Fungos patogénicos: Um risco não avaliado em zonas balneares? Novas perspectivas da analise da qualidade microbiologica de areias em Portugal

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1 Fungos patogénicos: Um risco não avaliado em zonas balneares? Novas perspectivas da analise da qualidade microbiologica de areias em Portugal João Brandão *, Helena Parada, Raquel Sabino, Cristina Veríssimo, Clélia Costa, Filipa C Ferreira, Raquel Rodrigues, Cecília Silva, Maria Ana Cunha *Project Manager

2 Uma praia na regiao de Lisboa e Vale do Tejo num dia de novoeiro no Verão Find wally!

3 Exemplos de infecções fúngicas transmissíveis pela areia a individuos saudáveis

4 População de risco acrescido para infecções fúngicas, comparativamente à população geral, sem doenças concomitantes Crianças Grávidas Idosos

5 Passado 1989 grupo de Micologia começou a pesquisar fungos em areias de praias em colaboração com a Direcção Geral de Saúde. Durante10 anos, varias praias foram analisadas quanto à flora fúngica por varias metodologias e abordagens.

6 Organização Mundial de Saúde, 2003, in Guidelines for safe recreational water environments, p118. From a recreational viewpoint, sand beaches are sought after. Especially in higher latitudes, a significant percentage of time is spent on the beach itself rather than in the water. A number of genera and species that may be encountered through contact with sand are potential pathogens. Accordingly concerns has been expressed that beach sand may act as reservoir of vectors of infection.

7 Projecto # 1 & 2 Estrutura/Metodos/Parâmetros/Padrões &

8 Projecto 1: Estrutura da análise a areias de praias, incluindo paranteros e metodologias associadas: Qualidade microbiológica de areias de praias litorais Participantes: Associação Bandeira Azul da Europa, The Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, Direcção Geral de Saúde, Instituto do Ambiente, Instituo da Água, Camara Municipal decascais, Câmara Municipal de Viana do Castelo

9 5 Regiões Colheitas Bimensais durante 13 meses 3 praias por região: 1 Praia galardoada com a Bandeira Azul 1 Praia sem interferência humana directa 1 Praia com água documentada como de má qualidade 210 amostras de areia 105 Amostras de água

10 Distribuição fúngica em água do mar, areia seca e areia molhada Comentário: Apesar da luz directa do sol na superficie da areia, of fungos são bastante resistentes sobrevivendo bastantes semanas à desidratação, como verificado ja em dois trabalhos publicados aqui não referenciados.

11 Projecto 2: ICREW Improving Coastal and REcreational Waters for all Financiamento Europeu (8M ), 5 Estados-membro, 19 instituições*, 7 acções piloto**

12 *Instituições Reino Unido Environment Agency (EA) Mersey Basin Campaign (MBC) Blackpool Borough Council (BBC) Preston City Council (PCC) ICREW watersports website Northwest Development Agency Portugal Instituto do Ambiente (IA) DRAOT de Alentejo (DRAOT) Instituto Nacional de Saude Dr. Ricardo Jorge Instituto Superior Tecnico Direccao Geral da Saude Instituto da Agua (INAG) Sub-Regiao de Saude de Portalegre França Conseil Regional de Bretagne Centre d Etude et de Valorisation des Algues (CEVA) IFREMER Direction regionale des sanitaires et socials de Bretagne (DRASS) SAUR France Region Ouest Espanha Instituto Tecnologico de Canarias (ITC) Centro de Investigacion Fomento y Aplicacion de las Nuevas Tecnologias del Agua Ireland University College Dublin

13 **Acções Piloto: PA 1 - Sampling and data review PA 2 - Resolving diffuse pollution PA 3 - Developing pollution source tracking PA 4 - Forecasting bathing water quality PA 5 - Re-identification of recreational waters PA 6 - Sustainable sewage solutions PA 7 - Understanding and managing algae

14 Levedura n id. Candida sp. Rhodotorula sp. Cryptococcus sp. Aspergillus fumigatus Aspergillus niger Aspergillus sp. Chrysosporium sp. Fusarium sp. Scedosporium sp. Scopulariopsis sp. Scytalidium sp. Trichophyton sp. Epidermophyton sp. Microsporum sp. Absidia sp. Acremonium sp. Alternaria sp. Arthrinium sp. Aureobasidium sp. Beauveria sp. Bipolaris sp. Botrytis sp. Chaetomium sp. Cladosporium sp. Curvularia sp. Cylindrocarpon sp. Dreschlera sp. Epicoccum sp. Eurotium sp. Geotrichum sp. Graphium sp. Clonostachys sp. Monilia sp. Mucor sp. Myriodontium sp. Neosartorya sp. Nigrospora sp. Ochroconis sp. Paecilomyces sp. Penicillum sp. Phoma sp. Rhizomucor sp. Rhizopus sp. Sporotrichum sp. Syncephalastrum sp. Trichoderma sp. Ulocladium sp. Verticillium sp. Wallemia sp. Micélio estéril Stachybotrys sp. Phialophora sp. Trichosporon sp. Gliocladium sp. Abundância relativa (%) Abundância relativa de fungos na areia seca de praias litorais e interiores por género e/ou espécie Abundância relativa das diferentes espécies na Areia Seca 35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% espécies

15 Parâmetros Micológicos 1/2 Leveduras: Indicadores de contaminação fecal e matéria orgânica Fungos Filamentosos potencialmente patogénicos e alergogénicos Dermatófitos: Indicadores de presença animal, incluindo humanos

