IMPLICAÇÕES DO ESTRESSE OXIDATIVO SOBRE OS ERITRÓCITOS E DESENVOLVIMENTO NEUROPSICOMOTOR EM ADULTOS COM SINDROME DE DOWN

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1 IMPLICAÇÕES DO ESTRESSE OXIDATIVO SOBRE OS ERITRÓCITOS E DESENVOLVIMENTO NEUROPSICOMOTOR EM ADULTOS COM SINDROME DE DOWN Glaucia Silvano Rocha*, Aderbal Silva Aguiar Junior** *Acadêmica do curso de Fisioterapia da Universidade do Sul de Santa Catarina, UNISUL Campus de Tubarão, artigo realizado para conclusão de curso. **Professor orientador do trabalho de conclusão de curso RESUMO A síndrome de Down (SD) é a alteração patológica cromossômica mais encontrada. O fenótipo desta trissomia pode ser pela duplicação da região 21q22, onde se localiza o gene que codifica a enzima superóxido dismutase (SOD). As espécies reativas de oxigênio (EROS) são produzidas naturalmente em nosso organismo através de processos metabólicos oxidativos, a alteração entre a produção e a remoção das EROS, promovem o estresse oxidativo, que pode ser causado principalmente pelo aumento da atividade da SOD, nestes indivíduos. Esta atividade enzimática aumentada produz uma agressão endógena constante, pela aceleração da reação de formação de peróxido de hidrogênio e pelo desequilíbrio entre a atividade da SOD e glutationa peroxidase, com a conseqüente oxidação dos grupos sulfídricos e a peroxidação dos lipídios insaturados causando dano celular, tecidual, lipídico, levando a um envelhecimento precoce e atraso no desenvolvimento neuropsicomotor. Esta pesquisa foi experimental, tendo como objetivos analisar a atividade da enzima SOD, analisar os níveis de peroxidação de lipídeos através das Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS), verificando assim o estresse oxidativo, e avaliar o desenvolvimento motor através da escala Gross Motor Function Measure (GMFM). A amostra consistiu em um grupo controle (GC) de 8 adultos normossômicos, IMC 26 ± 1,2 kg/m², idade de 23,33 ± 2,13 anos, e um grupo experimental (GE) em 8 adultos com trissomia do 21, IMC 32 ± 1,5 kg/m², idade de 27 ± 3,67 anos, da Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE) de Jaguaruna e Tubarão, residentes da Associação dos Municípios da região de Laguna (AMUREL). As avaliações foram: aplicação da Escala de Desenvolvimento Neuropsicomotor de Gross Motor Function Measure (GMFM), amostras de sangue venoso, para a obtenção, da atividade da SOD, índice de peroxidação de lipídeos através das Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e determinação de proteínas. Foram encontrados uma maior atividade da SOD nas hemácias, um índice de peroxidação de lipídios nas hemácias e um menor desenvolvimento motor nos indivíduos com síndrome de Down. Estes resultados sugerem que os portadores de SD possuem um estresse oxidativo, o que pode ser a causa um atraso no desenvolvimento neuropsicomotor. Sendo assim, mostra-se de suma importância a detectação dos produtos da atividade da SOD e da peroxidação lipídica como evidência indireta na importância das EROS na patogenia desta doença. Palavras chaves: estresse oxidativo, síndrome de Down, superóxido dismutase, peroxidação de lipídeos, desenvolvimento motor. ABSTRACT Down Syndrome (DS) is the most found chromosomic pathological alteration. The phenotype of this trissomy can be caused by duplication of 21q22 region, where it located the gene that encodes superoxide dimutase enzyme (SOD). The reactive oxygen species (EROS) are

2 naturally produced in our body through oxidative metabolic processes, the alteration between production and removal of EROS promotes oxidative stress, that can be caused mainly by the increasing of SOD s activity in these individuals. This increased enzyme activity produces constant endogenous aggression, caused by acceleration of reaction of hydrogen peroxide formation and by unbalance between SOD s activity an glutathione peroxidase, with consequent oxidation of sulphidric and insaturated lipid peroxidation causing cellular, tissue and lipid damage, inducing precocious aging and delay of neurophysicomotor development. This research was experimental, and has as objectives to analyze the activity of SOD, to analyze the levels of lipoperoxidation through thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), verifing