ABX Pentra. HbA1c WB. Reagente para a dosagem in-vitro da Hemoglobina A1c (HbA1c). A11A01702
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- Samuel Carrilho Sales
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1 (Sangue total) Ref. : A11A01702 Volume R1 : Volume R2 : Volume R3 : 1 x 110 ml Volume R4 : 2 x 21 ml Volume R5 : 1 x 25 ml Reagente para a dosagem in-vitro da Hemoglobina A1c (HbA1c). ABX Pentra 2007/09/24 A93A01022J PT A11A01702 Sangue total Form-0846 Rev. 2 Interesse clínico (1,7): A HbA1c resulta da fixação não enzimática do fragmento N-terminal da cadeia β da hemoglobina A0. A taxa de HbA1c que é proporcional à taxa de glicose no sangue é o reflexo da concentração média diária de glicose durante os dois meses que precedem o levantamento. Estudos recentes demonstraram que a dosagem regular da HbA1c pode conduzir a modificações no tratamento da diabetes e a um melhor controlo metabólico, como o indica uma diminuição dos valores de HbA1c. Este método de diagnóstico in vitro é portanto utilizado para a medição quantitativa da Hemoglobina A1c (HbA1c), um indicador da diabetes no sangue humano. As medições obtidas por meio deste procedimento podem ser utilizadas para o controlo a longo prazo das pessoas diabéticas. Método A HbA1c é exprimida em percentagem do teor em hemoglobina total. Para determinar a concentração de THb por espectrofotometria, as diferentes formas de hemoglobina devem ser transformadas numa única forma com um espectro de absorção uniforme. Os valores de HbA1c e de hemoglobina total (THb) em μmol apresentados pelo teste de HbA1c são utilizados para o cálculo do coeficiente HbA1c/THb e não devem ser utilizados individualmente para o diagnóstico. Princípio (8): As concentrações de HbA1c e de hemoglobina total são medidas, o coeficiente é apresentado em percentagem de HbA1c. A determinação da HbA1c em percentagem implica a utilização de cinco reagentes: O Antibody Reagent (R1) diluído com Diluent I (R5), o Agglutinator Reagent (R2), o Hemolysis Reagent (R3) e o Total Hemoglobin Reagent (R4). A amostra de sangue total é misturada com Hemolysis Reagent (R3) pelo analisador: os glóbulos vermelhos são lisados e a cadeia de hemoglobina é hidrolisada por acção de uma protease presente no reagente. O reagente Total Hemoglobin Reagent (R4) é utilizado para a determinação da hemoglobina total. O método é baseado na transformação de todas as formas de hemoglobina em hematina alcalina numa solução alcalina de detergente não iónico como descrito no procedimento original de Wolf et al. A reacção é despoletada pela adição da amostra de sangue pré-tratado com Total Hemoglobin Reagent (R4) e é obtida uma coloração verde da solução. A transformação de todas as formas de hemoglobina em hematina alcalina, com um espectro de absorção definido, permite o cálculo da concentração de hemoglobina total. 1 x 110 ml 2 x 21 ml 1 x 25 ml HORIBA ABX BP Montpellier - cedex 4 - France O teor de hemoglobina é medido através de um método em ponto final a 600 nm. A concentração de hemoglobina é directamente proporcional ao aumento da DO observada. Para medir a HbA1c específica, utiliza-se um teste de inibição de aglutinação com látex. Um aglutinante (polímero sintético contendo múltiplas cópias da parte imunoreactiva de HbA1c) provoca a aglutinação das partículas de látex cobertas de anticorpos monoclonais de rato específicos da HbA1c. Na ausência de HbA1c na amostra, o aglutinante do Agglutinator Reagent (R2) e as micropartículas cobertas de anticorpos do Antibody Reagent (R1) irão aglutinar-se. Esta aglutinação causará um aumento da absorvância da suspensão. A presença de HbA1c na amostra irá diminuir a taxa de aglutinação pois a HbA1c entrará em competição com o Agglutinator Reagent (R2) ao nível dos locais de fixação do anticorpo das micropartículas. Quanto mais HbA1c houver na amostra, mais fraca será a taxa de aglutinação. A reacção é medida por absorvância a 600 nm e a taxa de aglutinação é utilizada para o cálculo da concentração a partir de uma curva de calibração. A percentagem de HbA1c é então calculada utilizando os valores de HbA1c e de Hemoglobina Total em μmol.
