Métodos em Ecologia Química

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1 Métodos em Ecologia Química Maria Carolina Blassioli Moraes, Miguel Borges e Raúl Laumann Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Brasilia, DF. carolina.blassioli@embrapa.br

2 Interações Ecológicas Ecologia Comportamental Estuda as relações comportamentais entre o organismo e o meio ambiente Ecologia Química Estuda as substâncias químicas (Semioquímicos) envolvidas nas interações entre os organismos

3 Interações Ecológicas s seres vivos produzem substâncias químicas que os ajudam a sobreviver. Qualquer substância química que liberada por um ser vivo que provoque uma mudança fisiológica e/ou comportamental é um SEMIQUÍMIC Semio = Semeon (do grego) = sinal

4 Terminologia Semioquímico Um composto envolvido na interação entre organismos Aleloquímicos Interespecífica (- +) Cairomônio Alomônio (+ -) (+ +) Sinomônio Beneficia a planta e o parasitóide Feromônio Feromônios Intraespecífica

5 Percepção dos estímulos químicos A antena do inseto é o principal órgão de percepção dos compostos químicos.

6 Percepção dos estímulos químicos

7 3 C 3 C C 3 2 C C 2 3 C 3 C C 3 2 C C 2 Percepção dos estímulos químicos Dendritos extrernos Dendrit o Receptor Complexo PL-odorante Cutícula Poro Poros Linfa sensilar PL dorante no ar Cutícula Linfa sensilar Seletividade e sensibilidade Soma Sinal elétrico Axônio

8 Química dos Semioquímicos Semioquímicos Foto em Túnel de Vento: Prof. Eraldo Lima Induzem Modificações no Comportamento do Indivíduo

9 Feromônio de insetos Compostos defensivos Feromônio sexual de mariposas (E)-tetradec-9-enyl acetate (E)-hex-2-enal (Z)-tetradec-9-enyl acetate (E)-oct-2-enal (E)-dec-2-enal tridecane Feromônio sexual de percevejos (9Z,12E)-tetradeca-9,12-dienyl acetate (Z)-dodec-7-enyl acetate (E)-4-oxohex-2-enal (R) (R) (3Z,6Z,9Z)-nonadeca-1,3,6,9-tetraene 2-nonyl-3-((2Z,5Z)-octa-2,5,7-trienyl)oxirane (E)-4-oxooct-2-enal (R) (S) (1R,4S,1 S) Zingiberenol (Z) (7R) Sesquifelandreno (E)-4-oxodec-2-enal (S) (R) (S) (2E,4Z,6Z) decatrienoato de metila (2S,6R,10S) trimetiltridecanoato de metila

10 Defesa de plantas contra insetos herbívoros Uma ferramenta alternativa para o controle biológico Constitutiva e induzida Defesa indireta: Compostos voláteis que atraem o inimigo natural do herbívoro Defesa direta: Compostos voláteis e não voláteis que agem diretamente sobre o herbívoro Salicilato de metila (E,E)-α-farneseno (Z)-3-acetato de hexenila

11 Biossíntese de feromônios e metabolitos secundários C hν Fotossíntese Glicose e outros acúcares P 4-fosfato eritrose P Piruvato fosfoenol äcidos nucleiocs, plissacarídeos, glicosídeos + ácido pirúvico Ácido chiquímico C 3 CSCoA acetyl coenzima A Aminoácidos alifáticos Aminoácidos aromáticos + C 2 Compostos phenyl-c 3 outrso compostos aromáticos, lignanas, taninos, flavooides Ciclo do ácido cítrico Peptídeos proteínas e alcalóides C Energia Policetídeos e ácidos gráxos - CC 2 CSCoA Malonil coenzima A + C 3 CSCoA C 3 CC 2 CSCoA Acetoacetyl coenzima A + C 3 CSCoA Isoprenóides terpenos Esteróides Carotenos (R) Acetogeninas hidrocarboentos hormônios Eicosanóides ácido mavalônico Modificado de: Biosynthesis in insects, (David Morgan)

12 Introdução RTA D MEVALNAT -MVA RTA D METILERITRITL FSFAT - MEP 3 Acetil CoA (C 2 ) CERIVASTATIN 3-hidróxi-3-metil-glutaril-coA redutase (MGR) Ácido Mevalônico FSMIDMICINA 1-deóxi-D-xilulose-5- fosfato redutoisomerase (DXR) Piruvato Gliceraldeído-3-fosfato (C 3 ) (C 3 ) Metileritritol fosfato Fig. Rebecca enretta Sesquiterpenos, homoterpenes e Triterpenos Monoterpenos, Diterpenos e Tetraterpenos

13 eath et al., 2013 Arthropod-Plant Interactions 7:1-20.

