COLABORADOR(ES): ACÁCIO ANTONIO PIGOSO, AMANDA PARALUPPI BUENO, TIAGO GODOY GASPAROTTO

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1 Anais do Conic-Semesp. Volume 1, Faculdade Anhanguera de Campinas - Unidade 3. ISSN TÍTULO: LASER DE BAIXA INTENSIDADE E A RELAÇÃO COM STRESS OXIDATIVO NA OSTEOPOROSE INDUZIDA CATEGORIA: CONCLUÍDO ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: BIOMEDICINA INSTITUIÇÃO: CENTRO UNIVERSITÁRIO HERMINIO OMETTO DE ARARAS AUTOR(ES): MARCELA CRIVELARO FERNANDES ORIENTADOR(ES): FERNANDO RUSSO COSTA DO BOMFIM COLABORADOR(ES): ACÁCIO ANTONIO PIGOSO, AMANDA PARALUPPI BUENO, TIAGO GODOY GASPAROTTO

2 1) RESUMO: A osteoporose é um distúrbio na remodelação óssea, caracteri zado por perda de massa óssea. Estudos buscam entendimento da relação entre a doença e a luz laser, uma vez que a laserterapia tem a capacidade de reduzir o tempo de reparação óssea. Contudo estudos mostram que o laser influência parâmetros de stress oxidativo como a alteração da atividade das enzimas antioxidantes e a produção de espécies reativas de oxigênio. Também há um aumento na produção de ânion superóxido. A produção em excesso dessas espécies pode acarretar danos nos constituintes celulares, porém há muitos resultados controversos sobre esses parâmetros de stress oxidativo desencadeado pelo laser. Objetivo: Avaliar os parâmetros de stress oxidativo em Ratos Wistar fêmeas após indução de osteoporose com dexametasona e tratados com laser de baixa intensidade. Trinta ratos foram divididos em três grupos; GC (controle) GI (induzido) e GT (induzido e tratado). A indução foi realizada com aplicação de dexametasona com concentração de 7mg/kg semanalmente por cinco semanas. 7, 14 e 21 dias após o laser os animais foram eutanasiados, retirada por punção cardíaca amostras para dosagem em soro assim como alíquotas do fígado para dosagem pelo método de TBARS. Os resultados obtidos em dosagem no fígado demonstram que o laser potencializou o stress oxidativo causado pelo dexametasona, e em soro o tratamento com laser não causou prejuízos sistêmicos em relação à lipoperoxidação lipídica. 2) INTRODUÇÃO A osteoporose é um distúrbio caracterizado pela redução da densidade mineral óssea, deterioração da microarquitetura óssea e aumento da fragilidade esquelética e do risco de fraturas (MENEZES, CHAVES, FARIAS; 2008), e se desenvolve como decorrência de uma desordem do processo de remodelação óssea, o qual é sofrido continuadamente pelo osso cortical (compacto) e trabecular (esponjoso) (RADOMINSKI et.al; 2004). Fatores ambientais também estão associados à perda de massa óssea, como o tabagismo, sedentarismo, hábitos nutricionais, drogas, álcool, cafeína, medicamentos (corticóides) entre outras doenças (RUSSO, 2001;PAIVA, et.al; 2003; RADOMINSKI, et.al.; 2004). Alguns fármacos, como por exemplo os corticoides, podem ter efeitos sobre a produção de espécies reativas de oxigênio. É importante atender a que todos os fármacos podem não só gerar efeitos benéficos, como também lesivos, e podem ou

