CASARIN, Maísa²; TROJHAN, Gabriela Ocampo²; ALVES, Camilla Filippi dos Santos 3 ; SANTOS, Roberto Christ; 3 ZANATTA,Fabricio Batistin 4

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1 AÇÃO DA SOLUÇÃO DE CLOREXIDINA 0,12%, ÓLEOS ESSENCIAIS E TRICLOSAN EM BIOFILME BUCAL FORMADO POR DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE OXIGÊNIO UM ESTUDO PILOTO (2012)¹ CASARIN, Maísa²; TROJHAN, Gabriela Ocampo²; ALVES, Camilla Filippi dos Santos 3 ; SANTOS, Roberto Christ; 3 ZANATTA,Fabricio Batistin 4 Iniciação Cientifica - Fundação de Amparo à pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) 1 Trabalho de Pesquisa _UNIFRA 2 Curso de Odontologia do Centro Universitário Franciscano (UNIFRA), Santa Maria, RS, Brasil 3 Curso de Biomedicina do Centro Universitário Franciscano (UNIFRA), Santa Maria, RS, Brasil 4 Curso de Odontologia da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil maisa.66@hotmail.com RESUMO Comparar, sob aspectos microbiológico, o impacto da solução de clorexidina 0.12%, óleos esseciais e triclosan associado ao gantrez sobre biofilme dental em fragmentos de esmalte bovino em dispositivos intra-orais, quando submetidos a diferentes tensões de oxigênio. Dez voluntários participaram, utilizando um dispositivo intra-bucal contendo discos de esmalte bovinos em superfícies voltadas para o palato e para bucal, 4 dias para acúmulo de placa, e 3 dias para gotejamento das substancias químicas. Após, os discos foram encaminhados para análises microbiológicas. Como resultados, todas as soluções foram melhores que o controle (P<0,05). A clorexidina 0,12% se sobressaiu em ambas às superfícies, enquanto que os óleos essenciais e triclosan associado ao gantrez não se mostraram diferentes. Quando comparados os 2 lados, não foram encontrados diferenças estatísticas (P>0,05). Considerando um cálculo amostral baseado nos resultados deste estudo piloto, há necessidade de acrescentar mais 28 pacientes para realizar-se a avaliação final dos resultados. Palavras-chave: Biofilmes, Clorexidina, Placa dentária. 1. INTRODUÇÃO Modernamente, a placa dental é reconhecida como um biofilme verdadeiro desenvolvido sobre a superfície dental. Em se tratando da cavidade bucal, o biofilme é composto por bactérias em polímeros extracelulares de origem bacteriana e produtos do exsudato gengival e/ ou salivar (PARK e YAACOB, 1994).. Devido à cavidade bucal proporcionar um local adequado para suportar o crescimento de uma variedade distinta de microorganismo, a organização desse biofilme possibilita um sistema incipiente de

2 circulação de nutrientes, podendo ser comparado a uma sociedade bacteriana (COSTERTON, STEWART, GREENBERG, 1999). Os colonizadores iniciais dessa superfície precisam resistir a altas concentrações de oxigênio e, ao mesmo tempo, aos fatores naturais de remoção. Esses microrganismos pioneiros permitem que outros que não possuem adesão direta ao dente possam colonizar a superfície por meio de interações específicas (SBORDONE, BORTOLAIA, 2003), que possibilitam que bactérias com requisitos nutricionais distintos, como aeróbicas e anaeróbicas, possam coexistir no interior do biofilme nos diferentes micro-ambientes presentes (MARSH, 2004). No contexto do biofilme, a resistência aos antimicrobianos e suas repercussões clínicas talvez estejam entre as características mais marcantes dessa comunidade organizada. ZAURA-ARITE, MARLE, CATE, (2001) verificaram pela primeira vez o comportamento do biofilme oral após exposição a uma solução de clorexidina 0,2% utilizando a microscopia a laser confocal. Os autores demonstraram que com o passar das horas, a eficácia da clorexidina foi diminuindo. Ainda, a análise em camadas mostrou que a clorexidina possui ação superficial deixando clara a ineficácia do agente nas camadas mais internas de biofilme com mais de 24h de formação. Achados semelhantes, com a utilização de modelos in situ, foram encontrados por PRATTEN, BARNETT P, WILSON, (1998) e AUSCHILL, HEIN, HELLWIG, et al. (2005). Sabe-se que a remoção mecânica da placa dental com dentifrício é a forma de higiene oral mais