16 Parâmetros Micológicos 2/2 Leveduras (géneros Candida, Cryptococcus e Rhodotorula), Fungos Filamentosos potencialmente patogénicos e alergogénicos (géneros Aspergillus, Fusarium, Scopulariopsis, Scedosporium, Chrysosporium, Scytalidium, Histoplasma, Coccidioides, Exophiala, Fonsecaea, Phialophora, e outros de relevância clínica com contagens significativas (> 500 cfu/g)). Dermatófitos (géneros Microsporum, Epidermophyton etrichophyton)

17 Parâmetros Bacteriológicos Coliformes Escherichia coli Enterococos

18 Factores que influenciam positivamente a qualidade das areias das praias Remoção de lixo remoção frequente de lixo das areias e zonas circundantes; Recipientes para o lixo Tantos contentores quanto necessário e apropriado ao longo da praia para facilitar a sua utilização; Descontaminação das areias Baseado na experiencia de um municipio q o faz regularmente à base de iodo (não expressa a opinião dos autores desta comunicação); Zonas contíguas Identificação e descontaminação de zonas contiguas a praias com altos níveis de contaminação microbiológica

19 Factores que influenciam negativamente a qualidade das areias das praias Sobreutilização por parte de utilizadores Acesso a animais de estimação Acumulação de lixo Abandono de restos de pesca nos areais Presença ou visita noturna de roedores e outros animais não domesticados

20 Projeto # 3 Consistência dos parâmetros e seus valores de referência

21 Programa de monitorização da qualidade das areias Promoção: Associação Bandeira Azul da Europa Laboratorios: INSA & APA Duração: Nº de praias monitorizadas: de 61 em 2006 até 81 em 2010 Nº de amostras de areia analizadas: 1206 Nº de praias monitorizadas durante 5 anos consecutivos: 33 (correspondendo a 495 de 1206 amostras)

22 Algarve 2006 x 2010 Amostras que excederam pelo menos um dos valores de referência Algarve Beaches Algarve Beaches 30% 30% 29% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 17% 13% 27% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 18% 15% Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Gestores de praias foram instruidos como controlar niveis microbiologicos Resultado: Redução drástica dos niveis de contaminanets da primeira para as amostragens seguintes após o primeiro de curso do projecto. Vide 2006 e 2010

23 Statistical review of the 33 beaches monitored all 5 years

24 Alguns resultados 60.4% das amostras revelaram-se positivas para as espécies fúngicas de referência 25.2% positivas para os três parâmetros bacterianos 33.3% negativas para todos os parâmetros 20.2% positivas para ambos os conjuntos paramétricos (fungos e bactérias) Leveduras e dermatófitos tendem a aumentar presença ao longo do verão Encontraram-se relações interessantes (ex. Scopulariopsis spp e Dermatofitos leveduras e coliformes)

25 Revisão dos limites propostos com base em percentis 95 Parâmetros Micológicos: 1. Leveduras 15 ufc/g 2. Fungos Filamentosos potencialmente patogénicos e alergogénicos 17 ufc/g 3. Dermatófitos 8 ufc/g Parâmetros Bacteriológicos: 1. E. coli 25 ufc/g 2. Enterococos 10 ufc/g

26 Actualmente 1/2 Prestamos o serviço à comunidade Testam-se métodos moleculares de detecção de dermatófitos para responder mais rapidamente às análises (leva actualmente 3 semanas no mínimo)* Extensão deste tipo de análise a espécies muito específicas de fungos, bactérias, virus (só em areias molhadas/água) e parasitas, principalmente em areias importadas de outras regiões geográficas para reposição de costa) Networking com outros grupos de investigação no tema

27 Actualmente 2/2 Programa de monitorização terminou com participação de cerca de ¼ das zonas balneares designadas em Portugal FEE Não avançou com integração do critério-guia para atribuição do galardão Bandeira Azul Setembro 2011 Workshop à porta fechada em Michigan City para debater contaminações areia-agua e agua-areia publicação em fase de conclusão) : INSA avança com análise molecular e detecção de vírus e parasitas 2012 Workshop para debater parâmetros e indicadores (publicação em preparação) 2013 lançamento de rede laboratorial com reunião annual e ensaios laboratoriais

28 Análise molecular? dhplc de DNA fúngico total extraído directamente da areia? Detecção de DNA de dermatófitos por PCR/qPCR em vez da contagem e identificação de colónias viáveis? Identificação de leveduras por AFCE (Automated Fluorescence Capilary Electrophoresis)?

29 Analise populacional por dhplc

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31 Detecção molecular de dermatófitos Recuperação de celulas pouco eficiente 99% do que está na areia, continua na areia Extracção directa de DNA de areia possível e funcional PCR de DNA de dermatófitos não dá sinal em amostras reais por falta de DNA (baixa sensibilidade solução: qpcr (vale o custo?)

32 AFCE - Automated Fluorescent Capillary Electrophoresis

33 AFCE por espécie Fungal Presence in Archival Settings: Assessment Using Classic Culturing and Molecular Biology Methods.Presentation at the ICOM-CC 16thTriennial Conference-Cultural Heritage / Cultural Identity: the Role of Conservation.Lisbon, Septemeber, 2011 e submetido para publicação

34 AFCE amostra mista

35 AFCE amostra mista

36 Análise Molecular - conclusão Detecção de dermatófitos por PCR em tempo real: única vantagem e em caso de urgência de resposta análise qualitativa não quantitativa

37 Algarve