14 Biossíntese de metabolitos secundários Condensação de Claisen novas ligações Carbono-Carbono R R + R R NaC 2 C R R R + R- 3 C C Ka = 3x R R R R 2 C + + C Ka = 1 x R R 2 C R + S-R R R + + C Ka = 1 x SR

15 Biossíntese de feromônios 3 C C + 3 C 2 C C C 3 C +11 C 3 C -C 2 2 C 3-methylpentacosane

16 Biossíntese de feromônios 3 C C + 3 C 2 C C Prop-Prop-Prop-Prop-Prop-Ac-Ac-Prop-Prop-Ac-Ac (4R,6S,8S,10R,16S,18R)-4,6,8,10,16,18-hexamethyldocosane

17 Biossíntese de feromônios enzima Fe III Fe IV S - enzima enzima Fe III Fe III + 2 S - enzima

18 Biossíntese de feromônios oleic acid em plantas ácido linolêico ácido linolênico em animais ácido araquidônico

19 Biossíntese do cis-jasmone através do ácido linolênico Linolenic acid C 2 cis-jasmone C 2 C 2 C 2 C 2 C 2 C 2 12-oxo-10,15-(Z)-phytodienoic acid (12-oxo-PDA)

20 Rota biossintetica de acidos Indole-3-glycerol phosphate BX1 Indole N hidroxamicos BX2 Indolin-3-one N BX3 3-ydroxy- Indolin-2-one N TRIBA BX6 DIBA BX5 BX4 BA DIMBA 3 C BX7 N N BX8 (BX9) N N BX8 /BX9 N DIBA-glucoside 3 C N DIMBA-glucoside

21 Trigo- Principais compostos indentificados 3 C Dimboa N P-coumaric acid. C 3 MBA Syringic acid N 3 C MB A N P-hydroxybenzoic acid BA N 3 C C 3 Vanillic acid Ferullic acid C 3 3 C Moraes et al, Phytochemistry 2008

22 Feromônio sexual de percevejos Na ordem eteroptera a diversidade dos compostos pertencentes ao feromônio sexual é muito maior do que nas mariposas Não há padrões estabelecidos para famílias ou subfamílias.

23 Especificidade do Sinal Químico s feromônios sexuais são únicos-cada espécie possui o seu específico. A produção do feromônio sexual depende de fatores bióticos e abióticos. feromônio sexual de uma mesma espécie pode variar devido a diferenças geográficas.

24 Isomeria Isômeros estruturais ou constitucionais C 3 C 3 C 3 C C C Ac Ac Acetato de (Z)-5-dodecenila Z-5-C12AC Acetato de (Z)-7-dodecenila Z-7-C12AC

25 Isomeria Ac C 3 Z-11-C14AC Ac C 3 E-11-C14AC Estereoisômeros-Isômeros geométricos

26 Centro quiral Isomeria-Enantiomeria 2 N (S) (R) N 2 2 N N 2 Espelho

27 Compostos defensivos Tridecano 3 C C 3 idrocarbonetosalcanos/alcenos Aldeídos Em particular (E)-2-alcenais Ésteres 1-Trideceno (E)-2-exenal C C 3 (E)-2-ctenal C 3 C (E)-2-Decenal C 3 Acetato de (E)-2-hexenila C 3 3 C 4-xo-alcenais C 3 4-xo-(E)-2-hexenal C 3 4-xo-(E)-2-decenal

28 Compostos defensivos Percevejos Pentatomidae Coleoptera Teneobrinidae (E)-hex-2-enal (E)-oct-2-enal (E)-dec-2-enal tridecane (E)-4-oxohex-2-enal Coccinelideos (joaninhas) N 2 N N 2 (R) (Z) (S)-3-hydroxypiperidin-2-one (R,Z)-nonadec-10-ene-1,18-diamine (E)-4-oxooct-2-enal N (E)-4-oxodec-2-enal Propileina

29 Coleta de Feromônio por extração com solventes Em adultos: Dissecação de inseto, e extração dos conteúdos da glândula com uma capilar de vidro De ninfas: Exúvias frescas imersas em solvente 1mm Quimica Nova, 2012