comumente empregada pelos indivíduos. No entanto, vários pacientes falham nessa limpeza, situação esta comprovada pelos altos percentuais de placa e sangramento gengival encontrados na população (ADDY, 1986, LAVSTED, MODÉER, WELANDER,1982, SISUN e ALBANDAR, 2005). Dessa forma, o uso de coadjuvantes químicos tem sido estudado para minimizar os hábitos mecânicos deficientes de muitos indivíduos. Dentre eles, encontra-se a solução de clorexidina 0,12%, apresentando bons resultados e considerada atualmente como o padrão ouro para prevenir e reduzir a formação de biofilme dental (ADDY, MORAN, WADE, 1994). Outro coadjuvante que vem sendo analisado é o triclosan, que tem demonstrado inibição da placa bacteriana e da gengivite (BARKVOLL, ROLLA, 1994, WORTHINGTON, BLINKHORN, PETRONE et al.,1993). Da mesma forma, PAN, BARNETTE, COELHO (2000) avaliaram em um estudo in situ, e comprovaram a eficácia dos óleos essenciais, assim como analises in vitro, representaram ter atividade bactericida significativa contra bactérias localizadas dentro do biofilme (PAN, HARPER, RICCI-NITTEL, et al. 2010). Por conseguinte, a despeito de existirem alguns estudos que verificaram a eficácia da clorexidina 0,12% sobre biofilme dental, há escassez de evidências da ação de óleos essências e triclosan em biofilmes formados sob diferentes tensões de oxigênio. Portanto, o

3 presente estudo busca investigar o efeito antimicrobianos da clorexidina 0,12% (Periogard ), triclosan (0,03%) associado ao copolímero gantrez (0,20%) (Plax ) e dos óleos essenciais (0.064% thymol, 0.092% eucalyptol, 0.060% methyl salicylate and 0.042% menthol) (Listerine ) sobre biofilme dental in situ. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Critérios de Elegibilidade Foram selecionados 10 acadêmicos do curso de Odontologia do Centro Universitário Franciscano (UNIFRA),com bom estado de saúde geral, média de idade de 20 anos +/- 1,24. Os indivíduos que foram diagnosticados como respiradores bucais e/ou que utilizaram antibiótico/anttinflamatório nos três meses anteriores ao estudo e/ou possuíam periodontite e/ou eram fumantes, e/ou apresentavam qualquer tipo de alergia aos componentes das substâncias químicas foram considerados como não elegíveis e não participaram do estudo. 2.2 Confecção dos dispositivos Os dispositivos intra-bucais foram confeccionados sobre modelos de gesso da arcada superior, obtido por meio de moldagens com alginato (avagel ) e vazamento em gesso especial (herodente ). Para confecção dos corpos de prova foram obtidos 80 dentes incisivos bovinos autoclavados, dentes com trincas ou sulcos descartados. Para a conformação superficial dos discos, a medida padrão aferida foi de 5mm X 5mm X 1mm, com uso de paquímetro digital (Jomarca ). Os discos foram previamente autoclavados, e condicionados em um recipiente adequado até seu uso. 2.3 Usos do dispositivo in situ Aos voluntários foi instruído utilizar, desde dois dias antes do início da pesquisa, um dentifrício sem composto ativo e sem flúor, manipulado em farmácias, nenhum anti-séptico foi utilizado pelos sujeitos do estudo. Foi solicitado que não removessem os dispositivos, exceto durante a escovação e para a alimentação, quando o mesmo deveria ser acondicionados em soro fisiológico durante o menor período possível e para a aplicação das soluções antimicrobianas. Aos voluntários foi solicitado que aplicassem a solução de clorexidina 0,12% (Periogard ) em dois discos do lado esquerdo da placa (Um disco voltado à cavidade bucal e outro por palatino), óleos essenciais (Listerine ) no lado esquerdo do dispositivo, nos discos mas a frente (Um disco voltado à cavidade bucal e outro por palatino)

