VARIANT II PROGRAMA BETA-TALASSEMIA

Transcrição

1 VARIANT II PROGRAMA BETA-TALASSEMIA 250 TESTES TESTES Sempre verifique se a versão da Instrução de Uso constante no rótulo externo do seu produto corresponde ao documento obtido no endereço eletrônico Para obter a Instrução de Uso em formato impresso, entre em contato com a Bio-Rad: brz_bulas@bio-rad.com.

2 Índice 1- USO PRETENDIDO RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO COMPONENTES DO KIT ITENS ADICIONAIS FORNECIDOS PELA BIO-RAD DIRETRIZES PARA A INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO CARACTERÍSTICAS DE PERFORMANCE SUBSTÂNCIAS INTERFERENTES FORMATO DO RELATÓRIO DA AMOSTRA INFORMAÇÕES DE SEGURANÇA DO PRODUTO REFERÊNCIAS... 27

3 1- USO PRETENDIDO O VARIANT II Programa Beta-Talassemia é destinado para a separação e determinações do percentual da área das hemoglobinas A2 e F, e atua como auxiliar na identificação de hemoglobinas anômalas no sangue total utilizando a cromatografia líquida de alta performance por troca iônica (HPLC). O VARIANT II Programa Beta-Talassemia é destinado somente para uso com o Sistema de Teste de Hemoglobina Bio-Rad VARIANT II. Para uso em diagnóstico in vitro. 2- RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE Uma talassemia com ocorrência frequente, a beta-talassemia (β-talassemia), é comumente encontrada no estado heterozigoto como uma β-talassemia menor ou um traço da β-talassemia.1 Os portadores do gene da β-talassemia podem ser afetados por uma anemia moderada ou permanecer assintomáticos. A identificação clínica desses portadores é importante: qualquer descendência entre os indivíduos com o traço da β-talassemia estão sob o risco de serem homozigotos para o gene da β-talassemia. O estado homozigoto, a β-talassemia maior, é uma doença letal, para a qual não há um tratamento adequado.2 Crianças afetadas pela β-talassemia maior sofrem de anemia grave, icterícia, esplenomegalia, más formações ósseas, retardo no crescimento e geralmente morte antes de se tornarem adultas.1 O sangue adulto contém principalmente a hemoglobina A (HbA), um pequeno percentual da hemoglobina A2 (HbA2) e quantidades de traços da hemoglobina fetal (HbF). Os portadores da β-talassemia apresenta níveis das hemoglobinas A2 e F que podem ser maiores que 3,5% e 2% da hemoglobina total, respectivamente.3 A determinação dos níveis concorrentemente elevados das hemoglobinas A2 e F se tornou o meio mais prático para diagnosticar os portadores do gene da β-talassemia.2 Os métodos para a quantificação da hemoglobina A2 incluem a eletroforese.4 e a cromatografia da coluna por troca de ânions.5 Os métodos para a quantificação da hemoglobina F incluem a eletroforese, a desnaturação alcalina e a imunodifusão radial (RID). A cromatografia líquida de alta performance (HPLC), que pode ser um método relativamente rápido e reprodutível, tem sido usada para a determinação de diversas hemoglobinas,6,7 incluindo as hemoglobinas A2 e F.8 O VARIANT II é um sistema de HPLC totalmente automatizado que pode ser 3

4 usado para separar e determinar os percentuais da área das hemoglobinas A2 e F e para fornecer determinações qualitativas das hemoglobinas anormais. Os variantes da hemoglobina que ocorrem com maior frequência incluem as hemoglobinas D, S, C e E.9 A identificação presumida dessas variantes da hemoglobina é feita utilizando as janelas do tempo de retenção, como a Janela D, Janela S e Janela C. A hemoglobina E, o segundo variante da hemoglobina com ocorrência mais frequente, elui na janela do tempo de retenção da hemoglobina A2 utilizando o VARIANT II Programa Beta-Talassemia. A diferenciação da hemoglobina A2 pode ser feita com a observação do cálculo do percentual da área no relatório da amostra. A hemoglobina E, na condição heterozigota (fenótipo AE), normalmente está presente em uma variação de 30 a 35%.10 Consulte as Limitações do Procedimento. A determinação final da eluição de variantes específicas nas janelas é deixada para o julgamento orientado do usuário. Outras metodologias (como a análise da cadeia da globina) devem ser usadas para confirmar a identificação de todas as variantes da hemoglobina presentes em uma amostra. O VARIANT II Programa Beta-Talassemia também oferece uma amostragem automática dos tubos com sangue total principais, seguida por uma diluição da amostra e um tempo de análise de 6,5 minutos por amostra. 3 PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO 4 O VARIANT II Programa Beta-Talassemia utiliza os princípios da cromatografia líquida de alta performance por troca iônica (HPLC). As amostras são diluídas e agitadas automaticamente na VARIANT II Sampling Station [Estação de Amostragem] (VSS) e injetadas na coluna analítica. As bombas duplas da VARIANT II Chromatographic Station [Estação Cromatográfica] (VCS) distribuem um gradiente programado do tampão de resistência iônica elevada na coluna, onde a HbA2/F é separada com base em suas interações iônicas com o material da coluna. Em seguida, a HbA2/F separada atravessa a célula de fluxo do fotômetro do filtro, onde as alterações na absorção a 415 nm são medidas. Um filtro adicional, a 690 nm, corrige a absorção em segundo plano. O software VARIANT II Clinical Data Management (CDM ) realiza a redução dos dados brutos coletados em cada análise. A calibração de um nível é usada no ajuste dos valores calculados da HbA2/F. Um relatório da amostra e um cromatograma são gerados pelo CDM para cada amostra. Para auxiliar na interpretação dos resultados, as janelas (p.ex., intervalos) foram

