 de genisteína (. ), em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), ph 7,5-0,04 mol.l -1 (... ); ν = 200 mv.s Figura 20: Voltamogramas cíclicos para: (A) Solução de daidzeína (3, mol.l -1 ) na presença do surfactante catiônico BCTA (2, mol.l -1 ); (B) Solução de daidzeína (3, mol.l -1 ) na presença do surfactante aniônico DSS (2, mol.l -1 ). (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), ph 7,5-0,04 mol.l -1 ; ν = 200 mv.s Figura 21: Voltamogramas cíclicos para: (A) Solução de genisteína (3, mol.l -1 ) na presença do surfactante catiônico BCTA (2, mol.l -1 ); (B) Solução de genisteína (3, mol.l -1 ) na presença do surfactante aniônico DSS (2, mol.l -1 ). (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), ph 7,5-0,04 mol.l -1 ; ν = 200 mv.s Figura 22: Voltamogramas cíclicos da daidzeína (1, mol.l -1 ) no intervalo de
14 Lista de Figuras xiii ph 3,0 a 9,0. Eletrólito suporte: tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), v = 200 mv.s Figura 23: (A) Variação da E pc da daidzeína em função do ph do meio. (B) Variação do I pc da daidzeína em função do ph do meio. Eletrólito suporte: tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), v = 200 mv.s Figura 24: Esquema de desprotonação da daidzeína (LIANG et al., 2008; GAO et al., 2001) Figura 25: Voltamogramas cíclicos da genisteína (1, mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9,0. Eletrólito suporte: tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), v = 200 mv.s Figura 26: (A) Variação da E pc da genisteína em função do ph do meio. (B) Variação do I pc da genisteína em função do ph do meio. Eletrólito suporte: tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), v = 200 mv.s Figura 27: Esquema de desprotonação da genisteína (ZIELONKA et al., 2003) Figura 28: Cronocoulometria do surfactante catiônico BCTA sobre a superfície do eletrodo de gota pendente de mercúrio. Onde: (A) Eletrólito Suporte: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5 e (B) Eletrólito suporte + 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: E i = -1,3 V vs. Ag/AgCl; E f = -1,7 V vs. Ag/AgCl; duração: 60,1 s, tempo de amostragem 0,01s Figura 29: Voltamogramas cíclicos para: (A) Solução de 1, mol.l -1 de daidzeína; (B) Solução de 1, mol.l -1 de genisteína. Em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) ph 7,5 e na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), para um aumento da v de 10 a 500 mv.s Figura 30: Variação do E pc com a v, para uma solução de daidzeína (1, mol.l -1 ), na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 31: Variação do E pc com a v, para uma solução de genisteína (1,
15 Lista de Figuras xiv mol.l -1 ), na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 32: Variação da I pc com a v, para uma solução de daidzeína (1, mol.l -1 ), na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 33: Variação da I pc com a v, para uma solução de genisteína (1, mol.l -1 ), na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 34: Variação do log I pc com log v, para uma solução 1, mol.l -1 de daidzeína (A) e para uma solução 1, mol.l -1 de genisteína (B), na presença de BCTA (2, mol.l -1 ) em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ), no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 35: Variação da I pc com a v 1/2, para uma solução de daidzeína (1, mol.l -1 ), na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 36: Variação da I pc com a v 1/2, para uma solução de genisteína (1, mol.l -1 ), na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 37: Variação da função corrente de pico (I pc.v -1/2 ) com v, para uma solução de daidzeína (1, mol.l -1 ), na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 38: Variação da função corrente de pico (I pc. v -1/2 ) com a v, para uma solução de genisteína (1, mol.l -1 ), na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 39: Variação do E pc com log v, para uma solução de daidzeína 1, mol.l -1, na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 40: Variação do E pc com log v, para uma solução de genisteína (1, mol.l -1 ), na presença de BCTA (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2,