30 Chinavia impicticornis Tridecano 33% (E)-2-Decenal 13% (E)-2-exenal 1% 4-xo-(E)-2- hexenal 47% Dichelops melacanthus Tridecano 21% Tetradecanal 2% (E)-2-exenal 1% Chinavia ubica Tridecano 32% (E)-2-Decenal 17% (E)-2-exenal 1% Tridecano 39% 4-xo-(E)-2- hexenal 44% Piezodorus guildinii Tridecano 15% Tetradecanal 2% 4-xo-(E)-2- hexenal 49% Euschistus heros Tetradecanal 1% (E)-2-exenal 4% (E)-2-exenal 27% Alarme e Defesa 4-xo-(E)-2- hexenal 31% (E)-2-ctenal 16% 4-xo-(E)-2- hexenal 55% (E)-2-ctenyl acetate 7% (E)-2-ctenal 13% Pareja et al, 2008

31 Diversidade dos Compostos nos Pentatomídeos A P. guildinii (E)-2-exenal E. heros Alarme e Defesa C. impicticornis e C. ubica CV2 (E)-2-ctenal (E)-2-Decenal D. melacanthus (E)-2-ctenal (E)-2-exenal (E)-2-ctenyl acetate Análise de Variáveis Canônicas

32 Diversidade dos Compostos nos Pentatomídeos Alarme e Defesa Chinavia impicticornis 4-xo-(E)-2-hexenal Pentadecane 4 4-idroxy-4-methyl-2-pentanone* Nymphs Females Tridecane -3 Males -4 6 (E)-2-Decenyl acetate 5 Pentadecane 4 (E)-2-Decenal 3 Females 2 Nymphs Males E-(2)-ctenal Chinavia ubica -5

33 Diversidade dos Compostos nos Pentatomídeos Euschistus heros 8 Decane Females 6 4 Tetradecanal Dodecane Males -4 Nymphs Pentadecane Pentadecene* -8 1-Tridecene* Dichelops melacanthus Tridecane 4 Pentadecane Alarme e Defesa (E)-2-ctenal 4-idroxy-4-methyl- 2-pentanone* Females Males Nymphs (E)-2-ctenal -3

34 Diversidade dos Compostos nos Pentatomídeos Piezodorus guildinii Alarme e Defesa 8 Tridecane Pentadecane 6 4-xo-(E)-2-hexenal 4 Tetradecanal Males Females -2 Nymphs Undecane -4 Tetradecane -6-8

35 Bombyx mori (E,Z)-10,12-exadecadien-1-ol

36 Classe de feromônio de insetos Não há uma classe específica para insetos. Lepidópteras: Tipo 1 Estrutura carbônica linear, variando de 10 a 18 Estrutura carbônica linear, variando de 10 a 18 carbonos, com grupos funcionais terminais, álcool, acetato ou aldeído, e duplas ligações, sendo a sua maioria dos compostos variando de 0 a 3 instaurações

37 Feromônio lepidópteras Tipo 1 Elasmopalpus lignoselus (Z)-9-Tetradecenyl acetate (Z)-7-Tetradecen-1-ol (Z)-9-Tetradecen-1-ol Acetato de tetradecila (Z)-9-Acetato de hexadecenila (Z)-11-Acetato de hexadecenila (Z)-11-exadecen-1-ol Acetato de hexadecila

38 Feromônio de lepidópteras s compostos do tipo II são hidrocarbonetos de cadeias longas de C17 a C23 e seus epóxidos

39 Feromônio lepidópteras Tipo 2 Anticarsia gematallis (Z,Z,Z) Eicosantriene (Z,Z,Z) eneicosantriene

40 Percevejos Liberação de Feromônio Sexual Machos produzem o feromônio sexual

41 Feromônio sexual e de agregação Moléculas relativamente apolares Alta volatilidade Apresentam, no geral, quiralidade e/ou insaturações

42 Percevejos neotropicais Thyanta perditor E2, Z4, Z6 Methyl decatrienoate Piezodorus guildinii (7R)-(+)-β- Sesquiphellandrene Zingiberenol Tibraca limbativentris

43 Podisus maculiventris 3-4 GAD machos Atraiu machos e fêmeas Linalool 0.83 α-terpineol Copyright 2005 Rattlebox Photography Terpinen-4-ol 0.93 (E)-2-exenal Copyright 2005 Rattlebox Photography Ãlcool benzílico

