PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM PACIENTES SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE REFERÊNCIA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA

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1 ii UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECIOSAS PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM PACIENTES SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE REFERÊNCIA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA ANA CAROLINA DE OLIVEIRA DE LIMA MANAUS 2017

2 i ANA CAROLINA DE OLIVEIRA DE LIMA PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM PACIENTES SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE REFERÊNCIA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientador: Profº Drº Marcelo Cordeiro dos Santos Co-orientador (a): Profª Dra. Maria Lucia Rosa Rossetti MANAUS 2017

3 Ficha catalográfica D278p de Lima, Ana Carolina de Oliveira Prevalência de Micobactérias não tuberculosas em pacientes suspeitos de Tuberculose em uma Unidade de Referência na Amazônia Brasileira: Prevalência de Micobactérias não tuberculosas em pacientes suspeitos de Tuberculose em uma Unidade de Referência na Amazônia Brasileira / Ana Carolina de Oliveira de Lima. Manaus: [s.n], f.: il.; 297 cm. Dissertação - PGSS - Doenças Tropicais e Infecciosas (Mestrado) - Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, Inclui bibliografia Orientador: Marcelo Cordeiro dos Santos Coorientador: Maria Lúcia Rosa Rossetti 1. Prevalência. 2. Micobacterias não tuberculosas Técnicas moleculares. 4. HIV/AIDS. 5. Região Norte. I. Marcelo Cordeiro dos Santos (Orient.). II. Maria Lúcia Rosa Rossetti (Coorient.). III. Universidade do Estado do Amazonas. IV. Prevalência de Micobactérias não tuberculosas em pacientes suspeitos de Tuberculose em uma Unidade de Referência na Amazônia Brasileira Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a). Sistema Integrado de Bibliotecas da Universidade do Estado do Amazonas.

4 ii FOLHA DE JULGAMENTO PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM PACIENTES SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE REFERÊNCIA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA ANA CAROLINA DE OLIVEIRA DE LIMA Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. Banca Julgadora: Presidente Membro Membro

5 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus familiares e amigos que me apoiaram nos momentos difíceis, ao meu pai Miquéias Oliveira de Lima e irmãos Marcos e Miquéias Júnior, com todo meu amor e gratidão pela força e incentivo, por tudo que fizeram por mim nessa trajetória. Em memória de Anira de Lima, mãe e amiga, dedico este trabalho fruto de um sonho nosso e com imensa saudade, por todo exemplo de superação e amor que me foi passado.

6 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus pela força e sabedoria concedida para que eu pudesse alcançar essa conquista. À minha família por terem sido alicerce inabalável na trajetória até aqui. À querida Ms. Rossicléia Lins Monte pelo carinho e pelas instruções dadas para o desenvolvimento deste trabalho. Ao professor Drº Marcelo Cordeiro dos Santos, meu orientador, pelos ensinamentos e pela oportunidade de crescimento profissional. À professora Drª Maria Lúcia Rossetti, minha co-orientadora, que me possibilitou aprendizagens únicas, sempre me incentivando. Muito obrigada pela confiança e por acreditar em meu potencial. Ao professor Drº Afrânio Kritski, pela contribuição na construção deste trabalho, incentivo e ensinamentos incansáveis À equipe do laboratório do Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CDCT da Fundação de Produção e Pesquisa em Saúde FEPPS, pelo apoio e ensinamentos oferecidos. À equipe do laboratório da Gerência de Bacteriologia pelos anos que me acolheram me disponinilizando conhecimento e maturidade profissional o que me fez chegar até aqui. À equipe do laboratório da Gerência de Tuberculose e Virologia pelo apoio no desenvimento das técnicas laboratoriais necessárias nesse trabalho. A todos os professores Universidade do Estado do Amazonas/Programa de Pósgraduação em Medicina Tropical, por todo aprendizado e atenção dispensado no repasse dos conhecimentos durante as aulas. À Fundação de Amparo à pesquisa do Amazonas (FAPEAM) pelo apoio e bolsa de estudo. Aos membros da secretaria acadêmica da Pós-graduação em Medicina Tropical e a todos os funcionários da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, pelo incentivo e cordialidade. Aos colegas da turma de Mestrado ano 2015, por todos os momentos maravilhosos juntos, pela sincera amizade durante esta jornada e por todo apoio, em especial às colegas Cynthia Pessoa e Maria Francisca Rodrigues. Muito obrigada!

