NOME: NOTA: TURMA: 1º período ESTUDO DIRIGIDO TÍTULO: TÉCNICAS DE LABORATÓRIO ASSUNTO: MICROSCÓPIO ÓPTICO I- OBJETIVOS

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1 1º período GÊNESE E DESENVOLVIMENTO: BIOLOGIACELULAR E MOLECULAR NOTA: TÍTULO: TÉCNICAS DE LABORATÓRIO ASSUNTO: MICROSCÓPIO ÓPTICO ESTUDO DIRIGIDO I- OBJETIVOS 1. Conhecer as medidas utilizadas no estudo das células. 2. Diferenciar poder de resolução de poder de aumento. 3. Comparar o poder de resolução do olho humano com o poder de resolução dos microscópios óptico e eletrônico. 4. Enumerar as principais funções de um microscópio. 5. Saber as características da imagem fornecida pelo microscópio óptico. 6. Diferenciar um microscópio óptico de um eletrônico quanto ao mecanismo de formação de imagens. 7. Descrever e reconhecer a utilidade das técnicas de observação "in vivo", "in vitro", esmagamento, esfregaço, fixação, desidratação, clareamento, inclusão, corte, coloração e imersão. II. INTRODUÇÃO Medidas usadas no estudo das células A maioria das células é microscópica. Sendo a célula pequena e as estruturas que ela contém menores ainda, há necessidade de se estabelecerem unidades de medidas apropriadas. O sistema mais utilizado para medidas é o sistema métrico. O metro é a unidade básica e em função dele derivamos as demais unidades de medida. Para medir objetos ou estruturas pequenas, empregamos submúltiplos do metro. Em citologia, os principais submúltiplos são: milímetro (mm) = metro dividido por mil: 1 mm = 10 3 m ou 0,001 m; micrômetro ( m) = metro dividido por milhão: 1 m = 10 6 m ou 0, m; nanômetro (nm) = metro dividido por bilhão: 1 nm = 10 9 m ou 0, m. Microscópio e poder de resolução A capacidade de distinguir dois pontos muito próximos um do outro chamamos de poder de resolução. Se dois pontos estiverem separados por uma distância igual ou superior a 0,1 mm, o olho humano será capaz de distingui-los. Sendo a distância menor que 0,1 mm, veremos apenas um único ponto, isto é, a imagem perde a nitidez. Por isto dizemos que o poder de resolução do olho humano é da ordem de 0,1 mm. O microscópio óptico comum é um instrumento formado por um sistema de lentes com poder de resolução cerca de 500 vezes maior que o do olho humano, sendo da ordem de 0,2 m. Com esse aumento podemos ver as células e algumas de suas estruturas internas. Assim, através do microscópio óptico, podemos aumentar a imagem de um objeto em cerca 40 até vezes, sem que ele perca a nitidez. Com o advento do microscópio eletrônico, o poder de resolução foi aumentado cerca de vezes em relação ao microscópio óptico. Os microscópios eletrônicos têm poder de resolução próximo a 2 Å, cerca de vezes maior que o do olho humano. É importante salientar a diferença entre poder de resolução e poder de aumento. Se você ampliar várias vezes uma mesma fotografia comum, a imagem aumenta, mas os pontos separados por menos de 100 m continuarão aparecendo como um só ponto borrado. Neste caso, a imagem é ampliada sem, contudo, melhorar sua resolução. Já com o microscópio, é diferente: ele nos permite observar estruturas ampliadas com resoluções maiores. Desta forma, podemos concluir que esse aparelho tem duas atribuições ou funções: ampliar a imagem e aumentar o poder de resolução do olho humano. Para que possamos observar um objeto qualquer através do microscópio óptico, este objeto precisa ser atravessado por um feixe de luz. Daí falarmos que no microscópio óptico a imagem é formada por transparência. Já com o microscópio eletrônico (como o próprio nome indica), em vez de feixes de luz, empregam-se feixes de elétrons. As áreas que permitem melhor transmissão de elétrons aparecem claras, enquanto as áreas que absorvem ou refletem os elétrons, aparecem escuras. Desta forma, objetos a serem observados em microscópios devem ser bem finos para permitirem que a luz os atravessem, ou mais finos ainda para permitirem que os feixes de elétrons os atravessem. 1 5