2 Reagentes O ABX Pentra é um kit multi-reagentes. Conteúdo do kit: Reagente 1: Antibody Reagent Reagente 2: Agglutinator Reagent Reagente 3: Hemolysis Reagent Reagente 4: Total Hemoglobin Reagent Reagente 5: Diluent I O Antibody Reagent (R1) contém: partículas associadas aos anticorpos de HbA1c (rato); Albumina de Soro Bovino; Tampão; Surfactantes, Conservantes. O Agglutinator Reagent (R2) contém: Hapteno de ligação covalente com o polímero; Albumina de Soro Bovino; Tampão; Conservante; Surfactante. O Hemolysis Reagent (R3) contém: Pepsina Suína; Tampão; Conservante. Este reagente também é vendido separadamente com o nº de referência A11A O Total Hemoglobin Reagent (R4) contém: Hidróxido de Sódio; Surfactante. O Diluent I (R5) Contém: Conservante; NaCl. 1 x 110 ml 2 x 21 ml 1 x 25 ml Sobre sangue total, as amostras, o calibrador e o controlo não necessitam de tratamento prévio. Aconselha-se a utilização de uma pipeta de deslocamento positivo para retirar o sangue total. Nota: É possível testar simultaneamente 5 espécimes. Se tiver que estar mais de 5 espécimes, aguarde que os instrumento volte ao status Analysing antes de colocar os espécimes seguintes depois da homogeneização. Calibrador Para a calibração, utilizar: ABX Pentra Cal, Ref. A11A01703 (não incluído) 1 x 8 ml + 5 x 2 ml A hemoglobina total está calibrada com o ABX Pentra Cal (CAL 1) com um valor alvo de hemoglobina total. Os calibradores e os reagentes não são dependentes do lote e são submetidos ao controlo de qualidade interno ABX. A calibração do método HbA1c é realizada utilizando o ABX Pentra Cal que contém seis níveis de calibrador HbA1c. Estes procedimentos de calibração são compatíveis com a norma de certificação NGSP/DCCT. Coloque os calibradores no rack amostra do calibrador: O ABX Pentra deve ser utilizado em conformidade com a presente nota. A HORIBA ABX não pode garantir os seus resultados se estas condições não forem respeitadas. Preparação Antibody Reagent (R1): 1. Misturar 3 volumes de Antibody Reagent (R1) com 2 volumes de Diluent I (R5) 2. Deixe a mistura estabilizar durante aproximadamente uma hora no compartimento refrigerado do ABX Pentra 400 antes de utilizar pela primeira vez. Todos os outros reagentes Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3), Total Hemoglobin Reagent (R4) são fornecidos sob a forma de soluções prontas a serem utilizadas. 1. Misturar cuidadosamente os reagentes rodando o frasco e, em seguida, deitá-los num copo de reagente. 2. Deixe os reagentes se estabilizarem no compartimento refrigerado do ABX Pentra 400 antes de utilizá-los. Ver o diagrama que se segue (o Sector A, B e C é tomado como um exemplo): Hemolysis Reagent Reagente 3 Total Hemoglobin Reagent Reagente 4 Agglutinator Reagent Reagente 2 Antibody Reagent Reagente 1 (diluído) 1. CAL 1 (200 μl) 2. água fisiológica 3. CAL 2 (150 μl) 4. CAL 3 (150 μl) 5. CAL 4 (150 μl) 6. CAL 5 (150 μl) 7. CAL 6 (150 μl) Nota: A posição do CAL 1 serve como exemplo; o CAL 1 também pode ser colocado na posição 8, 9 ou 10. Controlo Para controlo de qualidade interno, utilizar: ABX Pentra HbA1C WB Control, Ref. A11A01704 (não incluído) Controlo normal: 2 x 0,25 ml (liofolisado) Controlo patológico: 2 x 0,25 ml (liofolisado) Cada controlo deve ser testado diariamente e/ou após cada calibração. A frequência dos controlos e os intervalos de confiança devem adaptarse às exigências do laboratório e às directivas específicas do país em questão. Os resultados devem situar-se dentro dos limites de confiança definidos. Cada laboratório estabelecerá o procedimento a seguir se os resultados se situarem fora dos limites de confiança.
