SEQUENCIAMENTO DE UM SEGMENTO DE ÍNTRON AINDA NÃO DESCRITO DO GENE DO RECEPTOR DA LEPTINA EM SUÍNOS

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1 SEQUENCIAMENTO DE UM SEGMENTO DE ÍNTRON AINDA NÃO DESCRITO DO GENE DO RECEPTOR DA LEPTINA EM SUÍNOS MARIA AMÉLIA M. SOARES 1, RICARDO F. EUCLYDES 2, SIMONE E. F. GUIMARÃES 2, MARTA F. MARTINS 3, DANIELLE A. FARIA4, JANE O. PEIXOTO 4, PAULO S. LOPES. 2 1 Professora da Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOESTE). Bolsista da CAPES 2 Professor(a) da Universidade Federal de Viçosa (UFV). 3 Responsável Técnico do Laboratório de Análises Genéticas BIOAGRO/UFV. 4 Bolsista de iniciação científica FAPEMIG RESUMO: Este trabalho teve como objetivo seqüenciar uma região de ìntron ainda não descrita do gene que codifica o receptor da leptina de suínos. Os primers utilizados para este propósito, foram desenhados a partir de seqüências parciais disponíveis no GenBank, (números de acesso AJ e AJ223163). O DNA foi extraído de células sanguíneas brancas de três suínos da raça nativa Piau. Fragmentos com aproximadamente pares de bases (pb) foram gerados por amplificação da Reação em Cadeia pala Polimerase (PCR). Após purificação, os fragmentos foram seqüenciados em seqüenciador automático. A primeira seqüência determinada constou de aproximadamente 500 pb e foi utilizada para desenhar um primer, possibilitando a geração de um fragmento de aproximadamente pb, cujo sequenciamento resultou na determinação de mais 720 pb. Os sequenciamentos produzidos com o primer reverso não geraram bons resultados. Da seqüência total determinada de bases, 986 ainda não havia sido descrita anteriormente. Assim, esta seqüência foi recentemente enviada para o GenBank (nº de acesso AY079083), e aguarda liberação. Embora a literatura tenha mostrado que mutações neste gene em camundongos e humano resultem em profundos efeitos no metabolismo energético, sua estrutura e função em animais domésticos ainda permanecem pouco conhecidas. A estratégia montada neste experimento para seqüenciar uma região de íntron pode ser facilmente aplicada, caso o fragmento não seja demasiadamente longo. PALAVRAS-CHAVE: Metabolismo necessário energético, Receptor da leptina, Suínos SEQUENCING OF A SEGMENT OF ÍNTRON, YET NOT DESCRIBED, OF RECEPTOR LEPTIN GENE IN SWINE ABSTRACT: The research objetive was sequencing a region of intron yet not described of the receptor leptin gene in swine. Primers used to this proposition were designed from partial sequences available in the GenBank, (Access number AJ and AJ223163). DNA was extracted from white blood cells in three swines of the Piau breed. Fragments with nearly 2,000 bases pairs (bp) were generate by amplification of Polymerase Chain Reaction (PCR). After purification, fragments were sequenced in automatic sequencer. The first determined sequence was nearly 500 bp and was used to design a primer enabling the generation of a fragment of nearly 1,500 bp, whose sequencing resulted in the determination of more 720 bp. The sequencing created with the use of a reverse primer did not generate good results. From the total sequence determined of 1,250 bp, it was observed that 986 bases had not being described before. The cited sequence has been recently sent to the GenBank (access number AY079083) and awaits for liberation. Although the current literature has shown that mutations in this gene in mice and humans brings profound effects in the energetic metabolism, its structure and function in domestic animals still remains unclear. The approach used in this experiment for sequencing in an intron region can be easily applied, in case the fragment is not too long. KEYWORDS: Energetic metabolism, Leptin receptor, Swine.