2 Microscópio óptico e características da imagem O sistema de lentes que compõe o microscópio óptico (M.O.) fornece uma imagem ampliada, invertida (de cabeça para baixo) e espelhada (invertida direitaesquerda). Calcula-se o aumento da imagem obtida ao M.O. multiplicando-se o valor do aumento da ocular pelo valor do aumento da objetiva. Geralmente as oculares proporcionam um aumento de 10x (10 vezes), enquanto as objetivas, de 4x, 10x, 40x e 100x. Desta forma, ao usarmos a objetiva de 4x, obteremos uma imagem ampliada em 40x; com a objetiva de 10x, teremos uma imagem ampliada em 100x e assim por diante. A objetiva de 100x é chamada de imersão e seu uso deve ser acompanhado de óleo de imersão, que corrige o desvio de luz causado pelo elevado índice de refração da lente, além de fornecer um meio adequado para visualização, sem que ocorra atrito entre a lâmina e a objetiva de 100x. Observação "in vivo" e "in vitro" Células íntegras vivas, com todos os seus componentes funcionando, podem ser observadas no microscópio óptico, no próprio organismo ao qual pertencem. Isso acontece, por exemplo, quando observamos protozoários e algas microscópicas presentes em uma gota de água retirada de um lago ou ainda células da cauda de um girino. Diz-se, neste caso, que a observação é "in vivo". Também podemos observar ao microscópio óptico células íntegras vivas, porém fora do organismo de origem. Neste caso, dizemos que a observação é "in vitro". Para tal, as células precisam ser mantidas em meios nutritivos (chamados meios de cultura) que possibilitem sua sobrevivência e proliferação. Essa técnica de manutenção de células é chamada cultura de tecidos. No entanto, a maioria das células e suas estruturas internas é incolor (exceção feita aos cloroplastos das células vegetais). Desta forma, para observarmos tais células ou evidenciarmos determinadas estruturas internas, precisaremos utilizar artifícios técnicos que possibilitem tal observação e análise. Para isso, podemos usar certos corantes em altas diluições que se acumulam em tecidos ou porções especiais da célula sem exercerem ação nociva sobre a mesma os chamados corantes vitais. É o caso, por exemplo, do verde-janus B, que serve para evidenciar a mitocôndria, uma das estruturas celulares. Mesmo com tais artifícios, a observação de células íntegras vivas, tanto "in vivo" quanto "in vitro" apresenta algumas limitações: não permite um estudo prolongado e nem que se guarde o material que está 2 5

3 sendo examinado. Desta forma, se precisarmos de observações mais cuidadosas e detalhadas em microscopia, precisamos utilizar técnicas que permitam obter preparados suficientemente finos e que possam observados e guardados por longo tempo, sem sofrerem alterações. Algumas técnicas de observação 1. Esmagamento Consiste em colocar um pequeno fragmento de tecido entre uma lâmina de vidro e uma lamínula, fazendo-se leve pressão com o polegar, a fim de espalhar e afastar as células para que possam ser facilmente atravessadas pelos raios luminosos. É uma técnica usada quando se quer examinar tecidos cujas células estão fracamente aderidas como, por exemplo, células da extremidade das raízes de plantas. 2. Esfregaço Esse método é muito usado para observar células que estão mergulhadas em um meio líquido, como células do sangue, bactérias, secreções etc. Coloca-se uma gota de sangue na extremidade de uma lâmina disposta sobre uma bancada (na horizontal). Com a ajuda de uma outra lâmina colocada em ângulo aproximado de 45 em relação à primeira, toca-se a gota de sangue e movimenta-se a lâmina oblíqua sobre a lâmina horizontal (que deve estar imobilizada com a mão esquerda do operador) de uma extremidade a outra, de maneira a espalhar o sangue por toda sua borda, como mostrado na figura ao lado. Após secagem do líquido, as células que permanecem aderidas ao vidro da lâmina podem ser observadas ao microscópio óptico. O esfregaço deve ficar suficientemente fino para que os raios luminosos possam atravessá-lo. Nesta técnica não se costuma cobrir os esfregaços com lamínula. 3. Fixação, desidratação, clareamento, inclusão e corte Consiste em obter cortes finos de tecidos ou órgãos. Esse método é mais trabalhoso, pois para obter o corte é necessário preparar o tecido ou órgão. As principais etapas são descritas a seguir. Minutos após a retirada de um fragmento de um tecido ou órgão, começam a acontecer fenômenos de autólise (auto-destruição das células) e ataque de bactérias. Pode-se impedir isso fixando-se as células. A fixação consiste em preservar as estruturas das células o mais semelhante possível àquela que elas tinham quando faziam parte do organismo vivo. Além disso, a fixação deve endurecer o fragmento do tecido ou órgão, para que possa ser cortado posteriormente. As substâncias usadas para fixar são chamadas fixadores. Como exemplo, podemos citar o formol e o líquido de Bouin. Após a fixação, o fragmento de tecido ou órgão é lavado em água (para retirar o excesso de fixador) e passado por uma série de banhos em soluções de álcool cada vez mais concentradas, até 100%. Esses banhos servem para retirar a água da lavagem e esse processo é chamado desidratação. Após desidratação, o fragmento de tecido ou órgão é colocado em xilol, para que se torne mais transparente e se retire o álcool. Daí chamarmos essa etapa de clareamento. O fixador torna os tecidos endurecidos, mas não o suficiente para que sejam cortados. Nestes casos, o material deve sofrer inclusão, isto é, deve ser incluído em blocos de material duro o suficiente para permitir um corte fino e adequado à observação: quanto mais dura a substância de inclusão, mais finos poderão ser os cortes obtidos. Na microscopia óptica, a inclusão em parafina é a mais usada. Para tal, colocamos o material previamente tratado dentro de uma cuba contendo parafina líquida e deixamos a parafina solidificar. A finalidade da inclusão é fazer com que o material possa ser cortado em fatias bem finas (de 5 a 10 m) por um aparelho especial que possui navalhas de aço e é semelhante a um cortador de frios o micrótomo. Os cortes provenientes da microtomia são enrugados. Para desfazer estas rugas, são esticados num banho de água e gelatina a 58 C, e pescados com uma lâmina fase denominada de extensão. Leva-se então, à estufa a 37 C por 2 horas, para que se dê a colagem do corte à lâmina, pela coagulação da gelatina contida na água quente. Após a fase de extensão, a lâmina encontra-se pronta para a fase de coloração. 4. Coloração Os processos de preparação descritos não garantem por si só a possibilidade de se evidenciarem estruturas celulares. Para que estas estruturas se tornem visíveis ao microscópio, necessitam ser coradas. A coloração possibilita o contraste necessário para que as estruturas celulares possam ser visualizadas. Cada corante reage apenas com determinadas estruturas da célula, fornecendo um contraste que facilita sua observação. Existem dois grandes grupos de corantes: os que se comportam como ácidos e os que se comportam como bases. Podemos, então, classificar as estruturas celulares em dois grandes grupos: acidófilas, que têm afinidade por corantes ácidos; e basófilas, que têm afinidade por corantes básicos. Por exemplo, quando coramos uma célula por dois corantes, um ácido e um básico, observamos que o núcleo tem afinidade pelo corante básico (é basófilo) e o citoplasma pelo corante ácido (é acidófilo). 3 5