7 DECLARAÇÃO DAS AGÊNCIAS FINANCIADORAS O auxílio de passagens aéreas para a participação em treinamentos e capacitações necessários para realização das técnicas moleculares foram financiados Universidade do Estado do Amazonas (UEA). Os recursos laboratoriais e materiais de consumo para execução dos procedimentos foram disponibilizados pelo Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CDCT) da Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde (FEEPS) e pela empresa biomérieux Brasil. O projeto foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) por meio de bolsa de estudo, durante os 24 meses de execução do projeto.

8 [...] Não importa o quão estreito seja o portão e quão repleta de castigos seja a sentença, eu sou o dono do meu destino, eu sou o capitão da minha alma [...] Invictus.

9 RESUMO Em países industrializados, com a queda da incidência de tuberculose (TB) ocorreu um aumento esporádico dos casos de infecções por micobactérias não tuberculosas (MNT). O uso de métodos de detecção laboratorial de MNT baseado em testes moleculares tem sido valorizado, pois a ausência de diagnóstico adequado em pacientes suspeitos de infecção por micobactérias pode levar ao tratamento inadequado, promover resistência medicamentosa, falência terapêutica e o óbito. Em países de alta carga de TB, são escassos os dados sobre a prevalência dos casos de infecção por MNT em pacientes suspeitos de TB com HIV/AIDS, como na região Norte do Brasil. Estima-se uma subnotificação dos casos por se tratar de uma doença sem notificação obrigatória. O objetivo desse estudo foi descrever os casos de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos na Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), referência para HIV/Aids, no período de 2011 a Dos pacientes atendidos, 758 tiveram amostras clínicas positivas para micobactérias, destes 153 (20,2%) foram positivas para MNT. A maioria dos pacientes era do sexo masculino (66%), infectados por HIV (77%) em uso de terapia antiretroviral (26,7%), com mediana de CD4 de 244 cels/mm 3. Entre essas amostras foi possível recuperar da criogenia 56 (36,6%) isolados para identificação molecular da espécie. A identificação da espécie de MNT foi obtida pelos testes GenoType Mycobacterium CM/AS, PRA hsp65 (PRA) e sequenciamento respectivamente em 50 (89,3%), 37 (66%) e em 43 (76,8%) das amostras analisadas. A concordância entre a técnica PRA e o GenoType foi de 81%, entre o GenoType e o sequenciamento de 76% e entre o PRA e o sequenciamento de 74%. As espécies identificadas em maior frequência foram: Mycobacterium gordonae em 17 (30,4%), M. fortuitum em 11 (19,6%), M. avium/intracellulare em 10 (17,9%), M. abscessus em 6 (10,7%) M. kansasii em 3 (5,3%). Entre os 56 pacientes com MNT, 13 (23,2%) receberam tratamento inapropriado para TB e foram notificados no SINAN. Óbito foi identificado em 5 (9%) pacientes. Com base nesses achados, observou-se: a) uma elevada prevalência de MNT de importância clínica acometendo em sua maioria pacientes soropositivos; b) que cerca de 25% dos pacientes com MNT foram tratados como TB, e c) o kit comercial Genotype Mycobacterium CM/AS detectou a espécie de MNT em 89% das amostras. Torna-se urgente a implementação de técnicas moleculares para diagnóstico de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos em referência para HIV. Palavras-Chaves: Prevalência, micobacterias não tuberculosas, tuberculose, técnicas moleculares, Região Norte, HIV/AIDS.