5 estabelecidas para as hemoglobinas com ocorrência mais frequente com base em seus tempos de retenção característicos. O tempo de retenção consiste no tempo decorrido desde a injeção da amostra até o ápice de um pico da hemoglobina. Cada hemoglobina possui um tempo de retenção característico. As diferenças secundárias na eficiência da separação das colunas analíticas individuais são corrigidas por meio do uso do Calibrador da Hemoblogina A2/F (HbA2/F). Calibrador da Hemoglobina A2/F O Calibrador da HbA2/F que atribuiu os valores (nas unidades do percentual da área da hemoglobina total) para as hemoglobinas A2 e F é analisado no início de cada execução. A análise do calibrador gera os fatores de calibração separados para as hemoglobinas A2 e F. Os fatores de calibração são a proporção calculada do valor atribuído (valor impresso no rótulo) em relação ao valor observado (valor determinado por execução). Esses fatores de calibração são aplicados ao percentual da área observado para as hemoglobinas A2 e F em todas as análises subsequentes na execução. A calibração corrige as diferenças resultantes na alocação da área para os picos das hemoglobinas A2 e F. Os valores de referência iniciais para o Calibrador da HbA2/F foram estabelecidos com base nos estudos de correlação comparando o VARIANT II Programa Beta-Talassemia com os métodos disponíveis comercialmente para as hemoglobinas A2 e F. Resumidamente, o valor de referência da HbA2 foi estabelecido empiricamente por meio da correlação dos valores da HbA2 de 48 amostras de pacientes usando dois métodos comerciais (empregando as tecnologias da HPLC e da troca de ânions de coluna aberta) com os valores da HbA2 gerados no VARIANT utilizando o VARIANT II Programa Beta-Talassemia. O valor de referência da HbA2 foi ajustado de forma que os valores obtidos no VARIANT fossem correspondentes aos coletados nos métodos de referência. O valor de referência da HbF foi estabelecido de forma semelhante por meio do ajuste dos valores da HbF (n = 46) obtidos no VARIANT utilizando o Programa Curto de β-talassemia com os valores coletados em um ensaio de desnaturação alcalina disponível comercialmente. Todos os lotes subsequentes do Calibrador da HbA2/F são comparados com o Calibrador da HbA2/F de referência para a atribuição do valor. 5

6 4 COMPONENTES DO KIT O Reorder Pack do VARIANT II Programa Beta-Talassemia contém os suprimentos para 250 testes (REF ) ou 500 testes (REF ): Quantidade REF REF REF Descrição * 2 de cada 3 de cada Tampão de Eluição 1. Cada frasco contém 1900 ml de um tampão de fosfato de sódio. Contém <0,05% de azida sódica como conservante * 1 de cada 2 de cada Tampão de Eluição 2. Cada frasco contém 1800 ml de um tampão de fosfato de sódio. Contém <0,05% de azida sódica como conservante * 1 conjunto 1 conjunto Conjunto Calibrador/ Diluente da HbA2/F. Um conjunto consistindo em 6 frascos do Calibrador e 1 do Diluente do Calibrador. Os frascos dos calibradores contêm eritrócitos humanos liofilizados hemolisados com gentamicina, tobramicina e EDTA como conservantes. O volume reconstituído é de 10 ml por frasco. O Diluente Calibrador contém 100 ml de água deionizada com <0,05% de azida sódica como conservante * 1 de cada 2 de cada Coluna Analítica. Coluna de troca de cátions (250 testes), DI de 4,6 mm x 30 mm embalagens 3 embalagens Iniciador do Sangue Total. Cada embalagem contém 10 frascos de eritrócitos humanos liofilizados hemolisados com gentamicina, tobramicina e EDTA como conservantes. O volume reconstituído é de 1,0 ml por frasco de cada 1 de cada Frascos de Amostras. 100 frascos de polipropileno com tampas perfuráveis, 1,5 ml * 1 de cada 2 de cada S o l u ç ã o de Lavagem/Diluente. Cada frasco contém 1800 ml de água desionizada com <0,05% de azida sódica como conservante * 1 de cada 1 de cada CD-ROM com os parâmetros do