the oxidative stress, and to evaluate motor development through Gross Motor Function Measure (GMFM). The sample was constituted by a control group (CG) with 8 normosomic adults, IMC 26 ± 1,2 kg/m², 23,33 ± 2,13 years old, and an experimental group (EG) with 8 adults with 21 trissomy, IMC 32 ± 1,5 kg/m², 27 ± 3,67 years old, of Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE) of Jaguaruna and Tubarão, that live in Associação dos Municípios da região de Laguna (AMUREL). The evaluations were: application of Neurophycomotor Development Scale of Gross Motor Function Measure (GMFM), samples of venous blood to obtention of SOD activity, lipoperoxidation rate through thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) and determination of proteins. A larger SOD activity was found in erythrocyte, a lipoperoxidation rate in erythrocytes and a lesser motor development in individuals with Down syndrome. These results suggest thar DS carriers have an oxidative stress, that can be the cause of a neurophsycomotor development delay. So, it s showed the importance of detection of products of SOD activity and lipoperoxidation like an indirect evidence in importance of EROS in this disease s pathology. Key-words: oxidative stress, Down syndrome, superoxide dimutase, lipoperoxidation, motor development. INTRODUÇÃO A Síndrome de Down (SD) ou trissomia do par 21, segundo Silva e Aguiar (2003), Mancini et al (2003), Silva e Dessen (2002) foi a primeira anormalidade genética descrita pelo homem e constitui a aberração cromossômica mais comumente encontrada. A deficiência mental tem sido considerada uma das características mais constantes da SD, que constitui conforme Moreira, El-Hanib e Gusmão (2000) como uma causa mais freqüente de deficiência mental, compreendendo cerca de 18% do total de deficientes mentais em instituições especializadas. É uma doença cromossômica que consiste na presença e expressão de três cópias de genes localizados no cromossomo 21. O fenótipo nesta trissomia pode ser pela duplicação da região 21q22, onde se localiza o gene que codifica a superóxido dismutase (SOD). A cópia extra desse gene causa aos portadores da Síndrome de Down uma atividade da enzima aumentada em 50% em diferentes tipos de células eritrócitos, leucócitos, plaquetas e fibroblastos, ocasionando danos celulares, levando a envelhecimento precoce, dano cerebral e demência. Os pacientes com síndrome de Down possuem características do dano oxidativo como o envelhecimento precoce, dano cerebral e modificações bioquímicas o que poderia ser conseqüência desse desequilíbrio genético-bioquímico. O metabolismo celular produz espécies reativas de oxigênio (EROS) em condições fisiológicas que possuem vários efeitos úteis, conforme Schneider e Oliveira (2004) nas situações em que há necessidade de ativação do sistema; na desintoxicação de drogas; e

3 na produção do fator relaxante derivado do endotélio, o óxido nítrico, extremamente importante nos processos que desencadeiam o relaxamento dos vasos sangüíneos. A EROS é produzida sob o controle de estímulos e sinais moleculares e também pode ser formada a partir de várias células do organismo. Para Ramos, Ramos e Domingues (2000) podem ser induzidas por fontes exógenas (radiações ionizantes, toxinas, drogas, produtos químicos, agentes poluidores ambientais, etc.) e em várias outras situações patológicas, neste caso produzindo dando celular. Em condição normal, o organismo dispõe de sistemas antioxidantes de defesa, que são os antioxidantes não-enzimáticos e enzimáticos, este último é composto por enzimas capazes de metabolizar as EROS, como a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx). Ramos, Ramos e Domingues (2000) citam ainda a glutationa redutase (GRed). O equilíbrio entre estes sistemas é necessário para o bom funcionamento celular, caso os índices de prooxidantes estejam aumentados nas células acarretará em um estresse oxidativo, ou seja, a EROS causará dano celular, tecidual, protéico, lipídico, e no próprio DNA. A SOD em condições normais catalisa a reação de conversão dos ânions superóxidos (O 2 - ) em peróxidos de hidrogênios (H 2 O 2 ), que é eliminado pela ação das enzimas catalase e glutationa peroxidade. O aumento da atividade desta enzimática produz uma agressão