10 ABSTRACT In industrialized countries, with the decline in the incidence of tuberculosis (TB), there has been an increase in cases of non-tuberculous mycobacterial (NTM) infections. The use of laboratory-based methods of NTM based on molecular tests has been valued, since the absence of adequate diagnosis in patients suspected of mycobacterial infection can lead to inadequate treatment, promote drug resistance, failure of therapy and death. In countries with high TB burden, data on the prevalence of NTM infection in HIV / AIDS TB patients are scarce, as in the Northern region of Brazil. It is estimated that underreporting of cases is a non-notifiable disease. The objective of this study was to describe cases of NTM in patients suspected of TB treated at the Heitor Vieira Dourado Tropical Medicine Foundation (FMT-HVD), a reference for HIV / AIDS, from 2011 to Of the patients treated, 758 clinical samples positive for mycobacteria, of these 153 (20.2%) were MNT positive. The majority of patients were male (66%), HIV infected (77%) receiving antiretroviral therapy (26.7%), with a median CD4 count of 244 cells / mm3. Among these samples it was possible to recover from the cryogenic 56 (36.6%) isolates for molecular identification of the species. The identification of MNT species was obtained by GenoType Mycobacterium CM / AS, PRA hsp65 (PRA) and sequencing, respectively, in 50 (89.3%), 37 (66%) and 43 (76.8%) samples analyzed. Agreement between the PRA technique and the GenoType was 81%, between the GenoType and the 76% sequencing and between the PRA and the 74% sequencing. The species most frequently identified were: Mycobacterium gordonae in 17 (30.4%), M. fortuitum in 11 (19.6%), M. avium / intracellulare in 10 (17.9%), M. abscessus in 6 (10.7%) M. kansasii in 3 (5.3%). Among the 56 patients with NTM, 13 (23.2%) received inappropriate treatment for TB and were notified at SINAN. Death was identified in 5 (9%) patients. Based on these findings, we observed: a) a high prevalence of NTM of clinical importance, most of them being seropositive; b) that about 25% of the NTM patients were treated as TB, and c) the Genotype Mycobacterium CM / AS commercial kit detected the MNT species in 89% of the samples. It is urgent to implement molecular techniques for the diagnosis of NTM in patients suspected of TB seen in reference to HIV. Keywords: Prevalence, non-tuberculous mycobacteria, tuberculosis, molecular techniques, Northern Region, HIV / AIDS

11 RESUMO LEIGO Em alguns países muitas pessoas adoeceram por micobactérias não tuberculosas (MNT), aquelas que não causam a tuberculose (TB), mas os sintomas e o exame são parecidos. Para saber mais rápido se a pessoa está realmente doente por elas verifica-se o DNA dessa bactéria, mas a falta desse tipo de exame por ser caro e ainda não disponível a todos pode levar ao tratamento errado (remédio para o tratamento da tuberculose), a pessoa não curar e até mesmo à morte. Nos lugares onde há muita gente doente com tuberculose, são poucas as informações sobre as pessoas doentes por MNT, acredita-se que pela falta de notificação desses casos como na região Norte do Brasil. O objetivo desse estudo foi descrever os casos de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos na Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), referência para HIV/Aids, no período de 2011 a Foram analisadas 758 amostras positivas para micobactérias, destes 153 (20,2%) foram positivas para MNT. A maioria dos pacientes era do sexo masculino (66%), infectados por HIV (77%), estavam em tratamento para o HIV (26,7%). Desses casos foi possível recuperar do congelamento, 56 (36,6%) amostras para análise. A identificação da espécie de MNT foi através da análise do DNA. As espécies identificadas em maior frequência foram: Mycobacterium gordonae em 17 (30,4%), M. fortuitum em 11 (19,6%), M. avium/intracellulare em 10 (17,9%), M. abscessus em 6 (10,7%) M. kansasii em 3 (5,3%). Entre os 56 pacientes com MNT, 13 (23,2%) receberam tratamento errado e foram notificados no Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) como doentes com tuberculose, 5 (9%) desses pacientes morreram. Torna-se urgente a implementação de técnicas moleculares para diagnóstico de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos em referência para HIV. Palavras-Chaves: Prevalência, micobacterias não tuberculosas, tuberculose, técnicas moleculares, Região Norte, HIV/AIDS.

12 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Baciloscopia Bacilos em esfregaço de amostra de escarro corado por técnica Ziehl-Neelsen...16 Figura 2. Esfregaços de cultura de micobactérias...33 Figura 3. Colônias cepas MNT positivas fotocromógenas, acromógenas e escotocromógenas...34 Fluxograma 1. Informações de positividade em cultura e identificação laboratorial por método convencional (teste fenotípico e bioquímico) no período de 2011 a Fluxograma 2. Etapas do procedimento laboratorial...59 Gráfico 1 Distribuição dos casos de HIV em pacientes suspeitos de TB com amostra positiva para MNT...59

13 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Distribuição de isolados respiratórios de micobactérias não tuberculosas (NTM)...25 Tabela 2. Definição de caso de infecção por MNT...30 Tabela 3. Diagnóstico de doença pulmonar por MNT...32 Tabela 4. Classificação das MNT segundo o sistema de Runyon...35 Tabela 5. Informações sobre os resultados de baciloscopia, Xpert MTB/RIF e testes moleculares de identificação de espécie realizados...60 Tabela 6. Análise de Kappa entre as técnicas moleculares...60 Tabela 7. Distribuição das espécies de MNT identificadas e sorologia para HIV...61 Dados complementares Tabela 1 Características basais dos indivíduos com isolados positivos para MNT...62 Tabela 2 Informação sobre tratamento anti-tb e MNT...62

