ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E ESTEREOLÓGICA DO CORAÇÃO DE CAMUNDONGOS NA FASE AGUDA DA INFECÇÃO EXPERIMENTAL POR TRYPANOSOMA CRUZI

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1 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E ESTEREOLÓGICA DO CORAÇÃO DE CAMUNDONGOS NA FASE AGUDA DA INFECÇÃO EXPERIMENTAL POR TRYPANOSOMA CRUZI André M. de Oliveira 1, Patrícia Borges 2, Andréia H. Pons 2, Marcio A. Babinski 3, Flávia B. Brasil 1 1 Laboratório de Histopatologia, Centro Universitário Plínio Leite (UNIPLI), Niterói, Rio de Janeiro - Brasil. 2 Laboratório de Ultraestrutura e Biologia Celular Instituto Oswaldo cruz, (FIOCRUZ), Rio de Janeiro - Brasil. 3 Laboratório de Biomorfologia da Matriz Extracelular, Departamento de Morfologia, Universidade Federal Fluminense (UFF), Niterói, Rio de Janeiro - Brasil RESUMO Trypanosoma cruzi é um protozoário, agente etiológico da doença de Chagas que acomete 16 a 18 milhões de habitantes em diversos países. A forma cardíaca é a forma clínica mais freqüente da Doença de Chagas e maior responsável pela elevada morbidade da doença. O presente trabalho avaliou o coração de camundongos normais e infectados intraperitonealmente com a cepa Y de T. cruzi no oitavo e décimo quinto dias pós-infecção. Foram utilizadas lâminas histológicas de 5 µm coradas com hematoxilina e eosina para análise histopatológica e quantificação do músculo cardíaco por estereologia através do sistema teste M42. Somente o grupo 15º dia pósinfecção apresentou aumento significativo na densidade volumétrica do músculo cardíaco (50,9 ± 4,9) em relação ao grupo controle (40,8 ± 1,0 p 0,01). A análise qualitativa mostrou que no oitavo dia pós-infecção o miocárdio apresenta morfologia semelhante à do coração normal, apesar de um discreto espaçamento entre as fibras musculares. No décimo quinto dia pós-infecção as fibras musculares apresentam-se espaçadas pela presença de exsudato e presença de infiltrado leucocitário com muitos leucócitos, além de hipertrofia muscular. Os resultados apresentados neste trabalho mostram que em camundongos as alterações estruturais mais marcantes no miocárdio são encontradas 15 dias após infecção pela cepa Y de T. cruzi. Unitermos: Trypanosoma cruzi, camundongo, coração, estereologia Acta Scientiae Medica: Vol. 1(1): 10-18; 2008 tripomastigotas, ou de transição entre INTRODUÇÃO elas. A forma tripomastigota é a forma infectante da doença, sendo transmitida para o hospedeiro vertebrado pelo contato direto com as dejeções do vetor, o triatomíneo conhecido como barbeiro, que coloniza o domicílio humano (Rey, 2001). Trypanosoma cruzi é um protozoário, agente etiológico da tripanossomíase americana, conhecida como doença de Chagas, que acomete 16 a 18 milhões de habitantes em diversos países. O ciclo biológico do T. cruzi é heteroxênico, apresentando formas amastigotas, epimastigotas e O protozoário é capaz de parasitar macrófagos, fibroblastos,

2 miócitos lisos e estriados e neurônios, onde se transforma em amastigota, formando ninhos parasitários. Depois de três a cinco dias sofrem polimorfismo para forma tripomastigosta, que ao romperem a célula parasitada, liberam no interstício as formas tripomastigotas íntegras e degeneradas, assim como formas amastigotas que não completaram seu ciclo morfológico e restos celulares, atuando como mediadores químicos e/ou imunógenos e desencadeando uma resposta inflamatória mononuclear focal (Lopes et al., 2002). A forma cardíaca é a forma clínica mais freqüente da Doença de Chagas e maior responsável pela elevada morbidade da doença. Nesta ocorre um comprometimento significativo do coração, levando a uma desorganização de suas estruturas e alteração de suas funções. É uma doença de evolução crônica, caracterizada por cardiopatias e distúrbios digestivos incuráveis. As formas tripomastigotas largas apresentam