4 e Trilosan associado ao Gantrez (Plax ) do lado direito da placa nos discos mais a frente (Um disco voltado à cavidade bucal e outro por palatino). Os outros dois discos de esmalte (dois voltados à cavidade bucal e dois por palatino) servirão como controle e não seria utilizada nenhuma solução antimicrobiana. Os voluntários receberam um protocolo auto-explicativo e orientados de como usar o dispositivo. Foi entregue aos mesmos, 3 vidros enumerados de 1 a 3 com tampa rosqueavel possuindo conta gotas com as soluções avaliadas. Também receberam 1 creme dental, sem composto ativo e sem flúor, e um recipiente de plástico com tampa rosqueável, a qual contava o soro fisiológico. 2.4 Procedimentos de treinamento e calibragem Previamente ao início do estudo ocorreu um processo de treinamento para os parâmetros da confecção dos discos de esmalte. Para o processo de treinamento, a examinadora avaliou o tamanho dos discos com um paquímetro digital, sendo selecionados 10 discos, e numerados de 1 a 10 na sua superfície inferior, no dia 1 foi feito o primeiro exercício onde a analisadora deu os valores analisados dos respectivos 10 discos, no dia 2, os discos foram escolhidos aleatoriamente e a examinadora avaliou os diâmetros novamente de forma cega (sem visualizar o numero na parte inferior, para evitar vieses) juntamente com outro avaliador que terá os resultados da primeira análise, e assim sucessivamente até que haja concordância entre os resultados. O resultado da atividade será comparado através do teste estatístico de correlação intra-classe. Para os parâmetros de contagem de células viáveis, a examinadora analisou placas de petri contendo UFCs e realizou a contagem juntamente com um examinador padrão ouro, até que ocorreu concordância entre os resultados. Após, o examinador realizou a contagem de 5 placas, e repetiu de forma cega e aleatória a análise, 1 hora após. Os resultados dos dois exames foram comparados através do teste estatístico Kappa. Após um resultado de calibragem acima de 0.61, a examinadora iniciou as contagens. 2.5 Análise da vitalidade bacteriana Após a remoção dos dispositivos da cavidade bucal, os discos bovinos foram colocados em tubos com tampa de rosca contendo 5ml de solução salina, esses tubos foram mantidos em um sonicador por 15 minutos, afim de desprender as bactérias aderidas na superfície do esmalte, depois ocorreu uma diluição 1:100 em salina estéril onde foi retirada uma alíquota de 10 µl e a partir de então foi utilizado o método de espalhamento em placa com alça Ed Dringalski, para que as colônias somente se desenvolvessem na

5 superfície e não entrassem em contato como agar fundido. A placa de petri possuiu um agente solidificante, denominado agar nutriente. O agar é um polissacarídeo complexo obtido a partir de algas marinhas, que possui propriedades muito importantes, tornando-o essencial para a microbiologia (TORTORA, FUNKE, CASE, 2005). Por conseguinte essas placas de petri foram incubadas por 24h a 37ºC. A contagem das colônias foi realizada após o fechamento das 24h de incubação, e com uma regra de três efetuou-se o calculo de UFCs por µl. A contagem foi realizada de forma cega, onde um analisador entregava as placas, não sendo cego, e o examinador realizava a contagem de forma cega. Uma análise estatística com o teste One way Anova e teste Post hoc de Tukey foi efetuada para estabelecer uma comparação intergrupos, e o teste estatistico Mann Whitney foi realizado para comparações dentro do grupo entre lado bucal e palato. O nível de significância foi estabelecido em 5%. 3. RESULTADOS e DISCUSSÃO A tabela 1 mostra a contagem das unidades formadoras de colônia por microlitros (UFC/μl), comparando a quantidade de bactérias viáveis em relação ao meio voltado para o bucal e o palato com os coadjuvantes químicos e o controle, juntamente com seus desviospadrão (dp). Tabela 1 Médias e desvios-padrão das contagens das Unidades formadoras de colônia de acordo com os grupos experimentais Contagem (UFC/μl) Total Dp Bucal Dp Palato Dp p # Clorexidina 0,12% 5030 a a a Óleos Essenciais 7830 a b b Triclosan +Gantrez 7180 a b b Controle b c c P* < P* -Teste estatístico One Way Anova e teste Post hoc de Tukey(Comparação intergrupos);letras minúsculas comparações intergrupos (a-b diferenças estatísticas); p # - Teste estatístico Mann Whitney (Comparações dentro do grupo entre lado bucal e palato); Considerando o total da média entre as unidades formadoras de colônias no meio bucal e no palato, verificou-se que os efeitos