44 Compone ent 2 Diversidade dos Compostos nos Pentatomídeos Chlorochroa ulheri C.ligata omoterpeno E.heros Acetatos E.obscurus T.perditor E.politus E.conspercus E.servus E.tristigmus Terpeno Lactona C.ubica C.impicitcornis P.hybneri Tibraca limbativentris -0.5 A.hilare C.sayi A.pensylvanicum Sesquiterpeno oxigenado N.viridula -1 P.guildinii Feromônio Sexual Sesquiterpenos T.custator T.pallidovirens Análise de Componentes Principais -3 Component 1

45 Dendograma Feromonal ilarity Simi Análise de Clusters Método Ward Chlorochroa sayi C. ligarta C. ulheri T. limbativentris A. hilare A. pensylvanicum N. viridula C. ubica C. impicticornis T. pallidovirens T. custator E. heros E. obscurus E. conspercus P. guildinii P. hybneri E. tristigmus E. servus E. politus T. perditor

46 Diversidade dos Compostos nos Pentatomídeos Feromônio Sexual trans- Bisabolene epoxide cis-bisabolene epoxide A. marginatum A. pensnsylvanicum A. hilare A. hilare C. ubica C. impicticornis N. viridula N. viridula N. viridula N. viridula N. viridula % trans& cisepoxi-bisabolene N. viridula (Kyushu, JP) N. viridula (Misisipi, EUA) N. viridula (Maui, awai) N. viridula (Califórina, EUA) N. viridula (DF, Br) C. ilare (Georgia, EUA) C. ilare (Califórnia, EUA) C. Marginatum (Flórida, EUA) C. Pennsylvanicum (Maryland, EUA) C. Ubica (DF, BR) (Baker et al. 1987, Borges et al. 1987, Aldrich et al. 1992, Borges 1995, McBrien et al, 2000, Borges et al, unpublished) C.Impicitcornis (DF, BR)

47 Metodologia de Isolamento e Análise de Feromônios Fonte (Insetos) Bioensaios Síntese rgânica Extração/Concentração Separação/Fracionamento Identificação

48 Metodologia de Isolamento e Análise de Semioquímicos Coleta de material em campo e estabelecimento de colônia em laboratório

49 Mariposas Liberação de Feromônio Sexual Fotos: prof. Peter Witzgall

50 Mariposas Liberação de Feromônio Sexual

51 Coleta de Feromônios por Aeração

52 Sistema para coleta de voláteis de plantas e insetos

53 Sistema para coleta de voláteis de plantas e insetos

54 Esquema da câmera par coelta de voláteis

55 Adsorventes Químicos Materiais poliméricos PorapaK Q (co-polímero de p-divinilbenzenovinilbenzeno) Tenax (polifenilenoxida na base de 2,6 difenilfenol) Carvão ativado Super Q

56 Dessorção das amostras e Préconcentração das amostras sob fluxo de nitrogênio exano Super Q

57 Atividade Biológica de Feromônios fracionamento isolamento

58 Fracionamento da amostra Sílica e alumina cromatografia por adsorção. Tanto o solvente como o soluto são atraídos para a fase estacionária. Fase estacionária exano + éter mistura de Voláteis em hexano Adsorvent e Voláteis separados

59 Fracionamento argentometria Compostos orgânicos insaturados complexam com metais de transição- Prata

60 Microextração em fase sólida - SPME Tipos de Fibras: Apolares: Polidimetilsiloxano (PDMS) Polares: Polietileno glicol, poliacrilato Bipolares: PDMS-Divinilbenzeno

61 Microextração em fase sólida - SPME

62

63 Extração de semioquímicos em fase aquosa usando barra magnéticas de PDMS (SBSE) Barras magnéticas cobertas com polidimetilsiloxano Diferentes tamanhos de barras e diferentes espessuras do PDMS. Barra de ferro Adsorção dos analitos na barra Lâmina de vidro PDMS Dessorção dos analitos da barra Pré-concentração da amostra Análise Química GC, PLC, GC-MS

64 Análise de Feromônios Cromatografia gasosa é um método instrumental para separação e identificação de compostos químicos 1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).