tropismo pelas fibras musculares lisas, esqueléticas e cardíacas, ocasionando as síndromes clínicas, onde em 30% dos casos o coração é afetado. Nesses casos, as manifestações clínicas são edema dos membros, cansaço, arritmias cardíacas, insuficiência circulatória e morte súbita por falência cardíaca (Rey, 2001). A miocardite chagásica é diferenciada pela presença do parasita nas fibras musculares e infiltrado inflamatório constituído por neutrófilos, macrófagos, linfócitos e eosinófilos no miocárdio. As reações de hipersensibilidade envolvendo o miocárdio induzem a um infiltrado intersticial principalmente perivascular. Esta reação inflamatória pode causar graves danos ao organismo (Brasileiro et al., 1998). Se o paciente sobrevive à fase aguda da miocardite, as lesões inflamatórias desaparecem, não camundongos. deixando alterações residuais ou se curam por fibrose progressiva. O tecido conjuntivo persistente está suficientemente disseminado, tornandose praticamente imperceptível. Porém, quando o comprometimento é mais grave, pequenas cicatrizes focais podem persistir, tornando-se confluentes e macroscopicamente visíveis (Robbins et al., 1989). Do ponto de vista laboratorial, a Doença de Chagas é caracterizada pela demonstração do parasita no sangue por meio de exame direto (Laranja et al., 1953) e pela presença de anticorpos anti - T. cruzi da classe IgM (Ingebourg et al., 2004). Os sintomas persistem por cerca de 60 dias com mortalidade ao redor de 2 8 %, especialmente para as crianças, podendo também apresentar quadros de febre, esplenomegalia, insuficiência cardíaca e perturbações neurológicas decorrentes de meningoencefalite (Neves et al., 2005). Muitos estudos têm avaliado as alterações morfológicas no coração de animais infectados experimentalmente por T. cruzi. Arnaiz et al. (2002) demonstrou redução no tamanho de cardiomiócitos, bem como dos seus núcleos nas áreas inflamadas do ventrículo esquerdo de ratos e Liu et al. (1995) ao infectar cães demonstrou fragmentação do DNA e apoptose de cardiomiócitos. Entretanto, até o presente momento, não encontramos na literatura trabalhos que quantificassem através de estereologia cardiomiócitos ou outros elementos possivelmente envolvidos na patogenia da Doença de Chagas. Portanto, o objetivo deste trabalho foi analisar as alterações histopatológicas e quantificar a densidade volumétrica de cardiomiócitos no oitavo e décimo quinto dias pós-infecção do miocárdio na fase aguda da infecção experimental por Trypanosoma cruzi em

3 MATERIAL E MÉTODOS Para este estudo foram utilizados 09 camundongos machos da linhagem Balb/c com 8 a 10 semanas de idade, cedidos pelo do Departamento de ultraestrutura e biologia celular (DUBC) Fiocruz, RJ. Estes animais foram divididos em dois grupos: grupo controle, com 05 animais não infectados, que receberam injeção de 200µl de PBS intraperitonealmente e grupo infectado, com 10 camundongos infectados intraperitonealmente com 1x10 3 da forma tripomastigota da cepa Y isoladas de sangue de animais Swiss Webster em 200 μl de PBS. Os animais infectados foram subdivididos, sendo sacrificados no oitavo e décimo quinto dias pós-infecção. No sacrifício, foram utilizados câmaras de CO 2 para remoção do coração. Os animais foram acondicionados em biotério próprio da instituição com taxa de umidade, luminosidade e temperatura controladas e foram alimentados com ração comercial. Foram respeitados os princípios descritos em The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals para os cuidados no uso e manuseio com os animais (Bayne 1996). Procedimento Histológico Para a análise quali-quantitativa, os corações foram fixados em formol tamponado e posteriormente desidratados em soluções crescentes de álcoois, iniciando com 70% até o álcool absoluto, clarificadas em xilol e incluídos em parafina. Para a análise histológica foram