dos óleos essenciais, clorexidina 0,12% e triclosan+gantrez resultaram numa diminuição significativa das UFC. Já considerando o meio bucal, foi observado o melhor resultado com Clorexidina 0,12% apresentando diferenças significativas de Óleos Essenciais (0.064% thymol, 0.092% eucalyptol, 0.060% methyl salicylate and 0.042% menthol) e Triclosan (0,03%) associado ao copolímero Gantrez (0,20%), os quais não apresentaram diferenças estatísticas. O controle, por sua vez, apresentou a maior contagem de UFC, com diferenças significativas frente aos demais agentes. Quando a avaliação foi realizada nos discos localizados no palato, a mesma

6 tendência constatada no lado bucal foi verificada. Já quando a ação das soluções nos discos localizados no palato e no lado bucal foram comparadas, não foram observadas diferenças significativas, a despeito de ter sido observado uma tendência a maior eficácia nos discos localizados no lado bucal. Diferentes estudos vêm sendo realizados, sejam eles in vivo, in situ ou in vitro, com metodologias distintas, para verificar a real eficácia da nova gama de substâncias químicas lançadas rotineiramente no mercado. Com esse objetivo o presente estudo foi realizado através de uma metodologia in situ, com análise in vitro. Para ZERO (1995), os modelos in situ têm por objetivo controlar variações para minimizar possiveis impactos com relevância clínica. O objetivo do presente estudo foi comparar, sob aspecto microbiológico, o impacto da clorexidina 0,12% solução (Periogard ), de óleos esseciais (Listerine ) e de triclosan (0,03%) + gantrez (0,20%) (Plax ) sobre biofilme dental em fragmentos de esmalte bovino, posicionados em dispositivos intra-orais, em diferentes tensões de oxigênio. Considerando o desfecho avaliado, os resultados demonstraram diferenças significativamente melhores da clorexidina 0,12% na redução da quantidade de microrganismos viáveis presentes no biofilme formado, tanto nas superfícies voltadas para o palato como nas voltadas para o meio bucal, comparando com os demais agentes e com o controle. A clorexidina é uma bisbiguanida, a qual seu compósito é uma base forte e dicatiônica com níveis de ph acima de 3,5 (ADDY e MORAN,1983). É extremante interativa com os ânions, apresentando substantividade de 12 horas, isto é, capacidade de reter-se em determinados sítios, sendo liberada de forma gradativa, devido a sua natureza dicatiônica. Ademais, este agente apresenta amplo espectro antimicrobiano, o qual possui ação contra Gram-positivos, Gram-negativos, fungos e alguns vírus. Desta forma, os resultados do presente experimento justificam-se possivelmente pela característica do agente e pela sua substantividade, uma vez que todas as substâncias foram gotejadas em um intervalo de tempo de 12 horas, período este suficiente para a clorexidina, mas longo demais para o triclosan e os óleos essenciais, os quais apresentam substantividade relativamente menor e desta forma, após aproximadamente 4-5 horas sua ação seria bastante reduzida. AUSCHILL, HEIN, HELLWIG, et al. (2005), em um estudo com dispositivo in situ e analise com microscopia confocal, verificaram a aplicação da solução de clorexidina 0,2%, de fluoreto amino-estanhoso e de água. Os resultados mostraram que a vitalidade bacteriana foi reduzida em 64% quando comparada com as soluções com água, sem haver diferença estatística significante entre a clorexidina e o fluoreto amino-estanhoso. Apesar dos dois estudos citados demonstrarem a eficácia da clorexidina, não se pode inferir a partir dessas evidências ação desses agentes sobre o biofilme já formado, devido às soluções terem sido usadas concomitantemente ao uso do dispositivo in situ. Neste sentido, o nosso