14 LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA AIDS Síndrome da imunodeficiência humana adquirida ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária BCG - Bacillus Calmette-Guérin BAAR Bacilo álcool-ácido resistente CTAB Brometo de cetrimônio DPOC - Doença pulmonar crônica DNA - Ácido desoxirribonucleico EUA - Estados Unidos HIV - Vírus da imunodeficiência humana LJ - Lowenstein Jensen LACEN - Laboratório Central de Saúde Pública MgCl2 Cloreto de magnésio MNT - Micobactérias não causadoras de tuberculose M.tb - Mycobacterium tuberculosis MCR -Micobactérias de crescimento rápido MCL - Micobactérias crescimento lento OMS - Organização Mundial de Saúde PPD - Prova tuberculínica PCR Reação da cadeia da polimerase PRA-hsp65 Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65 PCT - Programa de Controle da Tuberculose PNB - Ácidop-nitrobenzóico PAS - Ácido p-aminosalicílico RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism RIF - Rifampicina SINAN - Sistema de Informação de Agravos de Notificação SVS - Secretaria de Vigilância em Saúde TB Tuberculose TB/HIV Coinfecção TB/HIV TB-XDR - Tuberculose extensivamente resistente ZN - Ziehl-Neelsen μm - Micrometro mol Molaridade/mole mm³ - Milímetro cúbico ml - Microlitro pmol - Picomol u Unidade de massa atômica pb Pares de base mm Milimol μl - Microlitro

15 iii SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO Classificação do gênero Mycobacterium Relação clínica entre as Micobactérias e o HIV/AIDS História e evolução das Micobactérias não tuberculosas Doença causada pelas Micobactérias não tuberculosas (MNT) Transmissão e formas clínicas da doença por MNT Epidemiologia das micobactérias não tuberculosas Dados mundiais Dados da América Latina e Brasil Dados da região Norte do Brasil Diagnóstico clínico e epidemiológico das MNT Diagnóstico laboratorial das MNT Separação das espécies do Complexo M. tuberculosis das micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT): Identificação fenotípica das espécies de MNT: Identificação genotípica das MNT: OBJETIVO Geral: Específicos: MATERIAIS E MÉTODOS Modelo e período de estudo: Amostras clínicas: População de referência: Critérios de elegibilidade: Definições para confirmação laboratorial dos casos de Micobactéria não tuberculosa: Critérios de não inclusão: Procedimento laboratorial: Identificação fenotípica: Identificação genotípica: Coleta e análise de dados Considerações éticas: RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICE...71 Apêndice A - Equipe...72 Apêndice B - Cronograma...73 Apêndice C - Orçamento...74 Apêndice D Procedimento operacional para extração de DNA de Micobactérianão tuberculosa por CTAB...76

16 15 Apêndice E - Procedimento operacional padrão para o congelamento e recuperação de cepa de Micobactéria não tuberculosa Apêndice F - Procedimento operacional padrão para a identificação fenotípica das Micobactérias não tuberculosas por tempo de crescimento e pigmentação Apêndice G - Procedimento operacional padrão para inativação e extração de DNA por termobloco de Micobactéria não tuberculosa Apêndice H - Procedimento operacional padrão para identificação molecular pelo método PRA-hsp Apêndice I - Procedimento operacional para técnica de purificação de DNA para sequenciamento utilizando PED 8000/ 2,5 M NaCl Apêndice J Procedimento operacional padrão para teste de genética molecular para identificação a partir de material de cultura de espécies de Micobactérias (GenoType Mycobacterium CM/AS) ANEXO Anexo A - Parecer consubstanciado do CEP Anexo B - Modelo da ficha de notificação da Tuberculose Anexo C - Termo de Dispensa do Consentimento Livre e Esclarecido (TDCLE) Anexo D - Termo de Compromisso de Utilização de Dados (TCUD) Anexo E - Carta de Anuência...108