utilizados cortes de 5µm de espessura corados com hematoxilina e eosina e Tricrômico de Gomori (Behmer et al., 1975; Bancroft e CooK, 1994). As lâminas histológicas foram analisadas qualitativamente e as estruturas cardíacas quantificadas através da estereologia. Parâmetros Estereológicos De cada coração foram retirados 5 cortes com 5μm de espessura de diferentes partes do miocárdio. De cada corte foram analisados 5 campos aleatórios em aumento de 400X, perfazendo um total de 25 áreas teste analisadas no miocárdio de cada grupo (controle, 8º dia e 15º dia). As imagens para análise e quantificação bidimensional foram obtidas em aumento de 400 vezes, em microscópio óptico Olympus acoplado a uma câmera de vídeo Sony CCD, sendo a imagem dos campos microscópicos transferida para um monitor Sony KX14-CP1. Os resultados da densidade volumétrica foram obtidos pelo método de contagem de pontos, superpondo o sistema teste M42 à imagem histológica. O sistema-teste M42 de Weibel et al., (1966) apresenta 42 pontos-teste e 21 segmentos de reta, medindo a linha-teste 21d e a área-teste 36.36d 2. As características básicas do sistema-teste são Ap (área do pontoteste), Pt (número de pontos-teste) e d (a menor distância entre pontos-teste). A área-teste pode ser conhecida multiplicando-se o número de pontosteste pela área de um ponto-teste (Weibel et al., 1966; Mandarim-de- Lacerda, 2003). O parâmetro estereológico analisado no coração foi: 1) Densidade volumétrica (Vv) do músculo cardíaco onde Vv = Pp/Pt %, onde Pp é o número de pontos-teste que tocam a estrutura e Pt é o número total de pontos-teste. Análise Estatística Para a análise dos dados foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Dunn. Os dados mostram média desvio padrão. O nível de significância foi de p < 0,05. RESULTADOS

4 Análise quantitativa Os resultados estereológicos que avaliam a densidade volumétrica dos cardiomiócitos estão consubstanciados na Tabela e Figura 1. Os grupos infectados com T. cruzi no 8º e 15º dias pós-infecção apresentaram alterações quantitativas hipertróficas, mas somente o grupo do 15º dia apresentou aumento significativo na densidade volumétrica do músculo cardíaco em relação ao grupo controle (p 0,01). Tabela 1 - Resultado (% médio ± desvio padrão) da densidade volumétrica do músculo cardíaco de camundongos controle e infectados com T. cruzi. Elemento histológico Controle % 8º Dia % 15º Dia % N P Músculo Cardíaco (Vv) 40,8 ± 1,0 45,5 ± 2,8 50,9 ± 4,9* 5 0,0005** * p Teste de comparação múltipla de Dunn. ** p Teste Kruskal-Wallis. * Vv músculo cardíaco (%) A B C Controle 8 Column Dias 15 Dias * Controle vs 15 Dias = p 0.01 Figura 1 - Densidade volumétrica de músculo cardíaco de camundongos controle e infectados com T. cruzi. Os dados são dados como média ± desvio padrão de 5 animais. Análise qualitativa Em relação à análise qualitativa, no oitavo dia pós-infecção o miocárdio apresenta morfologia semelhante à do coração normal. Nesta fase cardiomiócitos parecem ainda preservar seu volume celular, apesar de um discreto espaçamento entre as fibras musculares (Figuras 2, 3 e 4). apresentam-se espaçadas pela presença de exsudato, caracterizando um processo inflamatório agudo. Podem ser observadas ainda alterações morfológicas marcantes, como hipertrofia muscular e presença de infiltrado leucocitário com abundância de leucócitos (Figura 5). No décimo quinto dia pósinfecção as fibras musculares