3 não ter uma relação com a ação farmacológica para o qual foi destinado o fármaco (RANG, et.al; 2008). O stress oxidativo pode ser definido como um desequilíbrio entre os sistemas oxidantes e antioxidantes em favor dos oxidantes. São geradas inúmeras espécies reativas: os radicais livres (têm um elétron desemparelhado na sua camada eletrônica) e as espécies reativas não radicais, favorecendo a ocorrência de danos oxidativos, estes que causam uma oxidação de biomoléculas, especialmente, lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, induzindo efeitos deletérios e alterando-as em relação a sua estrutura e/ou função biológica (BARBOSA, et.al; 2008; SILVEIRA, et al; 2009; BARBOSA, et.al.; 2010). As espécies reativas podem ser medidas diretamente, por meio de sua concentração em fluidos biológicos e tecidos, ou indiretamente, mediante a avaliação do dano que causam. Uma das formas de se avaliar o stress oxidativo é medir os níveis de lipoperoxidação através da técnica de TBARS. A lipoperoxidação caracteriza-se por aumento na produção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e malondialdeído (MDA) em consequência do ataque das espécies reativas de oxigênio às membranas celulares, provocando perda de seletividade na troca iônica e liberação do conteúdo de organelas, como as enzimas hidrolíticas dos lisossomos, e formação de produtos citotóxicos, culminando com a morte celular (SILVA, et.al; 2009; BARBOSA, et.al; 2008). Hoje em dia existem inúmeros tratamentos para osteoporose, como a reposição hormonal, associada à ingestão adequada de cálcio e exercício físico, os bisfofanatos (cálcio e vitamina D), a calcitonina.entre outros recursos ainda pouco estudados como o laser, ultra-som e o LED (LEITE, 1999; RUSSO, 2001). O laser é uma fonte de radiação não ionizante, altamente concentrada, que em contato com diferentes tecidos resulta, de acordo com o tipo de radiação, em efeitos térmicos, fotoquímicos. A radiação laser pode ser classificada de acordo com a potência de emissão em: laser de alta intensidade ou laser cirúrgico; laser de baixa intensidade ou laser não cirúrgico que são sistemas que emitem radiações de baixa potência, sem poder destrutivo e que possuem ações fotoquímica e fotobiológica, como analgésica, antiinflamatória e de bioestimulação, e podem atuar na reparação de tecidos nervoso, muscular, ósseo, epitelial e muitas outras estruturas (ABREU, FAGUNDES; 2001; PINHEIRO; et.al; 2005; PETRI, 2008).

4 O laser de baixa intensidade como tecnologia terapêutica tem apresentado um crescimento significativo, por suas propriedades curativas e pela segurança do tratamento, e esse vem sendo usado para acelerar a reparação óssea e isso tem sido atribuído ao fato de que a terapia com laser aumenta a quantidade de cálcio, fósforo, e colágeno do osso neoformado e também acelera a revascularização da região afetada promovendo assim a formação e maturação óssea (PETRI, 2008; SILVEIRA, et.al.; 2009). Entretanto, alguns mecanismos envolvidos nessa resposta ainda permanecem obscuros, principalmente no que se refere aos efeitos do laser sobre a cadeia respiratória mitocondrial e sobre os biomarcadores de estresse oxidativo. Os danos no mecanismo celular e sua influência nos parâmetros oxidativos não estão bem compreendidos assim como a relação do laser de baixa intensidade no aumento e/ou redução do strees oxidativo. 3) OBJETIVO Avaliar os parâmetros de stress oxidativo em Ratos Wistar fêmeas após indução de osteoporose com dexametasona e tratados com laser de baixa intensidade. 4) METODOLOGIA E DESENVOLVIMENTO 4.1) Animais e indução da Osteoporose Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética da Fundação Hermínio Ometto UNIARARAS, parecer número 102/2011. Foram utilizados 45 Ratos Novergiccus albinus Wistar fêmeas jovens pesando aproximadamente 200g ± 10 g distribuídos em três grupos: GC (Grupo Controle; n=15), GI (Grupo induzido com Osteoporose; n=15) e GT (Grupo induzido com Osteoporose tratado com laserterapia; n=15). Os animais foram mantidos no Biotério do Centro Universitário Hermínio Ometto UNIARARAS durante toda a fase experimental com ciclos claro/escuro (12 horas cada), temperatura controlada com água e ração a vontade. Os grupos 2 e 3, no tempo zero, foram submetidos a aplicação intramuscular 7mg/kg de dexametasona (Azium Solução -Schering-Plough S/A), uma vez por semana durante 5 semanas, para a indução da osteoporose (PINTO, et al 2006). Enquanto o