17 16 1. INTRODUÇÃO 1.1. Classificação do gênero Mycobacterium As micobactérias são classificadas no gênero Mycobacterium com base na sua característica ácido resistente, na presença de ácidos micólicos e no alto conteúdo de guanina e citosina no seu DNA. Sua característica álcool-ácido resistente é visualizada por meio da técnica de coloração Ziehl-Neelsen (ZN), onde um esfregaço da amostra biológica em lâmina é confeccionado, corado e visualizado em microscópio óptico (Figura 1) (1,2). Figura 1: Baciloscopia Bacilos em esfregaço de amostra de escarro corado por técnica Ziehl- Neelsen. Fonte: Gerencia de Tuberculose FMT/HVD. Taxonomicamente, pertencem à família Mycobacteriaceae, ordem Actinomycetales, subordem Corynebacterineae, classe e filo Actinobacteria. É composto por 165 espécies divididas em três grupos: Mycobacterium leprae; micobactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis e outras que não pertencem a esse complexo, denominadas micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT) (1,25). O gênero Mycobacterium também é classificado de acordo com sua capacidade de produzir doença no homem ou grupo de risco, como raramente patogênicas, potencialmente patogênicas e patogênicas.

18 Relação clínica entre as Micobactérias e o HIV/AIDS As espécies de micobactérias que apresentam elevada importância clínica por causar doença pulmonar, extrapulmonar e disseminada são as pertencentes ao complexo Mycobaterium tuberculosis e as MNT (2). Ambas apresentam alta relevância clínica, conferem ao hospedeiro infecção potencialmente grave, possuem diagnóstico clínico e laboratorial semelhantes e apresentam mecanismos de transmissão e tratamento distintos (17). Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) cerca de 10,4 milhões de pessoas tiveram tuberculose em 2016, cerca de 1,2 milhões de pessoas apresentam coinfecção TB/HIV e 1 milhão morreram por conta da doença. No ano de 2016, foram diagnosticados e registrados casos novos de tuberculose no Brasil com coeficiente de incidência de 32,4/ habitantes. O Estado do Amazonas registrou coeficiente de incidência de 67,2/ hab. e ultrapassando o Amazonas, a capital Manaus apresentou coeficiente de incidência de 93,2/ hab. chegando a ultrapassar os valores regionais e nacionais para o mesmo período. Os resultados de testagem para HIV entre os casos novos de TB no Brasil, apontaram para a existência de 9,7% de pessoas com a coinfecção TB-HIV. Cerca de 73,2% dos casos novos de tuberculose realizaram testagem para o HIV no Brasil, seguido do Amazonas com 68,8% e em Manaus com 71,8% (89). O HIV continua sendo um grande problema de saúde pública mundial, em 2016 foram registrados 2,1 milhões de novas infecções. No Brasil, neste ano, estima-se que tenham ocorrido [ ] novas infecções por HIV, com prevalência de 0,4% a 0,7% em pessoas de 15 a 49 anos em 2014 (97). De 2007 até junho de 2016, foram notificados no SINAN casos de infecção por HIV na Região Norte (6,3%). A taxa de detecção de HIV/AIDS na Região Norte do Brasil tem apresentado uma tendência linear de crescimento significativo; em 2006 a taxa registrada foi de 15,0 casos para cada 100 mil habitantes, enquanto que no último ano a taxa foi de 24,0 representando um aumento de 61,4% (98). Isoladamente, as infecções por TB e HIV são as principais causas de mortes por

19 18 doenças infecciosas. A TB é responsável por um terço das mortes relacionadas com o HIV/AIDS a cada ano (24). Até o surgimento da HIV/AIDS não se atribuia grande importância às infecções por MNT, os relatos de doenças pulmonares causadas por esse grupo eram esporádicos (28). Em países industrializados, com uma alta carga de TB, onde o foco tem sido a realização apenas da baciloscopia, a prevalência de MNT em sujeitos com HIV permanece desconhecida, é relatada a baixa realização de cultura para micobactéria na rotina e a dificuldade na elucidação devido a coinfecção MNT/TB, com isso é frequente o uso do tratamento de probabilidade (empírico, sem confirmação), e portanto, uma proporção desconhecida de pacientes podem, de fato, estar infectada com MNT. Mesmo com a introdução do Xpert MTB Rif a partir de 2014, nos resultados positivos, confirma-se TB, mas nos resultados negativos não se afasta a ocorrência de MNT (67). O impacto das MNT na morbidade e mortalidade dos doentes com HIV/AIDS, estimulou o início de estudos relacionados à epidemiologia, ecologia, genética, biologia molecular e fisiologia das MNT. Além, disso a rápida ascensão das doenças provocadas pelas MNT estimulou o desenvolvimento de métodos rápidos para o seu isolamento e identificação (72) História e evolução das Micobactérias não tuberculosas Estudos revelam que a doença por micobactéria acomete a população humana há milhares de anos, sendo as primeiras evidências referem-se ao estudo de 44 múmias egípcias de faraós jovens, datando de a A.C. (31). A primeira descrição das micobactérias causando doença no homem ocorreu em 1873, quando o físico norueguês Gerhard Armauer Hansen descreveu alguns corpos em forma de hastes a partir de biópsia de paciente com hanseníase (32). A maioria das espécies de MNT foi descrita no século passado. A designação de micobactérias atípicas foi utilizada pela primeira vez por Pinner, em 1935, referindose às características distintas que apresentavam em relação ao complexo M. tb e a