5 Figura 2 - Fotomicrografia mostrando miocárdio do grupo controle. H&E 200X Figura 3 - Fotomicrografia mostrando miocárdio do grupo 8º dia pós-infecção. H&E 200X. Figura 4 - Fotomicrografia mostrando miocárdio no 8º dia pós-infecção. H&E 400X. Figura 5 - Fotomicrografia do miocárdio, mostrando extenso infiltrado inflamatório com abundância de leucócitos no 15º dia pós-infecção. H&E 400X. DISCUSSÃO A forma cardíaca da Doença de Chagas é a forma clínica mais freqüente da infecção por Trypanosoma cruzi e maior responsável pela sua elevada morbi-mortalidade. Muitos estudos vêm sendo realizados há várias décadas, que objetivam conhecer as alterações causadas pelo parasita no coração de diversos modelos experimentais, identificar interações entre várias cepas deste protozoário e sistemas adaptativos do hospedeiro, para melhor compreensão das lesões cardíacas na Doença de Chagas (Calabrese et al. 2003, Soares e Santos 1999, Chandrasekar et al. 1998). Este trabalho mostrou alterações histológicas agudas no coração de camundongos infectados com Trypanosoma cruzi, porém em dois diferentes momentos de infecção. No oitavo dia após o contato com o parasita o miocárdio apresenta pouca alteração de sua estrutura, enquanto no décimo quinto dia pós-infecção as lesões são pronunciadas, caracterizadas pela presença de grande número de leucócitos e intensa resposta inflamatória aguda. Soares e Santos (1999) comentam que durante a fase

6 aguda, a destruição das fibras cardíacas ocorre quando o ninho de parasitas rompido libera os antígenos que ligam-se à superfície celular e tornam-se alvos de uma resposta imune celular e humoral contra T. cruzi. A análise estereológica revelou que a densidade volumétrica do músculo cardíaco foi significantemente maior somente no grupo 15º dia pósinfecção em relação ao grupo controle. O grupo no oitavo dia apresentou tendência a aumento do músculo cardíaco, porém sem significância estatística. Este parâmetro aumentado reflete hipertrofia miocárdica, que parece ocorrer por volta do décimo quinto dia após a infecção pelo parasita. Chandrasekar et al. (1998) comenta que a Doença de Chagas envolve uma resposta inflamatória seguida de dilatação das câmaras cardíacas, com subseqüente hipertrofia compensatória e que citocinas inflamatórias possam participar destes processos. Os achados apresentados neste trabalho sugerem que em camundongos as alterações estruturais mais marcantes são encontradas aproximadamente quinze dias após infecção pela cepa Y de T. cruzi. Nossos resultados, em parte, estão de acordo com aqueles encontrados por Calabrese et al. (2003), que estudando camundongos infectados pela mesma cepa, demonstrou elevada parasitemia e mortalidade destes animais entre o 14º e 17º dia pós-infecção. A ocorrência de lesões cardíacas nesta fase poderia justificar a mortalidade entre estes animais. Em outro estudo, este mesmo autor demonstrou que a taxa de mortalidade em camundongos balb/c foi de 75% no 14º dia pós-infecção e de 100% no 15º dia (Calabrese et al. 2003). Guedes et al. (2007), por sua vez, relatou a presença de lesões cardíacas extensas, inflamação, cardiomegalia e fibrose em cães infectados pela cepa Y. Muitos são os trabalhos presentes na literatura que mostram e descrevem lesões cardíacas em diferentes modelos experimentais. Ainda assim, os mecanismos de lesão cardíaca e de outros tecidos na Doença de Chagas não são totalmente conhecidos. Higuchi et al. (2003) comenta que interações entre hospedeiro e parasita causam diferentes quadros clínicos, e que a qualidade da resposta imunológica é um dos fatores determinantes da ocorrência e gravidade das lesões. CONCLUSÕES Os resultados apresentados neste trabalho nos levam a concluir que a hipertrofia do miocárdio de camundongos infectados pela cepa Y de T. cruzi ocorre no 15º dia pós-infecção, quando há aumento significativo na densidade volumétrica de cardiomiócitos. É também nesta fase que se observa importantes alterações estruturais do miocárdio, como desorganização das fibras musculares e intensa reação inflamatória aguda. REFERÊNCIAS 1) Rey L: Parasitologia. 3ª. ed. Rio de Janeiro. Guanabara Koogan, ) Lopes ER: Resposta inflamatória na fase crônica da forma adquirida da doença de Chagas. Rev de Patol Trop, 2002, 31(1): ) Brasileiro-Filho. G: Bogliolo Patologia Geral. Rio de Janeiro. 3 ed. Guanabara Koogan, ) Robbins LS, Contran RS, Kumar V: Robbins - Patologia estrutural e funcional. Rio de Janeiro. 5º ed. Guanabara Koogan, ) Laranja FS: Aspectos clínicos da moléstia de Chagas. Rev Brasil Med, 1953, 10: ) Ingebourg G: Características da imunidade humoral da doença de Chagas na fase crônica. Tese (mestrado) - Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro

7 7) Neves DP: Parasitologia Humana. São Paulo. 11ª ed. Atheneu, ) Arnaiz MR, Fichera LE, Postan M: Cardiac myocyte hypertrophy and proliferating cell nuclear antigen expression in Wistar rats infected with Trypanosoma cruzi. J Parasitol, 2002, 88(5): ) Liu Y, Cigola E, Cheng W, Kajstura J, Olivetti G, Hintze Th, Anversa P: Myocyte nuclear mitotic division and programmed myocyte cell death characterize the cardiac myopathy induced by rapid ventricular pacing in dogs. Lab Invest, 1995, 73(6): ) Bayne K: Revised Guide for the Care and Use of Laboratory Animals avaible. Am Phys Soc Physiol, 1996, 39(4): ) Behmer OA, Tolosa EMC, Freitas- Neto AG: Manual de técnicas para histologia normal e patológica. São Paulo. Edusp ) Bancroft JD, Cook HC: Manual of Histological Techniques and their Diagnostic Application. Edinburgh: Churchill Livingstone, ) Weibel ER, Kistler GS, Scherle WF: Practical stereological methods for morphometric cytology. J Cell Biol, 1966, 30: ) Mandarim-De-Lacerda CA: Stereological tools in biomedical research. An Acad Bras Cienc, 2003, 75(4): ) Calabrese KS, Paradela ASRC, Zaverucha-do-Valle T, et al.: T cell subpopulations in myocardial inflammatory infiltrates detected by confocal microscopy: dose dependence in mice treated with cyclophosphamide during acute Trypanosoma cruzi infection. Pathol Biol, 2003,51 (3): ) Soares MB, Santos RR: Immunopathology of cardiomyopathy in the experimental Chagas disease. Mem Inst Oswaldo Cruz, 1999, 94(1): ) Chandrasekar B, Melby PC, Pennica D, et al.: Overexpression of cardiotrophin-1 and gp130 during experimental acute Chagasic cardiomyopathy. Immunol Lett, 1998, 61(2-3): ) Guedes PM, Veloso VM, Caliari MV, et al.: Trypanosoma cruzi high infectivity in vitro is related to cardiac lesions during long-term infection in Beagle dogs. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2007,102(2): Aceito após revisão: Maio de 2008 Autor Correspondente: Prof. MSc Flávia de Bittencourt Brasil Departamento de Ciências Biológicas, Centro Universitário Plínio Leite. Av. Visconde do Rio Branco, 123 Centro Niterói, , Rio de Janeiro, Brasil brasil.fb@gmail.com

8 ABSTRACT Trypanosoma cruzi is etiologic agent of Chagas disease; a protozoan that infect million habitants in several countries. Cardiac form is the most frequent of the Chagas disease. The present study evaluated heart of normal and infected by Y strain mice at eight and fifteen days after infection. For this study, were utilized 09 Balb/c male mice, divided in control group and infected group, inoculated with trypomastigote strain Y of T. cruzi. The animals were sacrified eight and fifteen days after infection. At sacrifice, the heart was removed and histological sections of 5µm were stain by haematoxylin and eosin. The volumetric density of cardiomyocites was quantified by M42 test-system. The volumetric density of cardiomyocites was siginificantly higher only fifteen days after infection (50,9 ± 4,9) when compared to control group (40,8 ± 1,0 p 0,01). Histopatological analyzes showed that eight days after infection, myocardium still presents similar morphology to control group. At fifteen days after infection, myocardium presented disorganized fibres, hipertrophy and pronunciated acute inflammation. In summary, our results show that in heart mice, the main structural changes occur fifteen days after infection by strain Y of T. cruzi. Key words: Trypanosoma cruzi, mouse, heart, stereology