2 INTRODUÇÃO A leptina é um hormônio expresso pelos adipócitos (ZHANG et al., 1994) e por intermédio de seu receptor, apresenta importante função na regulação do consumo alimentar, gasto de energia e adiposidade (HALLAS et al., 1995; PELLEYMOUNTER et al., 1995). Devido à ocorrência splicing alternativo do RNA mensageiro (mrna), o receptor da leptina existe em diferentes isoformas, variando em seu domínio intracelular (TARTAGLIA, et al., 1995; LEE, et al., 1996). Somente a forma longa do receptor apresenta a capacidade de ativar as proteínas transdutoras de sinal e ativadoras de transcrição (STATs). Esta isoforma é amplamente encontrada em regiões do hipotálamo (GHILARDI et al., 1996). Entre as outras isoformas, uma apresenta um curto domínio intracelular e é expresso em altos níveis no plexo coróide, pulmão, rim e em muitos outros tecidos (TARTAGLIA, et al., 1995; GHILARDI et al., 1996). A primeira verificação de alteração no gene do receptor da leptina foi a ocorrência de um splicing anormal do mrna em camundongos, os quais desenvolveram obesidade mórbida (TARTAGLIA et al, 1995). Outros relatos, tanto em camundongos quanto em humano, mostraram que mutações neste gene, além do fenótipo obeso, podem causar deficiência na secreção de importantes hormônios como os reprodutivos e de crescimento (PHILLIPS et al., 1996; CLÉMENT et al., 1998). Poucos são os estudos sobre polimorfismo do gene do receptor da leptina em espécies de animais domésticos o qual, pode estar influenciando características produtivas e reprodutivas. Assim, o objetivo deste trabalho foi o de gerar uma nova seqüência de íntron deste gene, visto que em suínos ele não foi totalmente seqüenciado. Os íntrons são importantes fontes de polimorfismos moleculares devido à menor pressão evolutiva. MATERIAL E MÉTODOS Para a construção dos primers foram utilizadas duas seqüências parciais do gene do receptor da leptina de suíno, disponíveis no GenBank sob os números de acesso AJ223162, AJ Estes dois fragmentos foram selecionados por estarem supostamente mais próximos um do outro (Figura 1). As demais seqüências parciais disponíveis, por comparação com o cdna em humanos, foram consideradas muito distantes. Para amplificar a região de interesse (íntron), foi utilizado o primer direto do fragmento 1 (5 ATTCCAAGCATTAGCTGTTAC3 ) e o primer reverso do fragmento 2 (5 GCTCTAACTGGTAGTGCGTG3 ). Um terceiro primer foi desenhado posteriormente para auxiliar a concluir o seqüenciamento (5 ATCAGAGACAGTTGACTTGCCG3 ). Para a obtenção de DNA, foram coletados 10 ml de sangue de três suínos da raça nativa Piau. A extração de DNA foi realizada por purificação com Fenol:Clorofórmio, após tratamento com proteinase K (SAMBROOK et al., 1989). A amplificação do fragmento foi conduzida em um volume final de 20 ml contendo 4,0 pmoles de cada primer, 0,2 mm de cada desoxirribonucleotídeo (dntp), 2,0 mm de MgCl2, 50 mm de KCl, 20 mm de Tris-HCl, 1 unidade de Taq DNA Polimerase e 25 ng de DNA. O programa consistiu de um passo inicial de desnaturação a 94ºC por 5 minutos, 35 ciclos de amplificação, compreendendo desnaturação das fitas a 94ºC por 1 minuto, anelamento dos primers a 60ºC por 1 minuto e extensão do fragmento a 72ºC por 1 minuto. Ao final, seguiu-se mais um passo de extensão por 5 minutos a 72ºC. Os fragmentos amplificados foram purificados com o uso do kit Binding Solution (GlassMax DNA Isolation Matrix System Life Technologies). As reações de seqüenciamento foram baseadas na técnica de terminação de cadeia por dideoxinucleotídios (ddntps), descrita por SANGER et al. (1977), utilizando-se o ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, (PE Applied Biosystems). Para isso, 200 ng do DNA foram empregados em uma reação contendo 4 ml de mix, fornecido no kit de sequenciamento, 5,0 pmoles do primer direto e 6 ml de tampão (200 mm Tris-HCl ph 9,0; 5 mm MgCl2) em um volume total de 20 ml. Preparou-se um mix semelhante para o primer reverso. O programa de seqüenciamento consistiu de um passo inicial de desnaturação a 96ºC por 30 segundos, 59ºC por 14 segundos (anelamento) e 60ºC por 4 minutos (extensão), em um total de 25 ciclos. Os produtos da extensão foram separados por eletroforese capilar em seqüenciador