65 Cromatografia gasosa

66 Coluna Capilares Coluna capilar: Diametro: 0.53 a 0.10 um Comprimento: 30 a 90 m. poliimida Suporte sólido vidro Fase estacionário líquida Absorção

67 Coluna Capilares-Fases estacionárias PLIGLICÓIS Muito polares; sensíveis a umidade e oxidação; ainda muito importantes. Principal: Polietilenoglicol (nomes comerciais: Carbowax, DB-Wax, Supelcowax, P-Wax, etc.) Estrutura Química: C 2 C 2 SILICNES (polisiloxanas) As FE mais empregadas em CG. Cobrem ampla faixa de polaridades e propriedades químicas diversas. n 3 C C 3 R 1 C 3 Si Si Si C 3 C 3 R 2 C 3 n R 1, R 2 = qualquer radical orgânico

68 Coluna Capilares-Fases estacionárias Fase estacionária Fases de polisiloxanas Dimetil -polisiloxana Nomes comerciais DB1, SPB-1, AT1, P1, RTX-1, CPSIL 5CB 5% Fenil-Metil polisiloxana DB5, SPB-5, AT5, P5, RTX-5, CPSIL 8CB 50% Fenil-Metil polisiloxana DB17, SPB-50, AT50, P17, RTX-50, CPSIL 19CB Polietileno glicol (PEG) DB-Wax, Wax-10, AT-WAX, P20M, RTx-200, CP-Wax

69 Detector de Ionização de chama CLETR AR SELETIVIDADE Seletivo para substâncias que contém ligações C- em sua estrutura química. FLAME TIP 2 BLC CLUNA Site :Chemkeys-DR. Fabio Augusto

70 Compostos que NÃ produzem resposta no DIC: Gases nobres 2, 2, N 2 C, C 2, CS 2 CCl 4, peralogenados N 3, N x y SiX 4 (X = halogênio) 2 C, C * DIC C 4 C 2 2 DCT N 2 Site :Chemkeys-DR. Fabio Augusto

71 C ANÁLISE QUALITATIVA Índice de Retenção de Kovàts C C C C13 C14 C C16 C17 C C19 C20 C Um gráfico de log(t R ) em função do número de átomos de carbono do analito n C é LINEAR Interpolação logarítmica dos t R

72 ANÁLISE QUALITATIVA Índice de Retenção de Kovàts TR n =8.603 TR N =9.580 C12 C13 TR A = Min KI = 100*n TR + 100* TR A N TR TR n n KI = 100* * KI=1229 Decanal

73 Padrao interno Análise Quantitativa PADRÃ AMSTRA + Padrão

74 Padrão interno A A a = pi k pi k a C C pi a v v ka é uma constante de proporcionalidade que depende do analito, do detector e das condições de operação do equipamento Ca é a concentração do analito v é o volume injetado de amostra.

75 Padrão interno A a = k C v Como as duas substâncias são injetadas simultaneamente, o volume é o mesmo nas duas equações a a A A a pi k = A pi k k pi C a pi A pi C C pi = a pi = Aa k C a k C pi a a C = pi v k k AaC A k pi s a pi a, pi = A C A a pi C pi a A a /A pi α A inclinação da reta é K C a /C pi C = a A C a A pi pi

76 Fator de Reposta do analito em relação ao Padrão interno A pi A a C a = AaC A k pi s a, pi A a /A s α A inclinação da reta é K K = a, pi A C A a pi C pi a C a /C s

77 Área do pico Padrão Externo Curva analítica- padrão injetado em diferentes concentrações. detector FID é proporcional a concentração y = x R² = C (g/ml) Área 2, , , , , Concentração g/ml Ligeiro et al., Química Nova, 2009 Métodos quantitativos em CG-DIC.

78 Padrão Externo Área do pico y = x R² = Concentração g/ml A=184 A=8.5*C =8.5*C+91.3 C=( )/8.5 C=10.8g/mL

79 Confiabilidade dos dados ( e da curva Analítica) C (g/ml) Área 1 Área 2 Área 3 Média 0, , , , , y = 414.3x R² = y = 448.1x R² = Área Área Concentração g/ml Concentração g/ml

80 GC-MS Cromatógrafo a gás Fonte de íons e e - - e - e e e e Analisador de massas Multiplicador De elétrons e6 10.0e6 400e e6 350e3 300e e e e3 150e e e e

81 Espectro de massas e e e e e3 200e3 200e e3 100e e3 0e e e e6 10.0e6 5.0e6 0.0e e e e3 500e e3 300e3 250e3 200e3 150e e e e e3 0e

82 Interpretação de espectro de massas IE C + 12 C C 1.1

83 NIST Wiley Bibliotecas de banco de espectros

84 Interpretação de espectro de massas Tridecano C Perda de C n 2n+1 + C n 2n-1 Isótopos 13C Abundância relativa (32502/218432)*100= 14, M + m/z

85 Espectro de massas Rearranjo de McLafferty Rearranjo do γ e quebra da ligação β a carbonila R r R retenção da carga α R + + m/z=58: R=C3. 40% (IE=8.7 ev) R=C65, 5% R R + migração da carga R=C3(IE=9.7eV), 5% R=C65 (IE=8.4), 100%