3 Materiais necessários mas não fornecidos Analisador de química clínica. Equipamento standard de laboratório. água fisiológica Amostra (9) Podem ser utilizadas com este método amostras de sangue venoso ou de sangue capilar. Os anticoagulantes permitidos são o ácido etilenodiaminotetracético de potássio (K2-EDTA) e a heparina de amónio (NH 4 -heparina). As amostras de sangue total retiradas sobre K 2 -EDTA e NH 4 -heparina podem ser conservadas a -70 C até seis meses, a 5 C até duas semanas ou a uma temperatura igual ou superior a 25 ºC até uma semana. As amostras congeladas devem ser descongeladas à temperatura ambiente e, seguidamente, misturadas minuciosamente antes da utilização. Misturar cuidadosamente as amostras de sangue precisamente antes da realização do teste, para garantir resultados exactos de THb. Valores normais (4,11,13,14) Cada laboratório deve verificar se os seus valores habituais são compatíveis com os valores das referências NGSP. Esta técnica tem a certificação NGSP para valores normais de HbA1c de 4-6% para os não diabéticos, sendo o objectivo terapêutico obter um valor < de 7% tal como recomenda a ADA (American Diabete Association). Todos os resultados do paciente deverão ser interpretados levando em consideração o conjunto dos exames clínicos do paciente. Limites do método (10): A maioria dos pacientes apresentam valores de hemoglobina compreendidos entre 4,4 mmol/l e 14,4 mmol/l. No entanto, publicações especializadas mostram que os pacientes que sofrem de anemias graves podem apresentar concentrações de hemoglobina inferiores a 4,4 mmol/l e que os pacientes que sofrem de policistemia podem apresentar concentrações de hemoglobina superiores a 14,4 mmol/l. Pacientes conhecidos por estes sintomas devem ser analisados com outro método se os seus valores de hemoglobina estiverem fora do intervalo de medição. Qualquer causa que afecte o tempo de vida dos glóbulos vermelhos (como a anemia hemolítica ou outras afecções hemolíticas, a gravidez ou uma perda significativa de sangue...) provocará uma diminuição da exposição destas células à glicose e, por consequência, uma baixa dos valores de hemoglobina glicosada em % (Ghb). Os resultados em % de Ghb não são fiáveis para os pacientes afectados por perdas de sangue crónicas e consequentemente pelos tempos de vida variáveis dos eritrócitos. As amostras contendo as formas C e S da hemoglobina, logo que são tratadas com este método, podem conduzir a um aumento (até 40%) do valor esperado em HbA1c. As amostras contendo quantidades importantes de hemoglobina F (mais de 10%) podem dar um resultado de Hba1c inferior ao que é esperado com este método. Em conclusão, os resultados de hemoglobina A1c obtidos com este teste para amostras de sangue contendo formas S, C e F (mais de 10%) não devem ser comparados aos valores normais ou anormais publicados. Foi demonstrado que uma amostra contendo hemoglobina E não interfere na medição de HbA1c por este método. A interferência das hemoglobinas carbamiladas e acetiladas não foi estudada para este reagente. A fracção lábil da hemoglobina glicosada (local de fixação Schiff da glicose à hemoglobina A ou A1c) não afecta os resultados porque o anticorpo é específico da cetoamina estável. Conservação e estabilidade Proteger do calor intenso, da luz ou do gelo. Estabilidade dos reagentes (fechados e após abertura): Os reagentes mantêm-se estáveis até à data de validade indicada no rótulo se forem conservados entre 2 e 8 C nas suas embalagens de origem, e ao abrigo de qualquer tipo de contaminação. Procedimentos As instruções de teste referentes a outros equipamentos diferentes do ABX Pentra 400 encontram-se disponíveis a pedido. Gestão de resíduos Consultar a legislação local em vigor. Precauções Gerais 1. Reagente de diagnóstico in-vitro, exclusivamente para uso profissional. 2. Antibody Reagent (R1): Para a preparação deste produto foram utilizados componentes de origem humana. Cada unidade de dador foi testada quanto ao antigénio de superfície da Hepatite B (HBsAg), anticorpos da Hepatite C (HCV) e Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-1 e HIV-2); esta pesquisa conduziu a resultados negativos (sem reactividade repetida). Atenção: Uma vez que nenhum teste pode garantir totalmente a ausência de HIV, do vírus da hepatite B ou C ou de outros agentes infecciosos, estes produtos deverão ser manipulados como amostras de sangue humano potencialmente infecciosas. Em caso de exposição, seguir as directivas da autoridade competente em matéria de Saúde. Irritante. S24: Evitar o contacto com a pele. S37: Usar luvas adequadas. R43: Pode causar irritação por contacto com a pele.