7 VARIANT II Programa Beta-Talassemia. * Os componentes não estão disponíveis para venda individual. 5- ITENS ADICIONAIS, FORNECIDOS PELA BIO-RAD REF Descrição Adaptadores do Microfrasco, embalagem com Adaptadores do Tubo Pediátrico, embalagem com Controle da Hemoglobina A2 Lyphochek, 2 níveis, 4 x 0,5 ml 553x Controle da Hemoglobina A2 Lyphochek, 2 níveis, 2 x 0,5 ml Posição do Tubo Etiqueta do Reagente Adaptador 3. Configuração da Execução de Inicialização: 1 PRIMER Iniciador do Sangue Total Reconstituído (1 ml) 2 PRIMER Iniciador do Sangue Total Reconstituído (1 ml) 3 BLANK Água DI 4 BLANK Água DI 5 BLANK Calibrador da HbA 2/F Reconstituído (1 ml) 6 Calibrator Level 1 Calibrador da HbA 2/F Reconstituído (1 ml) 7 STOP Após a conclusão da execução, anote o tempo de retenção da HbA2 na injeção do segundo calibrador (tubo nº 6). 5. Consulte as Notas de Lançamento do CD-ROM para determinar o ajuste da temperatura necessário. 6. Se o tempo de retenção variar em mais de 0,20 minuto, monitore a performance da bomba medindo as taxas de fluxo e observando as leituras da pressão. Entre em contato com a Assistência Técnica da Bio-Rad para obter ajuda. 7. Para o restante da vida útil da coluna (250 injeções), a coluna deve ser preparada com o iniciador simples com cada configuração da execução. Na maioria dos casos, a temperatura da coluna não necessitará de outros ajustes; mudanças secundárias no tempo de retenção (<0,50 minuto do tempo de retenção ideal) refletem a variabilidade aleatória entre as execuções do ensaio e não necessitam de ajustes adicionais da temperatura. No entanto, uma mudança no tempo de retenção > 0,50 minuto para a HbA2 no calibrador pode 7

8 ocorrer devido ao envelhecimento da resina da coluna e requer um segundo ajuste da temperatura. Calibração A inicialização simples e a calibração devem ser realizadas com cada execução. Ordem da Amostra: Posição do Tubo Etiqueta do Adaptador Reagente 1 PRIMER Iniciador do Sangue Total Reconstituído (1 ml) 2 BLANK Água DI 3 BLANK Calibrador da HbA 2/F Reconstituído (1 ml) 4 Calibrator Level 1 Calibrador da HbA 2/F Reconstituído (1 ml) 5 Control Level 1 Controle Nível 1 Pré-diluído 6 Control Level 2 Controle Nível 2 Pré-diluído 7 a N --- Amostras do Paciente N + 1 Control Level 1 Controle Nível 1 Pré-diluído N + 2 Control Level 2 Controle Nível 2 Pré-diluído N + 3 STOP --- * N refere-se ao último número da amostra do paciente incluído na execução. Após a análise do calibrador, os fatores de calibração são calculados automaticamente e aparecem no relatório da calibração. Os fatores de calibração são usados no cálculo do percentual da área da HbA2 e HbF para todas as análises subsequentes na execução. Nome do Pico % da Área Tempo de Retenção (min.) Área do Pico CF Antigo Novo CF F 6,2 1, ,160 1,155 P , P , A , A2 6,1 3, ,157 1,158 Área Total = Concentração da F = 7,2% Concentração da A2 = 7,1% Tabela 1. Relatório da Calibração 8

9 OBSERVAÇÃO: Os valores atribuídos ao calibrador estão listados no relatório do calibrador. Seleção do Método Ao mudar para um método diferente que necessite de uma troca nos reagentes, o CDM sinaliza o usuário através de um enxágue do sistema estendido de duas fases. 1. Coloque as filas do reagente na água deionizada. 2. Inicialize manualmente as filas de entrada para as bombas A e B extraindo no mínimo 40 ml através das portas de entrada da bomba. 3. O CDM sinalizará o usuário quando a primeira etapa da ação de enxágue do sistema for concluída. Coloque as filas do reagente nos novos tampões correspondentes e inicialize manualmente as filas de entrada como na etapa 2. Clique em OK para continuar. Certificação/ Rastreabilidade do Material e Método de Referência O Comitê Misto para Rastreabilidade em Medicina Laboratorial (JCTLM) não identificou um método de referência ou um material de referência de ordenação superior para a quantificação da HbA2 e HbF. Até que os materiais e métodos de referência reconhecidos para a HbA2 e HbF sejam criados e aprovados para satisfazer os critérios estabelecidos nas Normas harmonizadas europeias (ISO e ISO 15194), a Bio-Rad continuará usando o processo existente de atribuição do valor do calibrador para esses analitos. Um lote mestre interno para da HbA2 e HbF é usado como referência para as atribuições do valor do calibrador do produto. Requisitos do Controle de Qualidade Um conjunto dos controles normal (HbF 1-2%, HbA2 1,8-3,2%) e anormal (HbF 5-10%, HbA2 4-6%) deve ser executado no início e no final de cada grupo de amostras do paciente. 9