16 Lista de Figuras xv v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 41: Esquema de interação e adsorção da daidzeína e da genisteína com o surfactante BCTA sobre a superfície eletródica de gota de mercúrio Figura 42: Proposta de mecanismo de redução da daidzeína e da genisteína sobre a superfície eletródica de gota de mercúrio na presença de surfactante BCTA Figura 43: Voltamogramas cíclicos da daidzeína (1, mol.l -1 ) no intervalo de ph: (A) 3,0 a 7,0 e (B) 7,3 a 9,0. Eletrólito suporte: tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) na presença de DSS (2, mol.l -1 ), v = 200 mv.s Figura 44: Voltamogramas cíclicos da genisteína (1, mol.l -1 ) no intervalo de ph: (A) 3,0 a 7,0 e (B) 7,3 a 9,0. Eletrólito suporte: tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) na presença de DSS (2, mol.l -1 ), v = 200 mv.s Figura 45: (A) Variação do E p da daidzeína em função do ph do meio. (B) Variação do I p da daidzeína em função do ph do meio. Eletrólito suporte: tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) na presença de DSS (2, mol.l -1 ), v = 200 mv.s Figura 46: (A) Variação do E p da genisteína em função do ph do meio. (B) Variação do I p da genisteína em função do ph do meio. Eletrólito suporte: tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) na presença de DSS (2, mol.l -1 ), v = 200 mv.s Figura 47: Cronocoulometria do surfactante aniônico DSS sobre a superfície do eletrodo de gota pendente de mercúrio. Onde: (A) Eletrólito suporte: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5 e (B) Eletrólito suporte + 2, mol.l -1 de surfactante DSS. Parâmetros: E i = -1,1 V vs. Ag/AgCl; E f = -1,7 V vs. Ag/AgCl; duração: 60,1 s, tempo de amostragem 0,01s Figura 48: Voltamogramas cíclicos para: (A) Solução de 1, mol.l -1 de daidzeína; (B) Solução de 1, mol.l -1 de genisteína. Em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) ph 7,3 e na presença de DSS (2, mol.l -1 ), para um aumento da v de 50 a 500 mv.s Figura 49: Variação do E pc (A) e E pa (B) com a v, para uma solução de daidzeína
17 Lista de Figuras xvi (1, mol.l -1 ), na presença de DSS (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 50: Variação do E pc (A) e E pa (B) com a v, para uma solução de genisteína (1, mol.l -1 ), na presença de DSS (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 51: Variação do I pc (A) e I pa (B) com a v, para uma solução de daidzeína (1, mol.l -1 ), na presença de DSS (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 52: Variação do I pc (A) e I pa (B) com a v, para uma solução de genisteína (1, mol.l -1 ), na presença de DSS (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 53: Variação do log I pc com log v, para uma solução 1, mol.l -1 de daidzeína (A) e para uma solução 1, mol.l -1 de genisteína (B), na presença de DSS (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 54: Variação da I pc (A) e I pa (B) com a v 1/2, para uma solução de daidzeína (1, mol.l -1 ), na presença de DSS (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 55: Variação da I pc (A) e I pa (B) com a v 1/2, para uma solução de genisteína (1, mol.l -1 ), na presença de DSS (2, mol.l -1 ), em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 56: Variação da I pa /I pc com a v, para uma solução 1, mol.l -1 de daidzeína (A) e para uma solução 1, mol.l -1 de genisteína (B), na presença de DSS (2, mol.l -1 ) em tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ) no intervalo de ph 3,0 a 9, Figura 57: Esquema de interação e adsorção da daidzeína e da genisteína com o surfactante aniônico DSS sobre a superfície eletródica de gota de mercúrio Figura 58: Proposta de mecanismo de redução da daidzeína e da genisteína sobre a