5 Grupo 1 foi submetido a aplicações intramuscular de solução de NaCl 0,9% seguindo o mesmo protocolo já descrito para os Grupos 2 e ) Laserterapia Após a indução, o G3 recebeu aplicações por ponto na pata direita na região medial do fêmur com laser de baixa intensidade com comprimento de onda de 830nm e intensidade de 2J/cm 2 diariamente durante 3 semanas enquanto os animais do Grupo 2 terão sessões com o laser desligado. 4.3) Eutanásia dos animais As coletas das amostras foram realizadas nos tempos 7, 14, 21 depois do início do tratamento. Com uma combinação de Ketamina 10% (anestésico) e 0,1 ml de Xilazina 2% (relaxante muscular) por via intraperitoneal os animais foram anestesiados. Foi realizada punção cardíaca para obtenção do sangue total destes animais levando-os a morte. Foi obtido o soro para dosagem dos níveis de TBARS. 4.4)Determinação dos níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) A determinação de TBARS é usada como um índice da extensão da lipoperoxidação, causada pelo ataque de espécies reativas às membranas biológicas. O nível de lipoperoxidação hepática e sistêmica (através do soro) foi avaliado misturando-se 5 mg de proteína do homogenato de fígado, ou 200 µl de Soro, com um meio contendo TBA 1% (preparado em NaOH 50 mm) e 500 µl de H 3 PO 4 20%. Essa mistura reacional foi aquecida 20 minutos em banho fervente. Depois de resfriada, adiciona-se 3 ml de n-butanol para extrair o cromógeno. Após centrifugar por 3 minutos, a 3000 rpm, para separar a fase orgânica (com cromógeno), lendo-se a absorbância em 532 nm. A concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs) foi calculada baseando-se no valor de l 532nm = M -1 cm -1 (BUEGE; AUST, 1978). 5) RESULTADOS Através dos testes realizados pela metodologia TBARS, para dosagem da lipoperoxidação no fígado, obtivemos resultados mostrando que no grupo tratado por

6 7 dias, tomando por base o grupo controle, o fármaco dexametasona causou um aumento significativo (p<0,05) de stress oxidativo, e com a aplicação do laser esse efeito foi potencializado (p<0,05). O mesmo aconteceu no fígado dos ratos tratados por 14 dias, onde se pode observar um aumento do stress oxidativo em ratos que foram tratados com dexametasona e laser. Já no último grupo tratado por 21 dias os níveis de TBARS entre os grupo induzido e o induzido tratado com laser ficaram próximos aos níveis dos grupos controle, isso provavelmente se dá por um possível mecanismo de compensação do sistema antioxidante (Gráfico 1). Gráfico 1- Análise de TBARS em fígado de ratos dos grupos controle, induzido com dexametasona e induzido com dexametasona e tratado com laser onde observa-se um aumento nos níveis de strees oxidativo entre os animais nos tempos 7 e 14 dias em relação ao grupo controle. Nota-se aos 21 dias um equilíbrio no sistema oxidante entre os grupos. Observando o gráfico 2, pode-se observar que nos grupos tratados por 7 e 14 dias não houve um efeito sistêmico em relação ao stress oxidativo, e os níveis se mantiveram praticamente estáveis se comparados ao grupo controle ou se já entende-se que o efeito da dexametasona é local, pois foi aplicado na pata do rato,e posteriormente metabolizado pelo fígado, causando o aumento de stress oxidativo conforme descrito no gráfico 1. Já no grupo tratado em 21 dias, houve um aumento significativo de stress oxidativo em ratos tratados com laser e dexametasona,

7 supondo-se que um tratamento em tempo prolongando com laser, pode gerar danos oxidativos significativos de maneira sistêmica. Gráfico 2. Análise de TBARS em soro de ratos dos grupos controle, induzido com dexametasona e induzido com dexametasona e tratado com laser onde observa-se um aumento nos níveis de strees oxidativo entre os animais nos tempos 7, 14 e 21 dias em relação ao grupo controle. Nota-se que os animais tratados com laser possuem níveis acima dos outros grupos em todos os períodos. 6) CONSIDERAÇÕES FINAIS A irradiação do laser de baixa intensidade potencializou o stress oxidativo quando associado à dexametasona, gerando assim uma maior lipoperoxidação nas células dos grupos tratados com laser e fármaco. Pode-se estabelecer uma relação entre dose e tempo de tratamento, para que esse stress oxidativo não seja tão agressivo, sendo assim necessários estudos minuciosos com maior tempo de tratamento para esclarecer melhor as vantagens e desvantagens dessa terapia laser de baixa intensidade e os mecanismos celulares envolvidos no stress oxidativo.