4 3. Agglutinator Reagent (R2): Irritante. S24: Evitar o contacto com a pele. S37: Usar luvas adequadas. R43: Pode causar irritação por contacto com a pele. 4. Antibody Reagent (R1), Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3) e Total Hemoglobin Reagent (R4): Evitar o contacto com os olhos, a pele e o vestuário. Após manipulação do produto, lavar as mãos cuidadosamente com água. Evitar a ingestão. 5. Diluent I (R5): Irritante. R36/38: Irritante para os olhos e pele. R43: Pode causar irritação por contacto com a pele. 6. Os frascos dos reagentes devem ser descartados após a utilização. 7. Consulte a MSDS relativa ao reagente. Desempenho do ABX Pentra 400 a Os desempenhos abaixo descriminados foram obtidos no analisador ABX Pentra 400. Número de testes: 345 testes Estabilidade da solução de látex reconstituída: A estabilidade da solução de látex reconstituída é de 2 meses se conservada entre 2 e 8 C após a reconstituição. Não utilizar senão a quantidade necessária e colocar imediatamente os reagentes no frio após a utilização. Volume de amostra tomado: 5,88 μl/teste de sangue total Volume da amostra (após tratamento): Hb: 25 μl/teste HbA1c: 2,5 μl/teste Limite de detecção: O limite de detecção, determinado em conformidade com as recomendações do protocolo CLSI (NCCLS), EP17-A (19), é de: para a Hemoglobina total: 78,5 μmol/l para a HbA1c: 20,91 μmol/l Exactidão e precisão: Repetibilidade (dentro do mesmo ciclo) 3 amostras de concentrações baixa, média e alta e 2 controlos foram testados 20 vezes em conformidade com as recomendações do protocolo Valtec (15). Média % % CV Controlo normal 4,39 2,83 Controlo patológico 10,45 1,96 Amostra 1 3,65 2,84 Amostra 2 7,93 2,98 Amostra 3 11,23 3,57 Reprodutibilidade (precisão ciclo a ciclo) 3 amostras de nível baixo, médio e alto e 2 controlos foram duplamente doseados durante 20 dias (2 séries por dia) de acordo com as recomendações do protocolo CLSI (NCCLS), EP5-A (16). Média % % CV Controlo normal 5,36 1,29 Controlo patológico 11,14 1,99 Amostra 1 5,21 2,49 Amostra 2 8,10 3,71 Amostra 3 11,76 2,63 Linearidade e intervalo de medição: A linearidade do reagente é determinada seguindo as recomendações do protocolo CLSI (NCCLS), EP6-A (17). Linearidade baixa: para a Hemoglobina total: 408 μmol/l para a HbA1c: 30,6 μmol/l Linearidade elevada: para a Hemoglobina total: 3676 μmol/l para a HbA1c: 550,8 μmol/l Nota: Se a concentração de HbA1c for superior à do calibrador mais alto (10,80 μmol/l, 550,8 μmol/l no método automático), não dilua a amostra. Calcule o valor máximo possível de acordo com a concentração de HbT e dê como valor superior a.... Exemplo: Se a concentração de HbT determinada pelo instrumento for de 2754 μmol/l, calcule o valor: 550,8/2754 x 100 = 20,00% de HbA1c. O resultado é: superior a 20,00% de HbA1c. Correlação: 125 amostras de pacientes foram doseadas comparativamente a um reagente comercializado tomado como referência, seguindo as recomendações do protocolo CLSI (NCCLS), EP9-A2 (18). A equação da linha alométrica obtida foi: Y = 1,04 x + 0,82 com um coeficiente de correlação r 2 = 0,965. Interferências: Triglicéridos: Não há interferência significativa até uma concentração de 7 mmol/l Bilirrubina total: Não há interferência significativa até uma concentração de 500 μmol/l Bilirrubina directa:não há interferência significativa até uma concentração de 500 μmol/l Estabilidade da calibração: O reagente é calibrado a J0. A estabilidade da calibração é verificada testando 2 controlos. A estabilidade da calibração é de 3 semanas. Nota: Recomenda-se efectuar uma nova calibração quando os resultados do(s) controlo(s) de qualidade ficarem fora do intervalo estabelecido, em caso de mudança da solução de látex e após cada substituição de lote de reagente. a. Modificação do Índice I para J : nova desempenho do ABX Pentra 400.