10 6- DIRETRIZES PARA A INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Observe as diretrizes a seguir para garantir resultados aceitáveis: 1. O VARIANT II deve ser calibrado. O tempo de retenção da HbA2 no calibrador é de 3,65 ± 0,10. Os fatores de calibração das hemoglobinas A2 e F devem ser >0,7 e <1, A área total de cada análise deve variar entre 1,0 e 3,0 milhões de µvolt segundo. Os resultados não devem ser reportados se a área estiver fora desse intervalo. 3. Os valores do Controle de Qualidade devem estar dentro do intervalo. 4. O intervalo de um adulto normal para a HbA2 geralmente varia entre 1,75-3,25% da hemoglobina total. As condições heterozigotas da β-talassemia produzem níveis da HbA2 de 4-9% (ver Intervalos do Valor Esperado).10 O intervalo de um adulto normal para a HbF geralmente é <1% da hemoglobina total. As condições heterozigota e homozigota da β-talassemia produzem níveis da HbF de 1-5% e %, respectivamente (ver Intervalos do Valor Esperado) Embora os estudos de linearidade (Características de Performance, Linearidade) demonstrem um intervalo linear amplo, o intervalo reportável para a HbA2 varia entre 1-13% e o intervalo reportável para a HbF varia entre 1-40%. Esses intervalos foram selecionados para estarem de acordo com um método de referência disponível comercialmente. Para estarem de acordo com os intervalos reportáveis estabelecidos, os valores da HbA2 e HbF menores que o intervalo reportável devem ser reportados como <1,0%. Os valores da HbA2 e HbF acima do intervalo reportável devem ser reportados como >13% e >40%, respectivamente. 6. As amostras diabéticas geralmente apresentam um pico P2 elevado. Um pico adicional, identificado como Unknown (Desconhecido), também pode estar presente entre as posições normais do HbF e P2. Se esse pico adicional elui dentro da janela F quando a HbF não estiver presente, ele pode ser identificado incorretamente como HbF. Uma comparação cuidadosa do tempo de retenção F da amostra com as amostras do controle pode ajudar na diferenciação entre esse pico Unknown e o HbF. 10

11 Janela de Identificação do Analito As janelas de identificação do analito são destinadas a auxiliar o laboratório na interpretação das hemoglobinas normais e anormais detectadas nas amostras do paciente. As janelas são intervalos de tempo estabelecidos nos quais foi observada a eluição das variantes comuns utilizando o VARIANT II Programa Beta-Talassemia. O tempo de retenção é o centro da janela. O tempo de retenção é medido a partir do momento da injeção da amostra até o ponto máximo de cada pico. A faixa corresponde à meia largura da janela. OBSERVAÇÃO: A Tabela 2 é fornecida como um exemplo. Consulte os parâmetros do método atual para obter as informações específicas do lote. Nome do Analito Tempo de Retenção Faixa (minutos) Janela (minutos) (minutos) F 1,10 0,12 0,98-1,22 P2 1,39 0,11 1,28-1,50 P3 1,70 0,20 1,50-1,90 A0 2,50 0,60 1,90-3,10 A2 3,60 0,30 3,30-3,90 JANELA D 4,10 0,20 3,90-4,30 JANELA S 4,50 0,20 4,30-4,70 JANELA C 5,10 0,20 4,90-5,30 Tabela 2: Janela de Identificação do Analito O P2 e P3 são picos secundários associados à hemoglobina A. Intervalos do Valor Esperado Foram analisadas sessenta e oito amostras de adultos do sexo masculino e feminino aparentemente saudáveis da Califórnia utilizando o VARIANT II Programa Beta-Talassemia. O valor médio da hemoglobina A2 foi de 2,8%. O intervalo de confiança de 95% da hemoglobina A2 foi de 2,3 a 3,3%. 11

12 Foram analisadas em duplicata quarenta e seis amostras de adultos do sexo masculino e feminino aparentemente saudáveis da Califórnia utilizando o VARIANT II Programa Beta-Talassemia. O valor médio da hemoglobina A2 foi de 1,0%. O intervalo de confiança de 95% da hemoglobina F foi <1,0%. Cada laboratório deve estabelecer seus próprios intervalos de referência para a interpretação do relatório do paciente. Como uma diretriz inicial para a interpretação dos resultados, use os intervalos de referência publicados na Tabela 3. Situação do Paciente Nível da HbA 2 Nível da HbF β-talassemia heterozigota 4 a 9% 1 a 5% β-talassemia homozigota Normal ou Elevada 80 a 100% HPFH heterozigota <1.5% 10 a 20% HPFH homozigota Ausente 100% Tabela 3: Intervalos do Valor Esperado LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO O VARIANT II Programa Beta-Talassemia fornece a determinação do percentual de uma área das hemoglobinas A2 e F, assim como a separação qualitativa das hemoglobinas normais e anormais com ocorrência frequente. Outras variantes com ocorrência menos frequente também podem eluir nas janelas de identificação do analito estabelecidas. Para a confirmação positiva de qualquer variante da hemoglobina em particular, pode ser necessário analisar a cadeia da globina. Os níveis elevados da HbA2 podem ser mascarados por uma anemia por deficiência de ferro concorrente.2 Na confirmação laboratorial do diagnóstico de um traço de β-talassemia, os níveis da HbA2 devem ser considerados em conjunto com o histórico familiar e os dados laboratoriais, incluindo o ferro sérico e a capacidade de ligação do ferro, a morfologia dos eritrócitos, a hemoglobina, os hematócritos e o volume corpuscular médio (MCV).2,11 A hemoglobina S e outras variantes da hemoglobina de eluição tardia apresentam picos de componentes secundários que podem coeluir com a HbA2. Isso pode resultar em um valor percentual da área falsamente elevado para a HbA2. 12