18 Lista de Figuras xvii superfície eletródica de gota de mercúrio na presença de surfactante DSS Figura 59: Voltamogramas de onda quadrada de redução da daidzeína e genisteína, onde: (... ) Tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), ph 7,5-0,04 mol.l -1 ; ( ) solução de daidzeína e genisteína a 1, mol.l -1. Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 60: Voltamogramas de onda quadrada para: (A) Solução de 3, mol.l - 1 de daidzeína ( ); (B) Solução de 3, mol.l -1 de genisteína ( ). Onde: (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5 e (----) Branco + Surfactante neutro Triton X-100 (3, mol.l -1 ). Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 61: Voltamogramas de onda quadrada para: (A) Solução de 1, mol.l - 1 de daidzeína ( ); (B) Solução de 1, mol.l -1 de genisteína ( ). Onde: (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5 e (----) Branco + Surfactante aniônico DSS (6, mol.l -1 ). Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 62: Voltamogramas de onda quadrada para: (A) Solução de 1, mol.l - 1 de daidzeína ( ); (B) Solução de 1, mol.l -1 de genisteína ( ). Onde: (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5 e (----) Branco + Surfactante catiônico BCTA (2, mol.l -1 ). Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 63: Voltamogramas de onda quadrada de redução de 1, mol.l -1 de daidzeína no intervalo de ph de 4,5 a 10,5, em tampão BR:metanol (8:2, v/v), 0,04 mol.l -1, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 64: (A) Variação do E pc da daidzeína em função do ph do meio. (B) Variação da I pc da daidzeína em função do ph do meio. Eletrólito suporte: tampão BR:metanol (8:2, v/v) - 0,04 mol.l -1, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante catiônico BCTA Figura 65: Voltamogramas de onda quadrada de redução de 1, mol.l -1 de
19 Lista de Figuras xviii daidzeína no intervalo de ph de 6,0 a 9,0, em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), 0,04 mol.l -1, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 66: Variação de I pc de uma solução de daidzeína (1, mol.l -1 ) em função do ph do meio, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante catiônico BCTA, onde: ( ) Tampão BR:metanol (8:2, v/v), ph de 6,0 a 9,0; ( ) Tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), ph 6,0 a 9, Figura 67: Voltamogramas de onda quadrada de redução de 1, mol.l -1 de genisteína no intervalo de ph de 4,0 a 10,5, em tampão BR:metanol (8:2, v/v), 0,04 mol.l -1, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 68: (A) Variação do E pc da genisteína em função do ph do meio. (B) Variação da I pc da genisteína em função do ph do meio. Eletrólito suporte: tampão BR:metanol (8:2, v/v) - 0,04 mol.l -1, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante catiônico BCTA Figura 69: Voltamogramas de onda quadrada de redução de 1, mol.l -1 de genisteína no intervalo de ph de 6,0 a 9,0, em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), 0,04 mol.l -1, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 70: Variação de I pc de uma solução de genisteína (1, mol.l -1 ) em função do ph do meio, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante catiônico BCTA, onde: ( ) Tampão BR:metanol (8:2, v/v), ph de 6,0 a 9,0; ( ) Tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), ph 6,0 a 9, Figura 71: Voltamogramas de onda quadrada de uma solução contendo daidzeína e genisteína (1, mol.l -1 ) em presença de BCTA 2, mol.l -1 para diferentes concentrações do tampão fosfato:metanol (8:2, v/v) em ph 7,5: (a) 0,04 mol.l -1, (b) 0,06 mol.l -1, (c) 0,08 mol.l -1, (d) 0,1 mol.l Figura 72: Voltamogramas de onda quadrada de redução da daidzeína e genisteína em diferentes concentrações de BCTA. (...) Tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), ph 7,5-0,04 mol.l -1 + solução de daidzeína e genisteína a 1, mol.l -1. (a-j)
20 Lista de Figuras xix Adições do surfactante BCTA: (a) 6, ; (b) 7, ; (c) 7, ; (d) 9, ; (e) 9, mol.l -1 ; (f) 1, mol.l -1 ; (g) 2, mol.l -1 ; (h) 3, mol.l -1 ; (i) 3, mol.l -1 ; (j) 4, mol.l -1. Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 73: (A) Variação de E pc em função da concentração do surfactante BCTA (5, a 5, mol.l -1 ) para uma solução de daidzeína e genisteína ( 1, mol.l -1 ). (B) Variação de I pc em função da concentração do surfactante BCTA (5, a 5, mol.l -1 ) para uma solução de daidzeína e genisteína ( 1, mol.l -1 ). Eletrólito suporte: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), ph 7,5-0,04 mol.l Figura 74: Efeito do tempo de acúmulo sobre I pc da genisteína e daidzeína ( 5, mol.l -1 ) em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: E ac : 0 V; E sw : 30 mv; f: 60 Hz; E s : 5 mv Figura 75: Efeito do potencial de acúmulo sobre I pc da genisteína e daidzeína ( 5, mol.l -1 ) em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E sw : 30 mv; f: 60 Hz; E s : 5 mv Figura 76: Efeito da amplitude dos pulsos sobre I pc da genisteína e da daidzeína ( 5, mol.l -1 ) em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv Figura 77: Efeito da amplitude dos pulsos (E sw ) sobre E pc da genisteína e da daidzeína ( 5, mol.l -1 ) em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv Figura 78: Voltamogramas de onda quadrada de redução da genisteína e daidzeína ( 5, mol.l -1 ) em diferentes valores de amplitude de pulso. Onde (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv
21 Lista de Figuras xx Figura 79: Efeito da frequência de aplicação dos pulsos sobre I pc da daidzeína e da genisteína ( 5, mol.l -1 ) em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : 0 V; E sw : 30 mv; E s : 5 mv Figura 80: Voltamogramas de onda quadrada de redução da daidzeína e da genisteína ( 5, mol.l -1 ) em diferentes valores de frequência de aplicação dos pulsos. Onde (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : 0 V; E sw : 30 mv; E s : 5 mv Figura 81: Efeito do incremento de varredura sobre I pc da daidzeína e da genisteína ( 5, mol.l -1 ) em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : 0 V; E sw : 30 mv; f: 60 Hz Figura 82: Voltamogramas de onda quadrada de redução da daidzeína e da genisteína ( 5, mol.l -1 ) em diferentes valores de incremento de varredura. Onde (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : 0 V; E sw : 30 mv; f: 60 Hz Figura 83: Voltamogramas de redução da daidzeína e genisteína em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v) - ph7,5, na presença de BCTA (2, mol.l -1 ); onde: (a) 1,4.10-6, (b) 2,7.10-6, (c) 4,1.10-6, (d) 5,4.10-6, (e) 6,8.10-6, (f) 8,1.10-6, (g) 9,4.10-6, (h) 1, mol.l -1. Parâmetros: t ac = 60 s, E ac = 0 V, f = 60 Hz, E sw = 30 mv, E s = 5 mv Figura 84: Curvas de calibração mostrando a dependência de I pc em função da concentração de daidzeína e de genisteína, no intervalo de 1,4x10-6 a 1,1x10-5 mol.l Figura 85: Influência do tempo de incubação na resposta da atividade enzimática. Produção de β-glucosidase por fermentação semi-sólida utilizando Aspergillus niger e Aspergillus oryzae Figura 86: Influência do tempo de armazenamento dos extratos enzimáticos brutos
22 Lista de Figuras xxi e purificados de Aspergillus oryzae e Aspergillus niger na atividade enzimática Figura 87: Perfis voltamétricos dos extratos brutos e purificados da enzima β- glicosidase a partir dos fungos: (A) Aspergillus niger bruto; (B) Aspergillus oryzae bruto; (C) Aspergillus niger acetona; (D) Aspergillus oryzae etanol. Onde: (...) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ) - ph7,5 + 2, mol.l -1 de BCTA; (---) 50 µl dos extratos enzimáticos de β-glicosidase; ( ) Adição dos padrões de daidzeína e genisteína a 1, mol.l -1. Parâmetros: t ac : 50s, E ac : 0 V; f: 100 Hz, E sw : 30mV, E s : 6 mv Figura 88: Perfil voltamétrico das isoflavonas glicosiladas (A) Solução contendo 1, mol.l -1 de daidzina (B) Solução contendo 3, mol.l -1 de genistina. Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v) - ph7,5 (0,04 mol.l -1 ), na presença de BCTA (2, mol.l -1 ). Parâmetros: t ac : 50s, E ac : 0 V; f : 100 Hz, E sw : 30mV, E s : 6 mv, utilizando eletrodo de gota pendente de mercúrio Figura 89: Voltamogramas de onda quadrada referente às análises de determinação de daidzeína obtida após a conversão pela enzima β-glicosidase a partir dos fungos: (A) Aspergillus niger bruto; (B) Aspergillus oryzae bruto; (C) Aspergillus niger acetona; (D) Aspergillus oryzae etanol. Onde: (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ) - ph7,5 + 2, mol.l -1 de BCTA; ( ) adição de 200 µl da solução hidrolisada; ( ) Adições do padrão de daidzeína. Parâmetros: t ac : 50s, E ac : 0 V; f : 100 Hz, E sw : 30mV, E s : 6 mv, utilizando eletrodo de gota pendente de mercúrio Figura 90: Voltamogramas de onda quadrada referente às análises de determinação de genisteína obtida após a conversão pela enzima β-glicosidase a partir dos fungos: (A) Aspergillus niger bruto; (B) Aspergillus oryzae bruto; (C) Aspergillus niger acetona; (D) Aspergillus oryzae etanol. Onde: (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ) - ph7,5 + 2, mol.l -1 de BCTA; ( ) adição de 200 µl da solução hidrolisada; ( ) Adições do padrão de genisteína. Parâmetros: t ac : 50s, E ac : 0 V; f : 100 Hz, E sw : 30mV, E s : 6 mv, utilizando eletrodo de gota pendente de mercúrio Figura 91: Influência da quantidade de enzima β-glicosidase de Aspergillus niger (extrato purificado com acetona) empregada na hidrólise das isoflavonas