endógena constante, pela aceleração da reação de formação de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) e pelo desequilíbrio entre a atividade da SOD com a GPx e CAT, com a conseqüente oxidação dos grupos sulfídricos e a peroxidação dos lipídios insaturados causando dano celular. O excesso de liberação da EROS está associado ao mecanismo de várias doenças, como cita Koury (2003) [...] isquemia, inflamação, trauma, doenças degenerativas e morte celular por ruptura da membrana (lipoperoxidação) e inativação enzimática. Kinochi (1991) relata a dificuldade de mensurar a quantidade de EROS que provocam isquemia cerebral. Há várias evidências que mostram que indivíduos com síndrome de Down estão sob nível de estresse oxidativo. Eles envelhecem prematuramente e muitos desenvolvem demência. Além disso eles sofrem de um começo prematuro de patologias degenerativas, tais como cataratas e doenças auto-imunes, e espécies reativas de oxigênio. O estresse oxidativo pode ser causado devido principalmente, a atividade de SOD encontrar-se aumentada nos indivíduos com SD em até 50%, fazendo com que a razão de SOD para catalase e glutationa peroxidase seja alterada, significando que mais peróxido de hidrogênio é gerado por SOD, que CAT e GPx podem neutralizar, conduzindo ao desequilíbrio severo de oxidação (JOVANOVIC; CLEMENTS; MACLEOD; 1998), e acúmulo de peróxido de hidrogênio no cérebro, danificando-o, contribuindo assim para a neurodegeneração (BUSH; BEAIL, 2004, apud HAAN; IANNELLO; KOLA, 1997). Pueschel (1999) cita que crianças com SD possuem todas as etapas do desenvolvimento motor iguais a de uma criança normal, entretanto de uma forma mais lenta, ou seja, com as aquisições motoras dar-se-ão de forma mais tardias. O trabalho teve como objetivo geral avaliar o índice de estresse oxidativo sobre eritrócitos e desenvolvimento neuropsicomotor em adultos com trissomia do cromossomo 21 e em adultos normossômicos. E como objetivos específicos, analisar a atividade da enzima superóxido dismutase (SOD), analisar os níveis de peroxidação de lipídeos através das Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS), verificando assim o estresse oxidativo, e avaliar através da escala de GROSS o desenvolvimento neuropsicomotor. MATERIAL E MÉTODOS

4 Neste estudo do tipo quali-quantitativo, quanto à abordagem explicativa e quanto ao procedimento do tipo experimental; a população estudada trata-se de indivíduos adultos, do sexo masculino, matriculados regularmente na APAE Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais de Jaguaruna e Tubarão, com diagnóstico de Síndrome de Down (SD), residentes da Associação dos Municípios da região de Laguna (AMUREL). A amostra consistiu em dois grupos, o grupo controle (GC) com 8 adultos sem a trissomia, IMC 26±1,2 kg/m², com idade 23,33±2,13 anos, e o grupo experimental (GE) em 8 adultos com trissomia do 21, IMC 32±1,5 kg/m², com idade 27 ± 3,67 anos. Os critérios de inclusão foram gênero masculino, adultos com idade entre 19 e 30 anos, sendo no GC normossômicos, e no GE portadores de síndrome de Down. Excluindo outras doenças de qualquer etiologia. Para a coleta de dados desta pesquisa, foram utilizados os seguintes instrumentos: agulhas descartáveis, seringas descartáveis, tubos de ensaio, materiais de laboratório e reagentes químicos, e fitas de análise Boehringer Mannheim, balança Filizola, dois cones, fita adesiva, uma bola de futebol, uma bola de basquete, uma bola de tênis, uma mesa, taco de beisebol, suporte para bola, saco de areia e câmera digital Canion. Os procedimentos utilizados na coleta de dados foram: Primeiramente, realizados os devidos esclarecimentos sobre os objetivos e procedimentos a todos os sujeitos da pesquisa, e estes assinaram o Termo de Consentimento livre e esclarecido (Anexo A) e o Termo de Consentimento para fotografias, vídeos e gravações. Após a assinatura dos responsáveis foi realizado a aplicação da escala de desenvolvimento neuropsicomotor de Gross Motor Function Measure (GMFM) e coletado amostras de sangue venoso sendo retirado 8 ml de sangue sem anticoagulante e as alíquotas de eritrócitos foram obtidas após a centrifugação do sangue sem anticoagulante a 1.500g e 4 o C durante 10 minutos, sendo armazenadas a -80 o C até o momento das