86 Interpretação de espectro de massas r α m/z= C m/z=57 C 3 m/z= M (w8n08) 2-Pentanone, 3-methyl-

87 Interpretação de espectro de massas r α m/z= (w8n08) Methyl Isobutyl Ketone 85 M + 100

88 Interpretação de espectro de massas 3 C Ácidos carboxílicos e seus derivados + 2 C γ McL 73 R + CR α 2 C R Substituinte R Clivagem γ McLafferty Clivagem α R= m/z 73 m/z 60 m/z 45 R=C 3 m/z 87 m/z 74 m/z 59 R=C 2 C 3 m/z 101 m/z 88 m/z 73

89 Interpretação de espectro de massas M + M +

90 Interpretação de espectro de massas M + M +

91 Interpretação de espectro de massas M +

92 Interpretação de espectro de massas M M (mainlib) Methyl 2,6,10-trimethyltridecanoate

93 Interpretação de espectro de massas C C3 C methyl 2-methylhexanoate M +

94 Interpretação de espectro de massas Compostos terpenóides C 3 C 3 3 C C 3 C 3 3 C C 3 C 3 C 3 3 C 2,6-dimethyloctane

95 Interpretação de espectro de massas Compostos terpenóides R R -e - α R α R + Retenção de carga m/z =68 R α R + Migração de carga m/z =68

96 Interpretação de espectro de massas RDA RDA + 56 u m/z 68 + m/z u

97 Limoneno felandreno

98

99 Linalol Mirceno

100 Thyanta perditor 2E,4Z,6Z-Decatrienoato de metila Moraes et al, JCE R e te n tio n T im e / m in.

101 Elucidação estrutural (2E,4Z,6Z)-Decatrienoato de metila Estratégias % 7 5 % 5 0 % A M +. M+-32, perda de C3, M+-31, perda de C % % % M -3 2 / % 5 0 % % 0 % R R + + C 3 C 2 C 2 C 3 Moraes et al, JCE 2005 M/z=74

102 Elucidação estrutural idrogenação Atmosfera com 2 e catalizador 10% de Pd (1h com agitação em vial cônico) Análise por PLC gerou um pico com absorbância máxima em 330nm Moraes et al, JCE 2005

103 Elucidação estrutural Configuração absoluta-isomeria Comparamos com diferentes isômeros- GC-MS (2E,4E,6E) -10:CMe (2E,4Z,6E) -10:CMe (2E,4E,6Z) -10:CMe (2E,4Z,6Z)- 10:CMe 2E,4Z,6Z -10:CMe T. Perditor Moraes et al, JCE 2005

104 Elucidação estrutural Configuração absoluta-centro estereogênicos Feromônio sexual do percevejo Tibraca limbativentris e ebalus poecilus 1,10-bisaboladien-3-ols ' ( 1'R)-zingiberenol ' ( 1'S)-zingiberenol

105 Elucidação estrutural Configuração absoluta-centro estereogênicos Coluna cromatográfica quiral Ciclodextrinas = açúcares cíclicos naturais

106 Elucidação estrutural Configuração absoluta-centro estereogênicos

107 Piezodorus guildinii (7R)-β-Sesquiphellandrene C 2 C 3 C C , (E)-2-hexenal; 2, ocimene isomer; 3, 2-ethylhexanol; 4, undecane; 5, nonanal; 6, tridecene; 7, tridecane; 8, α-farnesene; 9, β-sesquiphellandrene Borges et al., JCE 2007

108 GC-MS C 2 C 3 Sesquiphellandrene 7 C 3 Macho de P. guildinii C Padrão Sintético Borges et al., JCE 2007

109 Piezodorus guildinii (7S)-β-Sesquiphellandrene (7R)-β-Sesquiphellandrene 7 Cl Cl C Cl Cl (7R)-β-Sesquifelandreno Tetraclorobenzoquinona (7R)-α-Curcumeno Borges et al., JCE 2007

110 Determinação da Esterioquímica do Coluna quiral Cyclodex β C 2 C 3 C 3 Extrato natural R 7 3 C α-curcumeno sintético Isômeros R e S S R Borges et al., JCE 2007

111 Piezodorus guildinii C 2 C 3 C C Females n-exane * (R)-Sesquiphellandrene n-exane ns (S)-Sesquiphellandrene n-exane ns (R)-Sesquiphellandrene Males n-exane ns (S)-Sesquiphellandrene Response (Number of Insects) Borges et al., JCE 2007