23 Lista de Figuras xxii glicosiladas para obtenção das isoflavonas agliconas. Onde: (A) Apresenta as concentrações de daidzeína e (B) as concentrações de genisteína encontradas pela técnica de VOQ em HMDE, após a hidrólise nas amostras de farinha de soja, proteína de soja e medicamento fitoterápico Figura 92: Voltamogramas de onda quadrada referente às análises de daidzeína e genisteína em farinha de soja (A), proteína de soja (B) e medicamento fitoterápico (C), após hidrólise enzimática; onde: (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v) - ph7,5 (0,04 mol.l -1 ), na presença de BCTA (2, mol.l -1 ); ( ) 30 µl do extrato hidrolizado; ( ) adições dos padrões de daidzeína e genisteína. Parâmetros: t ac : 50s, E ac : 0 V; f : 100 Hz, E sw : 30mV, E s : 6 mv, utilizando eletrodo de gota pendente de mercúrio Figura 93: Curvas de recuperação da daidzeína e genisteína obtidas após as análises das amostras de farinha de soja (A), proteína de soja (B) e medicamento fitoterápico (C) utilizando a técnica de VOQ em HMDE Figura 94: Curvas da dependência de I pc com a concentração de daidzeína ou de genisteína para a quantificação destas isoflavonas agliconas em farinha de soja (A), proteína de soja (B) e medicamento fitoterápico (C) utilizando a técnica de VOQ em HMDE Figura 95: Voltamogramas de onda quadrada referente às análises de daidzeína e genisteína em farinha de soja (A), proteína de soja (B) e medicamento fitoterápico (C), após hidrólise enzimática; onde: (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v) - ph7,5 (0,04 mol.l -1 ), na presença de BCTA (2, mol.l -1 ); ( ) 50 µl do extrato hidrolizado; ( ) adições dos padrões de daidzeína e genisteína. Parâmetros: t ac = 60 s, E ac = 0 V, f = 60 Hz, E sw = 30 mv, E s = 5 mv, utilizando eletrodo sólido de amálgama de prata Figura 96: Curvas de recuperação da daidzeína e genisteína obtidas após as análises das amostras de farinha de soja (A), proteína de soja (B) e medicamento fitoterápico (C) utilizando a técnica de VOQ em AgSAE Figura 97: Curvas da dependência de I pc com a concentração de daidzeína ou de genisteína para a quantificação destas isoflavonas agliconas em farinha de soja (A),
24 Lista de Figuras xxiii proteína de soja (B) e medicamento fitoterápico (C) utilizando a técnica de VOQ em AgSAE Figura 98: Perfil cromatográfico do padrão daidzeína nas concentrações injetadas entre 13,75 e 126,50 µg.ml -1 com t R de 32,071 minutos. Inserção: Curva analítica obtida para daidzeína. Fase Móvel: gradiente de solvente A: 0,1 % de ácido acético glacial em água e solvente B: 0,1 % de ácido acético glacial em acetonitrila, coluna C18 OmniSpher, fluxo de 1,5 ml.min -1, detecção em 260 nm Figura 99: Perfil cromatográfico do padrão genisteína nas concentrações injetadas entre 13,51 e 124,29 µg.ml -1 com t R de 40,242 minutos. Inserção: Curva analítica obtida para genisteína. Fase Móvel: gradiente de solvente A: 0,1 % de ácido acético glacial em água e solvente B: 0,1 % de ácido acético glacial em acetonitrila, coluna C18 OmniSpher, fluxo de 1,5 ml.min -1, detecção em 260 nm Figura 100: Gráficos comparativos das concentrações de daidzeína e de genisteína obtidas pelas técnicas analíticas de VOQ-HMDE, VOQ-AgSAE e CLAE-UV em farinha de soja, proteína de soja e medicamento fitoterápico Figura 101: Voltamogramas de onda quadrada de redução da formononetina e biochanina A, onde: (... ) Tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), ph 7,5-0,04 mol.l -1 ; ( ) solução de biochanina A (2, mol.l -1 ) e formononetina (1, mol.l - 1 ). Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 102: Voltamogramas de onda quadrada para: (A) Solução de 1, mol.l -1 de formononetina ( ); (B) Solução de 2, mol.l -1 de biochanina A ( ). Onde: (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5 e (----) Branco + Surfactante catiônico BCTA (2, mol.l -1 ). Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 103: Voltamogramas de onda quadrada de redução de 2, mol.l -1 de formononetina no intervalo de ph de 3,5 a 9,0 em tampão BR:metanol (8:2, v/v), 0,04 mol.l -1, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 104: (A) Variação do E pc da formononetina em função do ph do meio. (B)