análises, para a obtenção, da atividade enzimática da SOD segundo Bannister e Calabrese (1987) sendo estimada pela inibição da auto-oxidação da adrenalina medida espectrofotometricamente (480ηm); índice de peroxidação de lipídeos verificado através da formação de substâncias reativas ao aquecimento do ácido tiobarbitúrico (TBARS) medido espectrofotometricamente (532nm) e foram expressos como equivalentes de malondialdeído (MDA) (ηmol/mg proteína) descrito por Draper e Hadley (1990) foi determinado espectrofotometricamente em 370ηm usando um coeficiente Molar; onde a atividade da SOD e os níveis de TBARS foram ponderados através da determinação da proteína (albumina sérica bovina), utilizando a partir da técnica descrita por Lowry et al (1951). A aplicação da escala se deu de forma individual, onde todos os indivíduos possuem uma ficha para preenchimento dos dados de identificação e dos das pontuações de cada teste, que é usada para a análise dos dados. Os testes são divididos em teste de locomoção e teste de controle de objetos. O teste de locomoção é dividido em corrida, trote, salto para a frente, salto o obstáculo, salto em distância e deslizar. E o teste de controle de objetos em golpeando uma bola estacionária, drible estacionário, pegar, chute, arremesso com a mão e rolar a bola. Após a marcação das pontuações de cada teste é necessário somar a pontuação total, convertendo através de tabelas para o percentual da pontuação e para o percentual de coeficiente motor. Considerando o estudo de Aguilar-da-Silva, Moraes e Moraes (2003), encontrando valores médios de atividade da SOD de 3.245,20 U/g de Hb, e o poder de teste 80%, o tamanho de amostra para cada grupo é 7,6. Os valores foram expressos em média ± erro padrão médio (EPM). O teste de hipótese utilizado foi a distribuição de student, sendo a diferença significante quando p< 0,05. RESULTADOS E DISCUSSÃO DOS DADOS

5 A seguir são apresentados os resultados da coleta de dados. Os dados coletados foram organizados e apresentados em gráficos. Aumento da atividade enzimática da SOD nos pacientes com Down Os indivíduos portadores de síndrome de Down apresentaram significativamente (p<0,05) maior atividade da SOD nas hemácias do que os indivíduos do grupo controle, com os valores respectivamente, de 38,4±7,0 U SOD/mg proteína e de 22,1±2,1 U SOD/mg proteína. (Gráfico 1) Gráfico 1: Atividade da enzima SOD no grupo controle e no grupo com síndrome de Down, indicando um aumento significativamente (p<0,05) da enzima neste último grupo. O aumento da atividade da SOD nas hemácias também foi encontrado por Pastor (1998) onde determinou nas hemoglobinas a atividade da SOD em 72 pacientes com SD, comparando com 72 pacientes controles saudáveis, também foi encontrado um aumento desta enzima, nos portadores de síndrome de Down. Pastore et al (2003) realizou um estudo com 46 crianças com SD e em 64 crianças normais, encontrando uma atividade da SOD nas hemoglobinas aumentadas nos pacientes com síndrome de Down. O estudo realizado por Aguilar-da-Silva, Moraes e Moraes (2003) com 24 amostras de sangue, divididas em dois grupos, sendo 12 em portadores com Down da APAE e 12 no grupo controle, apresentou valores na hemoglobina para uma atividade da SOD aumentada nos pacientes com SD. O aumento da enzima superóxido dismutase (SOD) nos portadores de síndrome de Down, conforme Moreira, El-Hanib e Gusmão (2000), Pastore et al (2003), Aguilar-da- Silva, Moraes e Moraes (2003), Zana, Janka e Kálmán (2006) se dá fato da enzima localizarse no cromossomo onde ocorre a trissomia, ou seja, no segmento distal do cromossomo 21 da região 21q22, referente a ⅓ deste cromossomo, e portanto terá uma duplicação desta região, como a SOD catalisa a reação de conversão dos ânions superóxidos (O 2 ) em peróxidos de hidrogênios (H 2 O 2 ), que é eliminado pela ação das enzimas catalase e glutationa peroxidase, quando aumentada a sua atividade causará um desequilíbrio entre as enzimas antioxidantes e oxidantes, produzindo uma agressão endógena constante, o que acarretará em espécies reativas de oxigênio (EROS) pela aceleração da reação de formação de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) reagindo com o ânion superóxido, produzindo o radical hidroxila, causando danos oxidativo.