5 Razão NGSP: Y = (100*56 X + 188)/100 Nota: X = HbA1c/HbT. Instruções do teste para ensaio de HbA1c (A1c-WB): 5.xx Instruções do teste para ensaio de hemoglobina total (THb-WB): 6.xx Aviso É da responsabilidade dos utilizadores verificar se este documento é aplicável ao reagente utilizado. Bibliografia 1. Mayer TK and Freedman ZR: Protein glycosylation in diabetes mellitus: A review of laboratory measurements and of their clinical utility. Clin. Chim. Acta 127; (1983). 2. Baynes JW.Bunn HF, Goldstein DE, et al : National Diabetes Group; Report of the expert committee on glucosylated hemoglobin. Diabetes Care 7; (1984). 3. Koenig RJ, Peterson CM, Kilo C. et al: Hemoglobin A1c as an indicator of the degree of glucose intolerance in diabetes. Diabetes 25; (1976). 4. Nathan DM, Singer DE, Hurxthal K, and Goodson JD: The clinical information value of the glycosylated hemoglobin assay. NE J. Med. 310; (1984). 5. McCarren M: DCCT; and it works: Intensive therapy reduces the risk of diabetic eye, kidney, and nerve disease. Diabetes forecast (September 1993). 6. Larsen ML, Horder M, and Mogensen EF: Effect of long-term monitoring of glycosylated hemoglobin levels in insulindependent diabetes mellitus. NE. J. Med. 323; (1990). 7. Nathan DM: Hemoglobin A 1c. Infatuation or the real thing? NE. J. Med. 323; (1990). 8. Wolf HU, Lang W, and Zander R; Alkaline haematin D-575, a new tool for the determination of haemoglobin as an alternative to the cyanhaemoglobin method. Clin. Chim. Acta. 136; (1984). 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Skin Puncturethird edition; approved standard. NCCLS publication H4-A3. Villanova, PA: NCCLS; Knowles BJ, Haigh WB, and Michaud GC: A monoclonal antibodybased immunoassay for hemoglobin A 1c. Diabetes 35; Supplement: 94A (1986). 11. Goldstein DE, Little RR, Wiedmayer HM, et al: Glycated hemoglobin: Methodologies and clinical applications Clin. Chem. 32; (1986). 12. Ellis G. Diamandis EP, Giesbrecht EE, et al. An automated «high pressure» liquid chromatographic assay for hemoglobin A 1c. Clin. Chem. 30: (1984). 13. Burtis CA and Ashwood ER, eds: Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2 nd edition, WB Saunders Company, Philadelphia, PA. p.2021 (1994). 14. Diabetes Care 2002; 25 (suppl. 1); Vassault A., Grafmeyer D. Naudin C. et al., Protocole de validation de techniques (document B), Ann. Biol. Clin., 1986, 44, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices, Approved Guideline, CLSI (NCCLS) document EP5-A, Vol. 19, No. 2, february Evaluation of the Linearity of Quantitative Analytical Methods, Approved Guideline, CLSI (NCCLS) document EP6-A, Vol. 23, No. 16, april Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples, Approved Guideline, 2 nd ed., CLSI (NCCLS) document EP9-A2, Vol. 22, No. 19, Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation, Approved Guideline, CLSI (NCCLS) document EP17-A, Vol. 24, No. 34, 2004.
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ABX Pentra. HbA1c WB. Reagente para a determinação quantitativa in-vitro da Hemoglobina A1c (HbA1c). A11A01702
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