25 Lista de Figuras xxiv Variação da I pc da formononetina em função do ph do meio. Eletrólito suporte: tampão BR:metanol (8:2, v/v) - 0,04 mol.l -1, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante catiônico BCTA Figura 105: Esquema de desprotonação da formononetina Figura 106: Voltamogramas de onda quadrada de redução de 2, mol.l -1 de formononetina no intervalo de ph de 6,0 a 8,0, em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), 0,04 mol.l -1, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 107: Variação de I pc de uma solução de formononetina (2, mol.l -1 ) em função do ph do meio, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante catiônico BCTA, onde: ( ) Tampão BR:metanol (8:2, v/v), ph de 6,0 a 8,0; ( ) Tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), ph 6,0 a 8, Figura 108: Voltamogramas de onda quadrada de redução de 2, mol.l -1 de biochanina A no intervalo de ph de 3,0 a 9,0, em tampão BR:metanol (8:2, v/v), 0,04 mol.l -1, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 109: (A) Variação do E pc da biochanina A em função do ph do meio. (B) Variação da I pc da biochanina A em função do ph do meio. Eletrólito suporte: tampão BR:metanol (8:2, v/v) - 0,04 mol.l -1, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante catiônico BCTA Figura 110: Esquema de desprotonação da biochanina A Figura 111: Voltamogramas de onda quadrada de redução de 2, mol.l -1 de biochanina A no intervalo de ph de 6,0 a 8,0, em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), 0,04 mol.l -1, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 112: Variação de I pc de uma solução de biochanina A (2, mol.l -1 ) em função do ph do meio, na presença de 2, mol.l -1 de surfactante catiônico BCTA, onde: ( ) Tampão BR:metanol (8:2, v/v), ph de 6,0 a 8,0; ( ) Tampão fosfato:metanol (8:2, v/v), ph 6,0 a 8,
26 Lista de Figuras xxv Figura 113: Voltamogramas de onda quadrada de redução da formononetina (2, mol.l -1 ) e biochanina A (2, mol.l -1 ) na presença de 2, mol.l -1 de surfactante BCTA para diferentes eletrólitos suporte, onde: (a) Tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ), ph 6,5; (b) Tampão BR:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ), ph 7,0; (c) Tampão fosfato:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5; (d) Tampão fosfato:metanol (8:2, v/v 0,04 mol.l -1 ), ph 8,0. Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 114: Voltamogramas de onda quadrada de redução da formononetina e biochanina A em diferentes concentrações de BCTA. Onde: (...) Tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5 + solução de formononetina e biochanina A na concentração de aproximadamente mol.l -1. (a-j) Adições do surfactante BCTA: (a) 5, mol.l -1 ; (b) 6, mol.l -1 ; (c) mol.l - 1 ; (d) 9, mol.l -1 ; (e) 1, mol.l -1 ; (f) 3, mol.l -1 ; (g) 3, mol.l -1 ; (h) 4, mol.l -1. Parâmetros: t ac : 0 s; E ac : 0 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv; E sw : 30 mv Figura 115: (A) Variação do E pc da formononetina e da biochanina A e (B) Variação da I pc da formononetina e da biochanina A em função da concentração do surfactante BCTA (5, a 4, mol.l -1 ) Figura 116: Efeito do tempo de acúmulo sobre I pc da formononetina (1, mol.l -1 ) e biochanina A (1, mol.l -1 ) em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 3, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: E ac : 0 V; E sw : 30 mv; f: 60 Hz; E s : 5 mv Figura 117: Efeito do potencial de acúmulo sobre I pc da formononetina (6, mol.l -1 ) e biochanina A (5, mol.l -1 ) em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 3, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E sw : 30 mv; f: 60 Hz; E s : 5 mv Figura 118: Voltamogramas de onda quadrada de redução da formononetina (4, mol.l -1 ) e biochanina A (3, mol.l -1 ) em diferentes valores de amplitude de pulso. Onde (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 3, mol.l -1 de surfactante BCTA.