6 Aumento dos níveis de lipoperoxidação na síndrome de Down O índice de peroxidação de lipídeos, verificado através dos níveis de TBARS e expressos como equivalentes de MDA nos eritrócitos foi significativamente maior (p<0,05) nos indivíduos com síndrome de Down com os valores de 1,34±0,10 nmol MDA/mg proteína, e 0,69±0,03 nmol MDA/mg proteína no grupo controle. (Gráfico 2). Em nossos pacientes com síndrome de Down, a concentração dos níveis de lipídios nas hemácias, mostraram-se maiores, em relação ao grupo controle, o que indica uma lipoperoxidação nesta população. Gráfico 2: Lipoperoxidação no grupo controle e no grupo com síndrome de Down, mostrando uma significância (p<0,05) maior de peroxidação de lipídios nos Down, através do TBARS. Os nossos resultados foram semelhantes de Jovanovic, Clements e MacLeod (1998) que encontraram, em um estudo com síndrome de Down e controle, avalizando o TBARS em creatina um aumento de lipoperoxidação no grupo Down. Pastore et al (2003) também encontraram em amostras de sangue através do TBARS. Este aumento da lipoperoxidação no grupo com Down, revelam níveis elevados de marcadores de estresse oxidativo de TBARS. Capone et al (2002) em seu estudo com 46 SD e 43 controles, também encontraram nas amostras de plasmas, um aumento de lipoperoxidação em amostras de plasma no TBARS, nos pacientes com síndrome de Down. Atraso no desenvolvimento motor na síndrome de Down A aplicação da escala de desenvolvimento neuropsicomotor de Gross Motor Function Measure (GMFM), tanto no grupo controle, quanto no grupo de Down, obtiveram os valores respectivamente, de 116,0 ±1,3 e 65,5 ± 0,6. Estes valores mostram que o grupo Down apresentou significativamente (p<0,05) menor desenvolvimento motor que o grupo controle, indicando atraso no desenvolvimento neuropsicomotor. (Gráfico 3)

7 Quociente Motor de GROSS (adimensional) 160,0 120,0 80,0 40,0 0,0 Controle * Down Gráfico 3: Quociente motor de Gross está significativamente (p<0,05) diminuído em pacientes com síndrome de Down, acarretando um atraso no desenvolvimento neuropsicomotor. Segundo Schwartzman (1999), os portadores de síndrome de Down possuem um atraso inevitável em todas as áreas do desenvolvimento e um estado permanente de deficiência mental. Voivodic e Storer (2002) afirmam que o desenvolvimento cognitivo desta população não é somente mais lento, mas também se processa de forma diferente. Capone et al (2002) mostram uma capacidade cognitiva menor nos pacientes com a trissomia. Bush e Beail (2004) encontraram uma incidência alta no grupo com síndrome de Down a desenvolver demência, principalmente do tipo Alzheimer. O mecanismo patológico do atraso neuropscicomotor pode ser explicado, através da união dos dois resultados acima. O cérebro consome grandes quantidades de oxigênio, e é suscetível ao estresse oxidativo, o metabolismo dos principais neurotransmissores, geram as EROS que são capazes de consumir as defesas antioxidantes. As membranas neuronais contêm níveis elevados de lipídios polinsaturados capazes de sofrer peroxidação lipídica, e algumas células glias são capazes de produzir superóxido e peróxido de hidrogênio, e consequentemente o radical hidroxila. As EROS geradas oxidam assim lipídios de membrana, proteínas ou do próprio DNA (ZANA, JANKA, KÁLMÁN, 2006). Embora a SOD possa ser um importante componente no mecanismo da proteção de encontro aos radicais do oxigênio, pode também ter um efeito negativo (BUSH; BEAIL, 2004). Os autores, Druzhyna et al (1998), Capone et al (2002), explicam que o envelhecimento precoce ocorre pelo excesso de informação genética da SOD, onde produz efeitos cumulativos de radicais de oxigênio, de anion superóxido, radicais hidroxilas e de peróxido de hidrogênio. Massaccesi et al (2006) afirma que o peróxido de hidrogênio não completamente metabolizado causa o estresse oxidativo, prejudicando o estado redox do SNC, diminuindo as funções corticais. CONCLUSÃO O estudo chegou ao final obtendo-se como resultados: uma maior atividade da SOD nas hemácias nos indivíduos com síndrome de Down do que nos indivíduos controles; uma maior concentração dos níveis de peroxidação de lipídeos nas hemácias nos portadores de síndrome de Down do que no grupo controle, indicando uma lipoperoxidação; uma diminuição do quociente motor de GROSS nos portadores de síndrome de Down, mostrando um atraso do desenvolvimento neuropsicomotor nesta população.

8 Sendo assim, estes resultados sugerem que os portadores de síndrome de Down possuem um estresse oxidativo, o que pode ser a causa do atraso no desenvolvimento neuropsicomotor. Observou-se uma escassez de publicações nacionais ficando como sugestão a realização novos estudos sobre o estresse oxidativo, em pacientes com síndrome de Down, uma vez, quanto mais informações sobre a patologia melhor pode ser seu tratamento. Por fim, este trabalho mostrou-se de suma importância na detectação dos produtos da atividade da SOD e da peroxidação lipídica como evidência indireta na importância das espécies reativas de oxigênio na patogenia desta doença.