4 Atualmente, o citologista (especialista no estudo das células) que trabalha com o microscópio óptico dispõe de um grande número de corantes específicos, podendo escolher aquele que na prática mostrou ser mais adequado à estrutura que será estudada. BIBLIOGRAFIA: 1- LOPES, Sônia. Bio 1. São Paulo, Ed. Saraiva, MESQUITA, Elizabeth Carneiro. Citologia, Histologia e Embriologia. Coleção CEB (Currículo de Estudos de Biologia). São Paulo, Ed. E.P.U., SOUZA, Maria helena Soares de; SPINELLI, Walter. Guia Prático para Cursos de Laboratório. São Paulo, Ed. Scipione, CARRON, Wilson; GUIMARÃES, Osvaldo. As faces da Física. Volume Único. São Paulo, Ed. Moderna, MICROSCOPIA. Disponível em:<minerva.ufpel.edu.br/ ~mgrheing/praticaesq.htm>. Acesso em: 25/03/ JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, José. Biologia Celular e Molecular. 7ª ed., Rio de Janeiro, Ed. Guanabara Koogan, III- RESPONDA ÀS QUESTÕES PROPOSTAS 01) Quais são as funções de um microscópio? (1,0 ponto) 02) O que se entende por poder de resolução? Qual é o valor dele, respectivamente, para o olho humano e para os microscópios óptico e eletrônico? (1,0 ponto) 03) Por que se diz que no microscópio óptico a imagem é formada por transparência? (1,0 ponto) 04) A partir dos conhecimentos adquiridos sobre as características da imagem de um objeto observado ao microscópio óptico, desenhe abaixo a imagem da letra b, da forma que ela seria visualizada. (1,0 ponto) 05) Qual a semelhança e a diferença básicas entre as técnicas de observação "in vivo" e de observação "in vitro"? (1,0 ponto) 4 5

5 06) O que se entende por coloração vital? Quando é utilizada? (1,0 ponto) 07) Para que tipos de tecidos utilizamos, respectivamente, as técnicas de esmagamento e esfregaço? (1,0 ponto) 08) Descreva, resumidamente, as etapas que devem ser seguidas na obtenção de cortes de tecidos finos e transparentes o suficiente para serem observados em microscopia óptica. (1,0 ponto) 09) Quais são as funções exercidas pelo fixador e pelo corante em microscopia óptica? (1,0 ponto) 10) Quando deve ser usado e qual a finalidade do uso do óleo de imersão em microscopia óptica? (1,0 ponto) 5 5