27 Lista de Figuras xxvi Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : -0,3 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv Figura 119: Efeito da amplitude dos pulsos (E sw ) sobre E pc da formononetina (4, mol.l -1 ) e biochanina A (3, mol.l -1 ) em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 3, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : -0,3 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv Figura 120: Efeito da amplitude dos pulsos sobre I pc da formononetina (4, mol.l -1 ) e biochanina A (3, mol.l -1 ) em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 3, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : -0,3 V; f: 60 Hz; E s : 5 mv Figura 121: Efeito da frequência de aplicação dos pulsos sobre I pc da formononetina (4, mol.l -1 ) e biochanina A (3, mol.l -1 ) em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 3, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : -0,3 V; E sw : 30 mv; E s : 5 mv Figura 122: Voltamogramas de onda quadrada de redução da formononetina (4, mol.l -1 ) e biochanina A (3, mol.l -1 ) em diferentes valores de frequência de aplicação dos pulsos. Onde (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 3, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : -0,3 V; E sw : 30 mv; E s : 5 mv Figura 123: Efeito do incremento de varredura sobre I pc da formononetina (4, mol.l -1 ) e biochanina A (3, mol.l -1 ) em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 3, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : -0,3 V; E sw : 30 mv; f: 60 Hz Figura 124: Voltamogramas de onda quadrada de redução da formononetina (4, mol.l -1 ) e biochanina A (3, mol.l -1 ) em diferentes valores de incremento de varredura. Onde (... ) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ), ph 7,5, na presença de 3, mol.l -1 de surfactante BCTA. Parâmetros: t ac : 60 s; E ac : -0,3 V; E sw : 30 mv; f: 60 Hz Figura 125: Voltamogramas de redução da formononetina e biochanina A em tampão fosfato:metanol (8:2, v/v) - ph7,5, na presença de BCTA (3, mol.l - 1 ); onde: (a) 5, mol.l -1, (b) 7, mol.l -1, (c) 1, mol.l -1, (d)
28 Lista de Figuras xxvii 2, mol.l -1, (e) 2, mol.l -1, (f) 3, mol.l -1, (g) 4, mol.l -1. Parâmetros: t ac = 60 s, E ac = -0,3 V, f = 60 Hz, E sw = 30 mv, E s = 6 mv Figura 126: Curvas de calibração mostrando a dependência de I pc em função da concentração de formononetina (A) e de biochanina A (B), no intervalo de 5, a 4, mol.l Figura 127: Voltamogramas de onda quadrada referente à análise de formononetina e biochanina A em medicamento fitoterápico do extrato de Trifolium pratense; onde: (...) Branco: tampão fosfato:metanol (8:2, v/v - 0,04 mol.l -1 ) - ph7,5, na presença de BCTA (3, mol.l -1 ); (a) 30 µl do extrato da amostra; (P 1 P 4 ) adições dos padrões de formononetina e biochanina A. Parâmetros: t ac : 60s, E ac : - 0,3 V; f : 60 Hz, E sw : 30mV, E s : 6 mv Figura 128: Curvas de recuperação da formononetina (A) e biochanina (B) obtidas após a análise da amostra de medicamento fitoterápico do extrato de Trifolium pratense utilizando a técnica de VOQ em AgSAE Figura 129: Curvas da dependência de I pc com a concentração de formononetina (A) e biochanina (B) para a quantificação destas isoflavonas agliconas em medicamento fitoterápico do extrato de Trifolium pratense utilizando a técnica de VOQ em AgSAE
29 Lista de Tabelas xxviii LISTA DE TABELAS Tabela 1: Influência do tempo de hidrólise (HCl - 2 mol.l -1 ) para a obtenção de agliconas, a partir do extrato metanólico da farinha de soja desengordurada Tabela 2: Biotransformação de isoflavonas glicosiladas em agliconas Tabela 3: Porcentagem de recuperação de isoflavonas agliconas após a extração utilizando uma variedade de métodos para remover os carboidratos conjudados Tabela 4: Técnicas analíticas empregadas na análise de fitoestrogênios da classe das isoflavonas em diversificados tipos de amostras Tabela 5: Determinação de isoflavonas por CLAE ou CG Tabela 6: Testes diagnósticos em VC para processos reversíveis, irreversíveis e quase-reversíveis Tabela 7: Dados obtidos para regressão linear dos dois segmentos apresentados no estudo da influência do ph no E pc da daidzeína em surfactante BCTA através da VC Tabela 8: Dados obtidos para regressão linear dos dois segmentos apresentados no estudo da influência do ph no E pc da genisteína em surfactante BCTA através da VC Tabela 9: Valores da inclinação obtidos para variação de log I pc vs. log v nos voltamogramas cíclicos de redução da daidzeína e da genisteína em BCTA Tabela 10: Cálculo teórico de αn e do número de elétrons (n), envolvidos na redução da daidzeína para cada valor de ph analisado, a partir do gráfico do E pc vs. log v obtido pelos voltamogramas cíclicos Tabela 11: Cálculo teórico de αn e do número de elétrons (n), envolvidos na redução da genisteína para cada valor de ph analisado, a partir do gráfico do E pc vs.