13 As hemoglobinas D e E têm sido observadas por coeluir com a HbA2. As amostras determinadas por apresentar níveis de HbA2 maiores que 10% devem ser testadas para a possível presença da interferência da variante da hemoglobina. As hemoglobinas de Bart e H eluem antes do início da integração. As amostras diabéticas geralmente apresentam um pico P2 elevado. Um pico adicional, identificado como Unknown (Desconhecido), também pode estar presente entre as posições normais do F e P2. Se esse pico adicional elui dentro da janela F quando a HbF não estiver presente, ele pode ser identificado incorretamente como HbF. Uma comparação cuidadosa do tempo de retenção F da amostra com as amostras do controle pode ajudar na diferenciação entre esse pico Unknown e o HbF. Diluição da Amostra A concentração da hemoglobina total normal corresponde a uma área total de aproximadamente 2,5 milhões de µvolt segundo. O intervalo da área total necessária para o VARIANT II Programa Beta- Talassemia varia entre 1,0 e 3.0 milhões de µvolt segundo. OBSERVAÇÃO: As amostras com áreas totais menores que 1.0 milhão de µvolt segundo ou maiores que 3.0 milhões de µvolt segundo devem ser diluídas manualmente. Para a pré-diluição, pipete 1.0 ml de Solução de Lavagem/ Diluente em um frasco de 1,5 ml identificado, seguido de 5 µl da amostra do sangue total. Tampe o frasco da amostra e misture-a completamente. Use um adaptador do microfrasco para amostras pré-diluídas. Se a área da amostra ainda estiver fora do intervalo esperado, a amostra deve ser rediluída para estar dentro do intervalo da contagem da área total de milhões e re-executada. 8- CARACTERÍSTICAS DE PERFORMANCE Precisão A precisão do VARIANT II Programa Beta-Talassemia foi avaliada em um estudo baseado na Diretriz EP5-T2 do NCCLS, Avaliação da Performance da Precisão dos Dispositivos Químicos Clínicos. Foram realizadas quarenta execuções ao longo de um período de dez dias utilizando dois instrumentos VARIANT II. Em cada execução, 13

14 14 duplicatas de três amostras de sangue foram analisadas randomicamente. Os resultados do estudo de precisão estão resumidos nas tabelas a seguir. Paciente Baixo Paciente Intermediário Paciente Alto Média (HbA2 %) 2,8 3,2 4,6 Na Execução (CV %) 1,64 1,88 0,88 Entre Dias (CV %) 0,00 1,61 0,00 Entre Execuções (CV %) 1,38 1,06 1,98 Precisão Total (CV %) 2,02 2,69 2,13 Tabela 4: Resultados da Precisão para a HbA2 Paciente Baixo Paciente Intermediário Paciente Alto Média (HbF %) 1,6 3,1 8,2 Na Execução (CV %) 2,05 1,20 0,59 Entre Dias (CV %) 2,03 1,15 0,18 Entre Execuções (CV %) 2,55 1,45 1,24 Precisão Total (CV %) 3,85 2,20 1,38 Tabela 5: Resultados da Precisão para a HbF Precisão do Tempo de Retenção da Substância Os resultados da precisão do tempo de retenção do analito derivados dos estudos de investigação clínica são apresentados na Tabela 6. Analito Tabela 6: Precisão do Tempo de Retenção da Substância RT se refere ao tempo de retenção do analito. P2 e P3 são picos secundários associados à hemoglobina A. Exatidão N Nº Total de Analitos RT Médio RT do Desvio Padrão Hemoglobina A2 Os resultados da hemoglobina A2 obtidos a partir do VARIANT II Programa Beta-Talassemia foram comparados aos valores obtidos no VARIANT. O estudo de comparação foi realizado em 47 amostras de sangue. Os valores da HbA2 percentual relativa, nesse estudo, variaram entre 1,3% e 6,6% utilizando o Programa Curto CV % RT Mínimo Observado RT Máximo Observado F ,12 0,02 1,57 1,09 1,19 P ,34 0,01 0,77 1,31 1,36 P ,73 0,02 0,91 1,66 1,78 A ,33 0,03 1,46 2,27 2,44 A ,65 0,01 0,33 3,63 3,69 D 5 4 4,15 0,01 0,17 4,14 4,15 S ,54 0,05 1,12 4,49 4,64 C ,13 0,04 0,72 5,09 5,18

15 de β-talassemia. Consulte a Tabela 7 para obter os resultados. N Coeficiente x Intercepção y r 47 1,048-0,027 0,987 Tabela 7: Regressão Linear da HbA2 Hemoglobina F Os resultados da hemoglobina F obtidos a partir do Programa Curto de β-talassemia utilizando o VARIANT II foram comparados aos valores obtidos no VARIANT. O estudo de comparação foi realizado com 50 amostras de sangue. Os valores da HbF percentual relativa variaram entre 0,0% e 31,9% utilizando o Programa Curto de β-talassemia. Consulte a Tabela 8 para obter os resultados. N Coeficiente x Intercepção y r 50 1,005 0,114 0,999 Tabela 8: Regressão Linear da HbF Linearidade Os estudos de linearidade foram realizados para avaliar a resposta do PVARIANT II Programa Beta-Talassemia às concentrações em elevação das hemoglobinas A2 e F. Nesses estudos, as soluções purificadas das hemoglobinas A2 e F foram diluídas serialmente com o hemolisado que continha somente a hemoglobina A0, e analisadas. Os resultados observados a partir do VARIANT II foram comparados aos valores teóricos determinados a partir do número de diluições seriais, e são apresentados a seguir. Resumidamente, para a HbA2, os dados mostram que o VARIANT II Programa Beta-Talassemia é linear desde a HbA2 de 1,6% até 18,7%. Para a HbF, os dados mostram que o VARIANT II Programa Beta-Talassemia é linear desde a HbF de 1,3% até 44,3%. OBSERVAÇÃO: Consulte as Diretrizes para a Interpretação dos Resultados para os intervalos reportáveis validados. Embora esses estudos sugiram uma linearidade ao longo de um intervalo maior, o intervalo reportável é de 1-13% para a HbA2 e de 1-40% para a HbF. 15