20 19 M. leprae, em particular ao fato de não serem agentes patogênicos obrigatórios e de se encontrarem habitualmente no meio ambiente (17). No Brasil, a importância clínica das MNT foi reconhecida na década de 1938 quando Costa Cruz descreveu o primeiro caso de M. fortuitum isolado de um abscesso cutâneo (29). Após uma década, MacCallum descreveu uma doença de pele causada por uma nova espécie de micobactéria, classificada mais tarde como M. ulcerans. Em 1949, Cuttino e McCabe descreveram um novo microrganismo causando infecção disseminada em uma criança, logo nomearam como Nocardia intracellularis, porém mais tarde foi classificada como M. intracellulare por Runyon (30). Em 1951, Norden e Linell descreveram Mycobacterium balnei presente em granuloma, posteriormente reconhecido como M. marinum (29). O termo micobactérias não tuberculosas foi utilizado pela primeira vez em 1954 por Timpe e Runyon para identificar e diferenciar todas as micobactérias não pertencentes ao complexo M. tuberculosis e M. leprae (30). Com o avanço dos métodos e técnicas de identificação, muitas outras espécies de micobactérias foram descobertas e classificadas Doença causada pelas Micobactérias não tuberculosas (MNT) Os mais importantes complexos de espécies de MNT causadoras de doença no homem são: o complexo M. avium (MAC), o complexo M. fortuitum, complexo M. celatum, complexo M. abscessus, complexo M. kansasii, complexo M. terrae, complexo M. simiae e o complexo M. smegmatis (25,37). Complexo MAC: É composto por espécies capazes de causar doenças em animais e seres humanos, incluem as espécies M. avium, M. intracellulare, M. colombiense, M. chimaera, M. yongonense (101). Nos hospedeiros imunocompetentes, o MAC afeta os pulmões em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), podendo causar fibrose pulmonar ou doença pulmonar cavitária (DPC). Em hospedeiros imunodeprimidos, no caso do HIV/AIDS, pode originar infecção sistêmica, causando sobretudo doença disseminada. A espécie M. avium normalmente é isolado de

21 20 ambientes como água potável, que se acredita ser uma fonte de infecção para os doentes soropositivos para HIV (37,38). Complexo M. fortuitum: O complexo M. fortuitum compreende as espécies M. fortuitum, M. peregrinum, M. mageritense (101). Essas espécies são de crescimento rápido, geralmente habitam o solo, poeira e água. A identificação dessas micobactérias é importante para estabelecer a terapêutica adequada, visto que possuem diferentes padrões de resistência aos farmacos. As doenças causadas por essas espécies incluem raramente as formas pulmonares (56). Complexo M. abscessus: O complexo M. abscessus é constituído por três espécies: M. chelonae, M. abscessus e M. immunogenum (101). São frequentemente resistentes a fluorquinolonas, sulfametoxazol, doxiciclina e sensíveis a claritromicina, amicacina, tigeciclina e imipenem. Em 2001, M. immunogenum foi descrita e isolada pela primeira vez de fluídos utilizados para a lubrificação e arrefecimento de máquinas industriais (41). Causa doença pulmonar em indivíduos com comprometimento pulmonar prévio como TB anterior e fibrose cística além de causar infecções pósoperatórias e pós-procedimentos causando doenças de pele e tecidos moles, infecções do sistema nervoso central, bacteremia e infecções oculares (42). Complexo M. terrae: O complexo M. terrae é composto pelas espécies M. terrae, M. nonchromogenicum, M. hiberniae, M. sinense, M. senuense, M. engbaekii (101). A colonização do epitélio humano por estas micobactérias é rara e geralmente são consideradas como não patogênicas, no entanto em casos de imunossupressão, M. nonchromogenicum pode ocasionalmente causar doença no homem, tais como infecções pulmonares e tendinopatia. Nos últimos anos um número crescente de infecções causadas por estes organismos foi associado à coinfecção com HIV/AIDS (48). Complexo M. kansasii: O complexo M. kansasii inclui as espécies M. gastrii e M. kansasii (101). O M. kansasii é uma micobactéria não tuberculosa que pode causar colonização ou doença pulmonar (100).