3 automático ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems). Os dados foram automaticamente convertidos em seqüências de deoxinucleotídios. RESULTADOS E DISCUSSÃO A reação de amplificação utilizando o primer direto do fragmento 1 e o primer reverso do fragmento 2 originou um segmento de DNA de aproximadamente pares de bases (pb), o qual foi detectado em gel de poliacrilamida a 5%. O seqüenciamento automático deste fragmento, utilizando o primer direto, propiciou identificar aproximadamente 500 pb. A seqüência gerada pelo primer reverso não apresentou bom resultado. A extremidade final deste fragmento de 500 pb foi utilizada para desenhar mais um primer (5 ATCAGAGACAGTTGACTTGCCG3 ), o qual, em conjunto com o primer reverso, produziram um novo fragmento com aproximadamente pb, observado em gel de poliacrilamida. Este fragmento foi também submetido à reação de sequenciamento, permitindo determinar a seqüência de mais 720 pb. A sobreposição dos dois fragmentos, o de 500 pb com o de 720 pb, resultou em uma seqüência total de pb (Figura 2). Os resultados gerados com o primer reverso continuaram sendo de má qualidade, não sendo possível determinar a seqüência de bases da outra extremidade (fragmento 2). Embora amostras de DNA de três animais tenham sido inicialmente utilizadas para seqüenciar este fragmento, a superposição das mesmas não permitiu que uma seqüência consenso fosse obtida. Isto ocorreu pelo fato das que os três fragmentos apresentaram algumas variações nas seqüências de nucleotídeos. Assim, o fragmento mostrado acima corresponde à seqüência de apenas um animal. Esta seqüência foi depositada recentemente no banco de dados genéticos, o GenBank ( com o nº de acesso AY e aguarda liberação para ser utilizada pelos usuários. Além dos fragmentos já mencionados, outras seqüências parciais do gene do receptor da leptina de suínos já foram depositadas no GenBank (AF036908, AH009271, AF184172, AF e AF167719). RUIZ-CORTES et al. (2000) seqüenciaram o RNA mensageiro da isoforma longa do gene do receptor da leptina em suínos e constitui a mais recente e completa seqüência já publicada. Entretanto, a seqüência completa ainda não é conhecida. CONCLUSÕES A determinação dos pares de bases de íntrons a partir de extremidades de exons adjacentes, cujas seqüências já estão disponíveis, pode auxiliar na elucidação da seqüência completa de genes de interesse na produção de animais domésticos e na saúde humana. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CLÉMENT, K., VAISSE, C., LAHLOUS, N., CABROL, S., PELLOUX, V., CASSUTO, D., GOURMELEN, M., DINA, C., CHAMBAZ, J., LACORTE, J.M., BASDEVANT, A., BOUGNÀRES, P., LEBOUC, Y., FROGUEL, P., GUY-GRAND, B. A mutation in the human leptin receptor gene cause obesity and pituitary dysfunction. Nature, v.392, p , 1998 GHILARDI, N., ZIEGLER, S., WIESTNER, A., STOFFEL, R., HEIM, M.H., SKODA, C.. Defective STAT signaling by the leptin receptor in diabetic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.93, p , HALAAS, J.L., GAJIWALA, K.S., MAFFEI, M., COHEN, S.L., CHAIT, B.T., RABINOWITZ, D., LALLONE, R.L., BURLEY, S.K., FRIEDMAN, J.M.. Weight-reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene. Science, v.269, p , 1995 LEE, G.H., PROENÇA, R., MONTEZ, J.M., CARROLL, K.M., DARVISH-ZADEH, J.G., LEE, J.I., FRIEDMAN.J.M.. Abnormal splicing of the leptin receptor in diabetic mice. Nature, v.379, p , PELLEYMOUNTER, M.A., CULLEN, M.J., BAKER, M.B., HECHT, R., WINTERS, D., BOONE, T., COLLINS, F.. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science, v.269, p , 1995.

4 PHILLIPS, M.S., LIU, Q., HAMMOND, H.A., DUGAN, V., EY, P.J., CASKEY, C.T., HESS, J.F. [Leptin receptor missense mutation in the fatty Zucker rat. Nature genetica, v. 13, p RUIZ-CORTEZ, Z.T., MEN, T., PALIN, M.F., DOWNEY, B.R., LACROIX, D.A., MURPHY, B.D. Porcine leptin receptor: molecular structure and expression in the ovary. Mol. Reprod. Dev., v.56, n.4, p , 2000 SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F., MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2.ed. New York: Cold Spring Habor Laboratory, p] SANGER, F., NICKLEN, S., COULSON, A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.74, n.12, p , 197 TARTAGLIA, L.A., DEMBSKI, M., WENG, X., DENG, N., CULPEPPER, J., DEVOS, R., RICHARDS, G.J., CAMPFIELD, L.A., CLARK, F.T., DEEDS, J., MUIR, C., SANKER, S., MORIARTY, A., MOORE, K.J., SMUTKO, J.S., MAYS, E.A., WOOLF, E.A., MONROE, C.A., TEPPER, R.I. Identification and expression cloning of a leptin receptor, OB-R. Cell, v.83, p , 1995 ZHANG, Y., PROENÇA, R., MAFFEI, M., BARONE, M., LEOPOLD, L., FRIEDMAN, J.M. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature, v. 372, p , 1994 exon 4 íntron exon Figura 1 - Representação esquemática da localização dos fragmentos (1 e 2) utilizados para o seqüenciamento da região de íntron do gene do receptor da leptina. A linha inferior tracejada representa a região seqüenciada, ainda não descrita.

5 FIGURA 2- Seqüência de nucleotídeos gerada pelo seqüenciamento automático parcial do intron posicionado entre os exons 4 e 5 do gene do receptor da leptina de suíno. A região sublinhada (986 pb) não havia sido descrita anteriormente.