16 Teórica Observada 1,7 1,6 1,8 1,8 2,1 2,1 2,6 2,6 3,7 3,7 5,7 5,7 9,9 10,0 18,7 18,7 Inclinação 0,999 Intercepção y 0,001 r 2 1,000 Figura 1: Linearidade da HbA2 16

17 Teórica Observada 1,3 1,3 2,3 2,2 4,2 4,0 8,3 8,1 12,4 11,9 16,6 15,7 20,9 20,8 25,3 24,9 27,6 27,2 29,9 29,3 32,2 31,5 42,7 44,3 Inclinação 1,01 Intercepção y -0,48 r 2 0,998 Figura 2: Linearidade do HbF 17

18 18 9- SUBSTÂNCIAS INTERFERENTES Estudo de Interferência da Lipemia O efeito das amostras lipêmicas sobre o VARIANT II Programa Beta-Talassemia foi avaliado por meio da obtenção de uma amostra excessivamente lipêmica com um nível de triglicérides de mg/dl. Em seguida, a fase plasmática foi isolada da amostra lipêmica. Os hemolisados foram preparados a partir de três amostras de sangue total de acordo com o protocolo do manual de instruções do Programa Curto de β-talassemia. O plasma lipêmico isolado foi diluído nos hemolisados preparados nos níveis equivalentes aos triglicérides de 0, 1.150, 2.300, e mg/dl. Os resultados indicam que os níveis de triglicérides de até mg/dl não interferem na determinação do percentual relativo das hemoglobinas A2 e F utilizando o VARIANT II Programa Beta-Talassemia. Estudo de Interferência da Concentração do Anticoagulante (EDTA) A Bio- Rad Laboratories recomenda a coleta das amostras do sangue total nos tubos de teste contendo EDTA como anticoagulante. A concentração efetiva do EDTA na amostra coletada varia em função do volume extraído da amostra em relação à capacidade do tubo de coleta. Um estudo foi realizado para avaliar o efeito das concentrações do EDTA que variam de 100 a 1.100% da concentração resultante da coleta do volume extraído especificado no tubo. Para o estudo, três amostras do sangue total foram coletadas em tubos de teste com capacidade de 10 ml com EDTA (100% EDTA). Após a mistura, 1,0 ml de cada amostra coletada foi transferido para um segundo tubo de 10 ml com EDTA (1.100% EDTA). As duas frações (100% e 1.100% EDTA) de cada uma das três amostras foram então analisadas em duplicata utilizando o VARIANT II Programa Beta-Talassemia. Os resultados indicam que as concentrações do anticoagulante (EDTA) de 100 a 1.100% da concentração padrão não interferem na determinação do percentual relativo das hemoglobinas F e A2 quando analisadas utilizando o VARIANT II Programa Beta-Talassemia. Estudo de Interferência da Icterícia A bilirrubina presente na amostra do paciente produz uma cor amarelada quando a concentração excede 2,5 mg/dl. Para estudar o efeito da icterícia na medição da HbA2 e HbF, as amostras de um paciente normal e de outro anormal foram

19 suplementadas com a bilirrubina conjugada nos níveis de 0, 5, 10, 15 e 20 mg/dl e em seguida analisadas em duplicada utilizando o VARIANT II Programa Beta-Talassemia. Os resultados demonstraram que as concentrações da bilirrubina conjugada no sangue total de até 20 mg/dl não interferem nas medições da HbA2 ou HbF utilizando o VARIANT II Programa Beta-Talassemia. Estudo da Amostra Hemolisada Para estudar o efeito da hemólise da amostra (antes da preparação da amostra) na medição da HbA2 e HbF, os eritrócitos de três amostras do sangue total foram lisados por sonicação, armazenados a 2-8 C por 8 dias, e subsequentemente analisados utilizando o VARIANT II Programa Beta-Talassemia. As amostras de controle foram submetidas a condições idênticas, com exceção da sonicação. Os resultados demonstraram que as medições da HbA2 e HbF com o VARIANT II Programa Beta-Talassemia não são afetadas pela hemólise da amostra. No entanto, a Bio-Rad Laboratories recomenda que as amostras hemolisadas antes da sua preparação não devem ser usadas para análise. Estudo de Interferência da A1c Lábil Para estudar o efeito da A1c lábil na identificação e quantificação da HbF, a HbF purificada foi adicionada às amostras de pacientes diabéticos, produzindo um intervalo de valores da HbF <1 até 10%. Os picos da A1c lábil foram gerados por meio da incubação de 1,0 ml da amostra com 50 µl de uma solução de glicose de 10 g/dl. Nesses estudos, a Hemoglobina F foi identificada corretamente em todas as amostras. Em geral, a quantificação da Hemoglobina F no intervalo de 1 a 10% não foi afetada pela A1c lábil no intervalo de 1-2,5%. A quantificação da Hemoglobina F pode ser afetada de maneira adversa na presença da A1c lábil maior que 2,5%. 19