22 21 Complexo M. simiae: O complexo M. simiae é composto por várias espécies filogeneticamente relacionadas, as quais incluem: M. interjectum, M. florentinum, M. sherrisii, M. triplex, M. palustre, M. bohemicum, M. nebraskense, M. europaeum (101). Este complexo pode apresentar manifestações clínicas e imagens pulmonar no radiograma torácico semelhantes ao da TB e resistência aos fármacos anti-tb associada a indivíduos com TB anterior (99) Transmissão e formas clínicas da doença por MNT Existem poucos relatos sobre a transmissão direta de pessoa para pessoa, por meio de tosse ou espirro. Há relatos de infecção adquirida a partir do meio ambiente, pela ingestão ou inalação de água e por meio de inoculação provocada pela inadequada desinfecção e manuseio de equipamentos médicos em procedimentos cirúrgicos, vacinação e videocirurgias (6). Procedimentos invasivos como acupuntura, tatuagens e piercings também são relatados como possíveis focos de transmissão (33). Por meio da análise de DNA verificou-se que estripes de várias espécies recuperadas a partir de amostras ambientais de água, solo e aerossóis, eram idênticas às isoladas de vários doentes (22). Indivíduos com doenças cardiovasculares, hepatite C, HIV/AIDS, transplantes, diabetes, alterações estruturais pulmonares como a Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), câncer, imunossupreção genética, artrite reumatóide e doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) apresentam predisposição a desenvolver infecção por MNT. As manifestações clínicas da infecção por MNT compreendem as formas pulmonar, extrapulmonar e disseminada, pois acomete pele, órgãos, trato respiratório, sangue, medula e ossos (68). Forma pulmonar: A partir dos anos 80, começaram a surgir relatos de grandes séries de doenças pulmonares causadas por MNT, em sua maioria associada à imunossupressão (28). A infecção pulmonar por MNT, foi descrita pela primeira vez em fumantes idosos do sexo masculino com alterações estruturais pulmonares (doença pulmonar cavitária ou enfisema). A DPOC, a bronquiectasia, o enfisema, a pneumoconiose, a tuberculose anterior, a silicose, a proteinose alveolar pulmonar e a deficiência de α-1-antitripsina são alguns dos principais determinantes do

23 22 desenvolvimento de infecção pulmonar por MNT no início da fase adulta. Embora a fibrose cística, causada por mutações no regulador da condutância transmembrana na fibrose cística (CFTR) e a discinesia ciliar primária (doença autossômica recessiva), geralmente presentes na infância ou adolescência, também causem susceptibilidade, nos casos de alguns pacientes com mutações hipomórficas as infecções podem ter apresentação tardia ou atípica (8,69). Os casos da doença pulmonar por MNT em imunocompetentes estão em sua maioria associados ao trabalho em condições de constante exposição a poeira. Nestas situações clínicas, as características da doença pulmonar por MNT é muito semelhante as da TB (36). Existem casos onde ocorre a repressão habitual da tosse favorecendo o desenvolvimento de infecção pulmonar por MNT, esses casos são associados a doenças neuromusculares, sequelas de acidente vascular cerebral e a síndrome de Lady Windermere. Essa síndrome ocorre principalmente em mulheres, não-fumantes e na pós-menopausa, sem qualquer fator predisponentes conhecido, as pacientes, tendem a apresentar escoliose, depressão do esterno, costelas na frente do tórax (Pectus Excavatum) e prolapso da válvula mitral (9). O lobo médio e língula estão predispostos a inflamação crônica por causa de suas estruturas anatômicas específicas e incapacidade para limpar as secreções das vias respiratórias devido à supressão da tosse, predispondo a bronquiectasia e infecção (8, 70). Forma extrapulmonar: Em indivíduos adultos e imunocompetentes, as infecções causadas pelas MNT na pele, articulações, tendões e nos ossos estão frequentemente associadas com traumatismos e feridas cirúrgica (73, 30). Em crianças, os locais de infecção mais frequentes são a pele e os nódulos linfáticos. As infecções causadas por M. haemophilum ou M. chelonae são geralmente caracterizadas por nódulos subcutâneos ou abcessos. Forma disseminada: Em doentes soropositivos para HIV, a doença provocada pelas MNT é geralmente disseminada (71). Nos casos de pacientes soronegativos para HIV, déficit na resposta celular Th1 associados a defeitos imuno genéticos, como mutações autossômicas das interleucinas (IL), interferon (IFN) e seus receptores específicos (IL12, IL12RB1, ISG15, IFNGR1, IFNGR2, STAT1 e IRF8), mutações no cromossomo X (IKBKG e CYBβ), deficiência GATA2 e auto-anticorpos anti-ifn-γ,