7 experimento traz uma informação nova, pois compara a ação dos agentes sobre biofilme previamente formado in situ. Considerando a extrapolação clínica, esta é uma situação experimental ideal uma vez que se observa na população altos percentuais de biofilme dental estabelecido (LAVSTED, MODÉER, WELANDER, 1982, ADDY, 1986, SISUN e ALBANDAR, 2005) e, coloca nosso experimento com maior validade externa. Portanto, nossos resultados além de reforçarem o efeito da clorexidina sobre biofilme estabelecido, demonstram a reduzida ação do triclosan e dos óleos essenciais quando utilizados 2 vezes ao dia em sítios com biofilme com 96 horas de formação. ZAURA-ARITE, MARLE, CATE, (2001) verificaram em um estudo in situ com microscopia confocal a eficácia da clorexidina 0,2%. Os autores demonstraram que a clorexidina afetou somente as camadas mais externas do biofilme formado em 24 e 48 horas, sugerindo falta de penetração do agente antimicrobiano. Há de se destacar que neste experimento, a clorexidina foi utilizada somente uma vez, ao passo que nossa metodologia utilizou biofilme mais velho (96 horas), mas a clorexidina foi utilizada várias vezes. Desta forma, pode-se suspeitar que em cada aplicação da clorexidina, uma camada superficial é atingida e, portanto, as superposições de camadas atingidas é que provavelmente expliquem a eficácia do agente, conforme demonstramos no nosso experimento. Esta hipótese pode ser reforçada pelos achados de ZANATTA, ANTONIAZZI, RÖSIN, (2007) que demonstram uma redução na quantidade de biofilme dental clinicamente detectável após 3 semanas de bochechos de clorexidina 0,12% em superfícies dentais com biofilme previamente formado (96 horas de formação). Por outro lado, há evidências de que os óleos essenciais apresentam boa penetração no biofilme dentário e exercem ação bactericida contra bactérias localizadas no interior do biofilme (PAN, BARNETTE, COELHO, 2000). Em outro experimento, PAN, HARPER, RICCI-NITTEL, et al. (2010), após compararem a eficácia de óleos essências, clorexidina 0,12%, formulações de cetilpiridínio e fluoreto amino-estanhoso, demonstraram que os óleos essências e a clorexidina foram significativamente os mais eficazes para eliminar as bactérias do biofilme em comparação com as outras substancias, sem apresentar diferenças entre elas. Ambos os experimentos utilizaram para a análise a microscopia confocal a laser, técnica esta que permite a visualização da ação dos agentes na vitalidade bacteriana sem a ruptura do biofilme. Em nosso experimento,o disco bovino contendo biofilme foi imerso em uma solução salina e desestruturado em um sonicador por 15 minutos e, após, foi realizada uma diluição seriada, semeado em ágar nutriente e incubado a 37ºC por 24 horas, para após realizar a contagem das UFCs. Entretanto, previamente ao nosso estudo, buscamos verificar por meio de um estudo piloto o tempo de sonicação eficaz para desprender o biofilme sem impactar significativamente na sobrevivência das espécies microbianas e, obtermos portanto um valor confiável das UFCs.

8 Contudo, sabe-se que o padrão ouro para análise do biofilme é a microscopia confocal a laser, pois a mesma visualiza amostras de biofilme em seu estado natural hidratado (MARSH, 2010), além de permitir análise em camadas sem a ruptura das mesmas. É considerada uma ferramenta importante na pesquisa biológica, na análise química e de materiais, pois permite a localização tridimensional de estruturas e moléculas marcadas com fluorocromos, além de diferenciar através da cor os microrganismos viáveis, e permitir a visualização da distribuição espacial de espécies dentro dos biofilmes orais. Assim, a diferença de metodologia pode explicar, em parte, a diferença entre os nossos achados e os de PAN, HARPER, RICCI-NITTEL (2010). Os óleos essenciais têm a capacidade de romper a membrana celular de bactérias, resultando em morte celular. Também, causam desnaturação de proteínas e inibem a atividade enzimática de microrganismos, podendo, inclusive, extrair endotoxinas de patógenos Gram-negativos, diminuindo a patogenicidade da placa. Já o triclosan é um antimicrobiano não iônico pertencente aos fenóis (ADDY e MORAN, 1983). Tem moderada atividade antimicrobiana e apresenta substantividade de aproximadamente cinco horas, exceto quando o citrato de zinco, ou o copolímero éter polivinilmetil é adicionado, aumentado sua substantividade. O fato de não termos encontrado diferenças significativas entre a ação dos óleos