8 7) FONTES CONSULTADAS BARBOSA, K.B.F; COSTA, N.M.B.; ALFENAS, R.C.G; PAULA, S.O; MININ, V.P.R; BRESSAN, J.- Estresse oxidativo: avaliação de marcadores- Nutrire: revista da sociedade Brasileira de Alimentação e Nutrição; São Paulo; vol. 33, n. 2; p ; ago; BARBOSA, K.B.F; COSTA, N.M.B.; ALFENAS, R.C.G.; PAULA, S.O.; MININ, V.P.R.; BRESSAN, J.- Estresse oxidativo: conceito, implicações e fatores modulatórios- Revista de Nutrição Campinas; Campinas; vol. 23; n. 4; p ; jul/ago; 2010 BORBA, V.Z.C.; CASTRO, M.L.- Osteoporose induzida por Glicocorticóide- Arquivo Brasileiro de Endocrinologia e Metabologia; São Paulo; vol. 43; n.6; p ; dez; BUEGE, J.A.; AUST, S.D. Microssomal lipid peroxidation.- Methods and Enzymology, v. 52, p , CAMPOS, L.M.A; LIPHAUS, B.L.; SILVA, C.A.A.; PEREIRA, R.M.R.- Osteoporose na infância e na adolescência- Jornal de Pediatria; São Paulo; vol. 79; n.6; p ; jan-mar; PAIVA, C.L.; HOROVITZ, A.P.; SANTOS, A.O.; CARVASAN, G.A.F.; NETO, A.M.P.- Prevalência de Osteoporose em mulheres na pós- menopausa e associação com fatores clínicos e reprodutivos- Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia- Campinas; vol. 25; n.7; p ; ago; JUNIOR, E.C.P.L.; BARONI, B.M.; ROSSI, R.P.; GODOI, V.; MARCHI, T.; TOMAZONI, S.S.; ALMEIDA, P.; SALVADOR, M.; GROSSELLI, D.; GENEROSI, R.A.; BASSO, M.; MANCALOSSI, J.L.; MARTINS, R.A.B.L.; - A Fototerapia com Diodo Emissor de Luz (Ledt) aplicada pré-exercicio inibe a peroxidação lipídica em atletas após exercício de alta Intensidade. Um estudo preliminar- Revista Brasileira de Medicina Esportiva; São Paulo; vol. 17; n. 01; p. 8-12; jan/fev; 2011.

9 LEITE, M.O.R.- Tratamento da Osteoporose pós-menopausa- Arquivo Brasileiro de Endocrinologia e Metabologia; São Paulo; vol. 43; n.6; p ; dez; MENEZES, R.C; CHAVES, L.; FARIAS, D.C.- Osteoporose- Revista Brasileira de Reumatologia; Recife-PE; vol. 48; n.5; p ; set-out; PETRI, A.D.- Efeitos da radiação laser de baixa intensidade em células osteoblásticas humanas cultivadas sobre titânio p. Tese (mestrado)- Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto- Ribeirão Preto. RADOMINSKI, S.C; PINTO, N.A.M.; MARINHO, R.M.; COSTA, L.H.S.P.; PEREIRA, A.S.; URBANETZ, A.A.;FERRARI, A.E.M.; BARACAT, E.C.- Osteoporose em mulheres pós-menopausa- Revista Brasileira de Reumatologia; São Paulo; vol. 44; n.6; p ; nov-dez; RANG, H.P.; DALE, M.M.; RITTER, J.M.; FLOWER, R.J.; - Fármacos usados no tratamento das infecções e do câncer- Rang e Dale Farmacologia, 6ª. Edição; Rio de Janeiro; ELSEVIER; pp RUSSO. L.A.T.- Osteoporose pós-menopausa: opções terapêuticas- Arquivo Brasileiro de Endocrinologia e Metabologia; Rio de Janeiro; vol.45; n.4; p ; ago; SILVA, A.A.; ABREU, F.M.; FERREIRA, D.O.L.; DAMASCENO, D.C.; DIAS, A.; GONÇALVES, R.C. - Níveis de Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em eritrócitos de ovinos anêmicos- VIII Congresso Brasileiro de Buiatria Botucatu- Ciência Animal Brasileira- Brasil; Suplemento 1; p ; SILVEIRA, P.C.L; SILVA, L.A.; TUON, T.; FREITAS, T.P.; STRECK, E.L.; PINHO, R.A.- Efeito da laserterapia de baixa potência na resposta oxidativa epidérmica induzida pela cicatrização de ferida- Revista Brasileira de Fisioterapia; São Carlos; vol. 13; n. 04; p ; jul/ago; PINTO, A. S. et al. Efeitos de tratamento combinado de alendronato de sódio, atorvastatina cálcica e ipriflavona na osteoporose induzida com dexametasona em ratas. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 42, n. 1, p , 2006.