112 ebalus poecilus

113 ebalus poecilus ' Extrato natural Padrão sintético

114 Derivatização com N-methyl-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide (MSTFA) Si MSTFA m/z 222 m/z=294 Extrato natural Sintético

115 Análise por cromatografia gasosa Coluna apolar DB-5 Extrato de macho derivatizado com MSFTA Extrato de macho Si Zingiberenol sintético Sintético derivatizado com MSFTA

116 Síntese do Zingiberenol DEATMS C 3 CN 1 K, TBA MeLi 4 TF, Et 2 Et 2 1

117 Elucidação estrutural Configuração absoluta-centro estereogênicos Coluna quiral Zingiberenol sintético

118 Elucidação estrutural Configuração absoluta-centro estereogênicos (R) ' 4 (R) (S) 2 S 4 Me 1' 4 (R) (S) 1' 4 (R) (S) (1R,4R,1 S)-Zingiberenol (4R,1 S)-Sesquiphellandrene (4R,1 S)- Zingiberene

119 Elucidação estrutural Configuração absoluta-centro estereogênicos 4R,1 R zingiberenol e 4S,1 R zingiberenol Zingibereno gerado do1 R-zingiberenol Natural zingibereno do óleo de zingibre 4R,1 S zingiberene 4R,1 S zingiberenol e 4S,1 S zingiberenol Zingibereno gerado do 1 S-zingiberenol Zingibereno gerado do extrato natural

120 Elucidação estrutural Configuração absoluta-centro estereogênicos 1RS 4R 1 S (R) 1 7 (R) (R) 1' 1' 4 (R) (S) (1R, 4R) -Quercivorol (1R, 4R, 1'S) -Zingiberenol

121 Elucidação estrutural Configuração absoluta-centro estereogênicos (R) 1 7 (R) (R) (R) 1' (S) 1' (1R, 4R) -Quercivorol (1R, 4R, 1'S) -Zingiberenol

122 Nezara and Chinavia Species C trans -bisabolene epoxide cis -Bisabolene epoxide 3 C C 3 C 3 C 3 trans- 1,2 epoxi-(z)- α-bisabolene C 3 3 C C 3 cis- 1,2 epoxi-(z)- α-bisabolene % trans & cis Epoxi-bisabolene C 3 C 3 3 C C 3 (z)- α-bisabolene C. Marginatum (Flórida, EUA) 0 N. viridula (Kyushu, JP) N. viridula (Misisipi, EUA) N. viridula (Maui, awai) N. viridula (Califórina, EUA) N. viridula (DF, Br) C. ilare (Georgia, EUA) C. ilare (Califórnia, EUA) C. Pennsylvanicum (Maryland, EUA) C. Ubica (DF, BR) C.Impicitcornis (DF, BR) (Baker et al. 1987, Borges et al. 1987, Aldrich et al. 1992, Borges 1995, McBrien et al, 2000, Borges et al, unpublished)

123 Tibraca limbativentris Peak Peak 16 Zingiberenol Zingiberenol m/z Borges et al., JCE 2006

124 Tibraca limbativentris Ionização química com amônia A Padrão de Zingiberenol Coluna quiral B Extrato de macho Time (min) Sililação A peak C Si C 3 C B peak m/z Borges et al., JCE 2006

125 Tibraca limbativentris Colunas cromatográficas com diferentes polaridades Zingiberenol Coluna polar Zingiberenol 2 Coluna apolar min T. limbativentris T. limbativentris 1 2 min min min Borges et al., JCE 2007

126 Tibraca limbativentris Zingiberenol No response Z I Z II ns No response No response exane Z II ** exane Z I ns Number of insects Borges et al. 2006

127 Mosca do gado ydrotea irritans Musca autumnalis aematobia irritans Stomoxys calcitrans Rothasmted Research- Michael Birkett

128 Atratividade diferencial Se o gado fosse igualmente atraente as moscas esperaríamos ter uma distribuição normal das moscas Birkett, M.A. et al., Med. Vet. Entom., 2004, 18,

129 Birkett, M.A. et al., Med. Vet. Entom., 2004, 18, Captura dos voláteis

130 Teste de campo com, 6-Metil-5-epten-2-ona 50 Percentage of flies A B C D E F Counting session Birkett, M.A. et al., Med. Vet. Entom., 2004, 18,