essenciais e do triclosan pode ser hipotetizada, portanto pelo possível efeito do copolímero gantrez no aumento da substatividade do triclosan, melhorando desta forma sua eficácia. Neste sentido, o presente trabalho também apresenta outra informação nova, a despeito da clorexidina e dos óleos essenciais estarem sedimentados como as melhores opções anti-placa e anti-gengivite por meio de evidências clínicas (GUNSOLLEY, 2010), faltam evidências que comparem a ação do triclosan associado ao copolímero Gantrez com óleos essenciais em biofilme dental formado, formulações estas presentes em dois antis-sépticos amplamente comercializados no mercado nacional. O crescimento do biofilme proporciona uma serie de vantagens, como proteção contra microrganismos competitivos, contra fatores ambientais, tais como mecanismos de defesa do hospedeiro, e contra substâncias tóxicas do meio, sejam elas agentes químicos ou antimicrobianos. Para SOCRANSKY e HAFFAJEE (2005), o habitat exerce forte efeito sobre a composição, atividades metabólicas e fatores de virulência dos microrganismos colonizadores, justificando modificações na microbiota supra e subgengival. Por esse motivo, tentamos observar diferenças entre os discos voltados para o palato e para o bucal. Nossos resultados mostraram uma tendência de maior eficácia dos agentes no lado bucal, sem, contudo demonstrar diferenças significativas entre o lado bucal e palatino. Devido a essa tendência, nossa hipótese é que nos lados palatinos o biofilme forma-se com maior quantidade de células bacterianas e, possivelmente, com implicações nas proporções entre

9 diferentes espécies. Possivelmente não encontramos diferenças significativas pela falta de poder estatístico para detectar estas diferenças e, portanto, pretendemos esclarecer essas dúvidas em futuros experimentos, bem como verificarmos a ação desses agentes em biofilmes de diferentes idades. 4. CONCLUSÕES Considerando as limitações inerentes a metodologia utilizada pode-se concluir que, frente a biofilmes dentais com 96 horas de formação, a clorexidina 0,12% mostrou a melhor eficácia. Os óleos essenciais e o triclosan + Grantrez não se mostraram diferentes. Ainda, apesar da tensão de oxigênio parecer influenciar na eficácia dos agentes, não foram observadas diferenças significativas considerando locais com diferentes tensões de oxigênio. Portanto, a partir deste estudo piloto pôde-se padronizar esta metodologia e realizar um cálculo amostral. Assim, considerando as menores diferenças de UFCs/µl e desvios-padrão entre os produtos testados [clorexidina (5030±3881) e triclosan + gantrez (7180±5402) ], o β de 80% e α de 5%, foi estimado 76 discos no total para cada grupo, ou seja, 38 pacientes no total. Considerando que este estudo piloto avaliou 10 pacientes, há necessidade de inclusão de mais 28 pacientes para a análise dos resultados finais. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ADDY M. Chlorhexidine compared with other locally delivered antimicrobials: a short review. Journal of Clinical Periodontology, v.13, n.10, p , ADDY M.; MORAN J. Comparison of plaque accumulation after topical application and mouth rinsing with chlorhexidine gluconate. Journal Clinical Periodontoloy, v.10, n.1, p.69-71, ADDY, M,; MORAN J.; WADE W. Chemical plaque control in prevention of gingivitis and periodontitis. In: LANG, N.P. & KARRING, T. (Ed.). Proceedings of the 1st European Workshop on periodontology. London: Quintessence, p AUSCHILL, T. M.; HEIN, N.; HELLWIG E.; FOLLO M.; SCULEAN A.; ARWEILER N.B. Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation. Journal Clinical Periodontology, v.32, n.2, p , BARKVOLL P.; ROLLA G. Triclosan protects the skin against dermatitis caused by sodium lauryl sulphate exposure. Journal Clinical Periodontology, v.21, n.10, p.717-9, COSTERTON, J. W.; STEWART, O. S.; GREENBERG, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science, v. 284, n.5418, p , GUNSOLLEY, J.C. Clinical efficacy of antimicrobial mouth rinse. Journal of dentistry, v.38, p.6-10, 2010.

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