20 10- FORMATO DO RELATÓRIO DA AMOSTRA Os cromatogramas a seguir são destinados a auxiliar na interpretação dos resultados. Sistema Bio-Rad CDM RELATÓRIO DO CALIBRADOR Instrumento Bio-Rad Variant 2 Nº 1 BV202IC Dados do Calibrador Dados da Análise Número do Lote: AA81714 Análise Realizada Em: 04/02/ :12:59 Data de Validade: 23/09/2000 Número da Injeção: 1262 Número da Execução: 62 ID do Rack: 036 Número do Tubo: 3 Relatório Gerado Em: 27/04/ :13:08 ID do Operador: DEMO Nome do Pico % da Área Tempo de Retenção (min.) Área do Pico CF Antigo Novo CF F 6,2 1, ,170 1,162 P , P , Ao --- 2, A2 6,4 3, ,138 1,109 Concentração da F = 7,2 % Concentração da A2 = 7,1 % Comentários da análise: Área Total: Tempo (min.) Figura 3: Calibrador da HbA2/F 20

21 Sistema Bio-Rad CDM CONTROLE Instrumento Bio-Rad Variant 2 Nº 1 RELATÓRIO DE BAIXO BV202IC Dados de Baixo Controle Dados da Análise Número do Lote: Análise Realizada Em: 09/02/ :58:52 Data de Validade: 30/09/1999 Número da Injeção: 1353 Número da Execução: 71 ID do Rack: 002 Número do Tubo: 5 Relatório Gerado Em: 27/04/ :12:05 ID do Operador: samdilute Nome do Pico % da Área Tempo de Retenção % da Área Calibrada (min.) Área do Pico F 2, , Desconhecido --- 0,9 1, P ,0 1, P ,0 1, Ao ,4 2, A2 2, , Concentração da F = 2,9% Concentração da A2 = 2,5% Comentários da análise: Área Total: Tempo (min.) Figura 4: Controle 1 da HbA2, Padrão Normal da Hemoglobina 21

22 Sistema Bio-Rad CDM Instrumento Bio-Rad Variant 2 Nº 1 RELATÓRIO DE ALTO CONTROLE BV202IC Dados de Alto Controle Dados da Análise Número do Lote: Análise Realizada Em: 09/02/ :05:32 Data de Validade: 30/09/1999 Número da Injeção: 1354 Número da Execução: 71 ID do Rack: 002 Número do Tubo: 6 Relatório Gerado Em: 27/04/ :11:34 ID do Operador: samdilute Nome do Pico % da Área % da Área Tempo de Retenção Área do Pico Calibrada (min.) F 10, , P ,7 1, P ,5 1, Ao ,9 2, A2 5, , Janela S ,2 4, Área Total: Concentração da F = 10,1% Concentração da A2 = 5,7% Comentários da análise: Tempo (min.) Figura 5: Controle 2 da HbA2 22

23 Sistema Bio-Rad CDM Instrumento Bio-Rad Variant 2 Nº 1 RELATÓRIO DO PACIENTE BV202IC Dados do Paciente Dados da Análise ID da Amostra: Unknown (Desconhecido) Análise Realizada Em: 04/02/ :21:58 ID do Paciente: Número da Injeção: 1272 Nome: Número da Execução: 63 Médico: ID do Rack: 020 Sexo: Número do Tubo: 3 DOB: Relatório Gerado Em: 26/04/ :26:55 Comentários: ID do Operador: DEMO Nome do Pico % da Área Calibrada % da Área Tempo de Retenção (min.) Área do Pico F 0, , P ,4 1, P ,0 1, Ao ,9 2, A2 4, , Janela S ,4 4, Área Total: Concentração da F = 0,4% Concentração da A2 = 4,3% Comentários da análise: Tempo (min.) Figura 6: Traço da Hemoglobina S, ou Traço de Célula Falciforme (AS) 23

24 Sistema Bio-Rad CDM Instrumento Bio-Rad Variant 2 Nº 1 RELATÓRIO DO PACIENTE BV202IC Dados do Paciente Dados da Análise ID da Amostra: Unknown (Desconhecido) Análise Realizada Em: 08/02/ :59:04 ID do Paciente: Número da Injeção: 1348 Nome: Número da Execução: 70 Médico: ID do Rack: 002 Sexo: Número do Tubo: 10 DOB: Relatório Gerado Em: 27/04/ :12:39 Comentários: ID do Operador: HEMOLYZED Nome do Pico % da Área Tempo de Retenção % da Área Calibrada (min.) Área do Pico F 0, , Desconhecido --- 0,4 1, P2 2,1 1, Desconhecido --- 0,5 1, P ,2 1, Ao ,8 2, A2 34,1* --- 3, Área Total: Concentração da F = 0,9% Concentração da A2 = 34,1*% *Valores fora dos intervalos esperados Comentários da análise: Tempo (min.) Figura 7: Traço da Hemoglobina E (AE) 24