131 Aedes aegypti América do Sul, Asia, Africa e Australia Àreas rurais e urbanas Febre amarela e dengue

132 Coleta de voláteis -Air temperature and R -Body temperature -Questionnaire Rothasmted Research- Michael Birkett

133 Results -GC Traces pa Blank control min pa FID1 A, (R:\JAMES\T011202B.D) uman being min Rothasmted Research- Michael Birkett

134 Avaliar a influência de fitohormônios da defesa direta de plantas Cis-jasmone Voláteis Compostos não voláteis Ácidos hidroxâmicos e Fenólicos;

135 Rotas biossintéticas de metabólitos secundários em plantas Carbon Dioxide Glucose Calvin cycle Erythrose-phosphate glycolysis pentose phosphate or glycolysis Indole-3-glycerol-P shikimic acid/ tryptophan pathway tryptophan or non tryptophan pathway N Indole ydroxamic acids Acetyl Co-enzyme A Glyceral-3-P + Pyruvate alt. IPP pathway Isopentenyl pyrophosphate Monoterpenes C 2 C 3 3 C C 3 cimene 3 C C 2 3 C C 3 linalool fatty acid/ Green leaf volatiles lipoxygenase pathway melavonate pathway Sesquiterpenes C 3 C 3 3 C C 3 C 2 farnesene Jasmonic acid Cis-jasmone omortepenes C 3 C 3 3 C C 3 TMTT C 2

136 Rota metabólica ácido hidroxâmico em milho. Indole-3-glycerol phosphate BX1 Indole N BX2 Indolin-3-one N BX3 3-ydroxy- Indolin-2-one N TRIBA BX6 DIBA BX5 BX4 BA DIMBA 3 C BX7 N N BX8 (BX9) N N BX8 /BX9 N DIBA-glucoside 3 C N DIMBA-glucoside

137 Metodologias de etxração Extração na fase líquida 1. Pesar100 mg do tecido em frasco de 10mL 3. Adicionar 3 ml of M Cl e macerar 4. Sonicar por 10 min. 5. Extrair com érte etílico (3x10 ml) 6. Adicionar 3 µl of padrão interno(tetracosane 5 µg/ml) 7. Evaporar sobre N 2 8. Adicionar 0.1 ml de MSFTA (N-metil-N- trimetilsili(trifluoroacetamida) 9. eat at 60 o C for 1 hour 10. Analisar by GC

138 Perfil cromatográfico do extrato de plantas de trigo obtidos através de extração na fase líquida. Leaves 4 co-eluted 6 9 co-eluted Root Time (min)

139 Perfil cromatográfico do extrato de trigo obtido de folhas de trigo tratadas com cisjasmone B. Espectro de massas do composto Dimboa (18.41 min) confirmando a presença do composto trimetilsilil (TMS)-derivatizad odimba Dimboa C N Pm= g/mol Time (min) C 3 Relative Abundance C Si C C m/z N 3 C Si C C

140 18.36 C N MBA Pm= g/mol Time (min) Relative Abundance MBA N C Si 3 3 C C m/z

141 Main compounds identified in extraction solutions of Wheat using LPE and VPE 3 C Dimboa N P-coumaric acid. C 3 MBA Syringic acid N 3 C MBA N P-hydroxybenzoic acid BA N 3 C C 3 Vanillic acid Ferullic acid C 3 3 C

142 Quantidade média (±SE) de ácidos hidroxâmicos extraídos de raízes e folhas usando EFL. Concentrat ation mg/kg (fresh weight) C DIMBA a b b Leaves N a b b Root BA MBA Leaves a C 3 a Root a N Cis-jasmone/EBV Untreated EBV Concentration mg/kg (fresh weight) MBA a a a Leaves a a a Roots Cis-jasmone/EBV Untreated EBV 3 C N

143 Extração em fase vapor Vacuum pump Flow meter N 2 flow 200 o C 70 o C ot plates

144 Ionização química Ionização química: um gás reagente é introduzido na fonte de íons em grande excesso. s elétrons emitidos da fonte de ionização chocam-se com a molécula do gás reagente, gerando íons desse gás e esses íons chocam com a molécula da amostra. Ionização branda Exemplo das reações com metano C 4 + e - > C e C C 4 > C C. 3 C AB > C 4 + [AB-] +. C. 3 + C 4 > C Gases usados para IQ Metano Isobutano Argônio Amônia C AB > [AB-C 2 5 ] +

145 Fontes de ionização para compostos não voláteis Ionização por electrospray

146 Espectro de massas por electrospray negativo do DIMBA 3 C N J. Mass Spectrom. 2003; 38:

147 Fragmentação do composto DIMBA por electrospray negativo.