30 Lista de Tabelas xxix log v obtido pelos voltamogramas cíclicos Tabela 12: Valores da inclinação obtidos para variação de log I pc vs. log v nos voltamogramas cíclicos de redução da daidzeína e da genisteína em DSS Tabela 13: Cálculo teórico do número de elétrons (n) envolvidos na redução da daidzeína e da genisteína para cada valor de ph na presença do surfactante DSS Tabela 14: Dados obtidos para regressão linear dos três segmentos apresentados no estudo da influência do ph sobre o E pc da daidzeína através da VOQ Tabela 15: Dados obtidos para regressão linear dos três segmentos apresentados no estudo da influência do ph sobre o E pc da genisteína através da VOQ Tabela 16: Parâmetros instrumentais para análise de daidzeína e genisteína pela técnica de VOQ em eletrodo sólido de amálgama de prata Tabela 17: Parâmetros estudados para a validação do método eletroanalítico na análise de daidzeína e genisteína por VOQ em eletrodo sólito de amálgama de prata. 112 Tabela 18: Estudo do tempo de incubação das linhagens Aspergillus niger e Aspergillus oryzae por fermentação semi-sólida Tabela 19: Purificação parcial da β-glucosidase de Aspergillus niger e Aspergillus oryzae Tabela 20: Produção do extrato bruto e do extrato parcialmente purificado de β- glucosidase de Aspergillus niger e Aspergillus oryzae para aplicação nas hidrólises enzimáticas Tabela 21: Determinação de daidzeína nas soluções hidrolisadas, através da técnica de VOQ em eletrodo HMDE Tabela 22: Determinação de genisteína nas soluções hidrolisadas, através da técnica de VOQ em eletrodo HMDE Tabela 23: Resultados dos estudos de recuperação de daidzeína e genisteína nas amostras hidrolisadas dos produtos de soja, através da técnica de VOQ utilizando HMDE
31 Lista de Tabelas xxx Tabela 24: Determinação de daidzeína e genisteína em produtos de soja após hidrólise enzimática com β-glicosidase de Aspergillus niger purificado com acetona (2 V), através da técnica de VOQ em eletrodo HMDE Tabela 25: Resultados dos estudos de recuperação de daidzeína e genisteína nas amostras hidrolisadas dos produtos de soja, através da técnica de VOQ utilizando AgSAE Tabela 26: Determinação de daidzeína e genisteína em produtos de soja após hidrólise enzimática com β-glucosidase de Aspergillus niger purificado com acetona (2 V), através da técnica de VOQ em eletrodo AgSAE Tabela 27: Conteúdo de genisteína e daidzeína encontrados nos produtos de soja por CLAE Tabela 28: Comparação entre os resultados obtidos para quantificação de daidzeína e genisteína nos derivados de soja através das metodologias de VOQ-HMDE, VOQ- AgSAE e CLAE-UV Tabela 29: Dados obtidos para regressão linear dos dois segmentos apresentados no estudo da influência do ph sobre o E pc da formononetina através da VOQ Tabela 30: Dados obtidos para regressão linear dos dois segmentos apresentados no estudo da influência do ph sobre o E pc da biochanina A através da VOQ Tabela 31: Parâmetros instrumentais para análise de formononetina e biochanina A pela técnica de VOQ em eletrodo sólido de amálgama de prata Tabela 32: Parâmetros estudados para a validação do método eletroanalítico na análise de formononetina e biochanina A por VOQ em eletrodo sólito de amálgama de prata Tabela 33: Resultados dos estudos de recuperação de formononetina e biochanina A nas amostras de medicamento fitoterápico, através da técnica de VOQ utilizando AgSAE Tabela 34: Determinação de formononetina e biochanina A em medicamento fitoterápico do extrato de Trifolium pratense por VOQ em eletrodo AgSAE
5.1. Estudos preliminares e otimização.
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