25 Sistema Bio-Rad CDM Instrumento Bio-Rad Variant 2 Nº 1 RELATÓRIO DO PACIENTE BV202IC Dados do Paciente Dados da Análise ID da Amostra: Unknown (Desconhecido) Análise Realizada Em: 04/02/ :48:34 ID do Paciente: Número da Injeção: 1276 Nome: Número da Execução: 63 Médico: ID do Rack: 020 Sexo: Número do Tubo: 7 DOB: Relatório Gerado Em: 27/04/ :13:52 Comentários: ID do Operador: DEMO Nome do Pico % da Área Tempo de Retenção % da Área Calibrada (min.) Área do Pico F 2, , Desconhecido --- 0,5 1, P ,6 1, P ,6 1, Ao ,3 2, A2 3, , Janela S --- 2,3 4, Desconhecido --- 1,4 4, Janela C ,3 5, Área Total: Concentração da F = 2,7% Concentração da A2 = 3,0% Comentários da análise: Tempo (min.) Figura 8: Traço da Hemoglobina C (AC) 25

26 Sistema Bio-Rad CDM Instrumento Bio-Rad Variant 2 Nº 1 RELATÓRIO DO PACIENTE BV202IC Dados do Paciente Dados da Análise ID da Amostra: Unknown (Desconhecido) Análise Realizada Em: 04/02/ :37:27 ID do Paciente: Número da Injeção: 1284 Nome: Número da Execução: 64 Médico: ID do Rack: 002 Sexo: Número do Tubo: 5 DOB: Relatório Gerado Em: 27/04/ :14:18 Comentários: ID do Operador: DEMO Nome do Pico % da Área Tempo de Retenção % da Área Calibrada (min.) Área do Pico F 4, , Desconhecido --- 0,7 1, P ,2 1, P ,9 1, Ao ,9 2, A2 5, , Área Total: Concentração da F = 4,2% Concentração da A2 = 5,3% Comentários da análise: Tempo (min.) Figura 9: Traço da β-talassemia ou β-talassemia Menor 26

27 11- INFORMAÇÕES DE SEGURANÇA DO PRODUTO Iniciador do Sangue Total e Calibrador da HbA2/F ADVERTÊNCIA: Esses produtos contêm uma substância química conhecida no Estado da Califórnia por provocar defeitos de nascença ou outros riscos à reprodução. Contém <0,1% de Sulfato de Gentamicina e <0,1% de Tobramicina. INFORMAÇÕES DA MARCA COMERCIAL VARIANT e CDM são marcas comerciais da Bio-Rad Laboratories, Inc. Lyphochek é uma marca registrada da Bio-Rad Laboratories, Inc. 12- REFERÊNCIAS 1. Fairbanks, V. F. Thalassemias and Related Disorders. Hemoglobinopathies and Thalassemias; Brian C. Decker: New York, 1980; pp Rowley, P. T. The Diagnosis of Beta-Thalassemia Trait: A Review. Am. J. Hematol. 1976, 1, International Committee for Standardization in Haemotology. Recommendations for Selected Methods for Quantitative Estimation of Hb A2 and for Hb A2 Reference Preparation. Brit. J. Haemat. 1978, 38, Marengo-Rowe, A. J. Rapid Electrophoresis and Quantitation of Haemoglobins on Cellulose Acetate. J. Clin. Pathol. 1965, 18, Huisman, T. H. J.; Schroeder, W. A.; Brodie, A. N.; Mayson, S. M.; Jakway, J. Microchromatography of Hemoglobins. II. A Simplifi ed Procedure for the Determination of Hemoglobin A2. J. Lab. Clin. Med. 1975, 86, Ou, C. N.; Buffone, G. J.; Reimer, G. L.; Alpert, A. J. High-Performance Liquid Chromatography of Human Hemoglobins on a New Cation Exchanger. J. Chromatogr. 1983, 266, Kutlar, A.; Kutlar, F.; Wilson, J. B.; Headlee, M. G.; Huisman, T. H. J. Quantitation of Hemoglobin Components by High-Performance Cation-Exchange Liquid Chromatography: its use in Diagnosis and in the Assessment of Cellular Distribution of Hemoglobin Variants. Am. J. Hematol. 1984, 17, Turpeinen, U. Liquid-Chromatographic Determination of Hemoglobin A2. Clin. Chem. 1986, 32, Fairbanks, V. F. The Common Hemoglobin Variants. Hemoglobinopathies and Thalassemias; Brian C. Decker: New York, 1980; pp Bunn, H. F.; Forget, B. G. Hemoglobin: Molecular, Genetic and Clinical Aspects; Dyson, J., Ed.; W. B. Saunders Company: Philadelphia, 1986; pp Ali, M. A.; Schwertner, E. Hemoglobin A2 Level, A Proposed Test for Confi rming the Diagnosis of Iron Deficiency. Am. J. Clin. Pathol. 1975, 63,

28 Bio-Rad Laboratories, Inc 4000 Alfred Nobel Drive Hercules, CA United States Bio-Rad Laboratorios Brasil Ltda. Rua Alfredo Albano da Costa salas 1, 2 e 3 CEP: Lagoa Santa - MG - Brasil CNPJ: / Tel: (31) /2011 L