24 23 predispõem susceptibilidade, tanto na infância quanto na idade adulta, levando a óbito quando não tratada precocemente e/ou de maneira correta (8) Epidemiologia das micobactérias não tuberculosas Dados mundiais A frequência das descrições dos casos de infecções por MNT vem aumentando juntamente com o declínio significativo da taxa de incidência de TB em países industrializados. Em contraste com o M. tuberculosis, cuja notificação é obrigatória no mundo, as infecções por MNT ainda não geram notificação, fora os casos de MNT pós cirúrgia. A ausência de vigilância epidemiológica resulta na escasses de dados sobre a sua incidência, prevalência incidência, morbi/mortalidade, e os fatores associados (52). Os sintomas gerais causados pelas MNT não podem ser distinguidos de sintomas observados em casos de TB, e as aparências das bactérias não podem ser diferenciadas quando examinadas por microscopia de luz (78). Portanto, há consenso entre os autores de que é fundamental o diagnóstico laboratorial das MNT, pois a sintomatologia, imagens no radiograma torácico e resultados da baciloscopia não permite dinstingui-las de infecção por TB. A não realização de cultura para micobactéria ou a não identificação das espécies de micobactéria nos exames de cultura positiva para micobactéria podem levar a resultados falso-positivos para diagnóstico de TB e tratamento medicamentoso inadequado para o controle micobacteriano (77). Na detecção das espécies pertencentes às MNT, um estudo na Ásia, revelou que MAC foi a principal causa de infecção pulmonar, correspondendo à 68% dos casos (50). Em 2002, avaliando a prevalência de doença pulmonar por MNT no mundo, foi observado uma predominância de MAC entre os agentes causadores de doença pulmonar também na Ásia (51). A infecção pulmonar por MNT pode estar associada à mortalidade em Unidades de Terapia Intensiva (UTI), o tratamento anti-mnt é a solução adequada para melhores resultados de terapia. Em um estudo retrospectivo na UTI de um centro

25 24 médico em Taiwan, de janeiro de 1999 a junho de 2007, foi descrito que as infecções pulmonares por MNT estavam relacionadas, em sua maioria, as espécies do complexo M. avium e M. abscessus. A proporção de mortalidade em 5 anos foi em torno de 34-69% (53). Numa revisão sistemática e meta- análise realizada em 2015, foi relatada uma prevalência relativamente alta de infecções por MNT (10,2%) entre os casos positivos para TB, isso demonstrou a necessidade de uma maior aplicação de estratégias de controle da infecção, estabelecimento de critérios de diagnóstico apropriados e diretrizes para o manuseio de doenças por MNT além de expandir a qualidade dos laboratórios de referência regionais facilitando mais a prevenção e controle dessas infecções (3). Num estudo mais recente, com a colaboração mundial de 62 laboratórios, realizado pelo MNT-Network European TrialsGroup (MNT-NET) junto ao Tuberculosis Network European TrialsGroup (TB-NET) avaliou-se em 30 países e em 6 continentes (Europa, Ásia, América do Norte, América do Sul, África do Sul e Austrália) pacientes positivos para MNT, cultivadas em meio de cultura sólido provenientes de amostras respiratórias de escarro. Nesse estudo os membros do complexo MAC predominaram na maioria das regiões embora M. xenopi na Hungria e M. kansasii na Polônia e na Eslováquia. A distribuição relativa dos membros do complexo MAC revelou diferenças geográficas, enquanto M. avium predominava nos centros da América do Norte, América do Sul e na Europa, M intracellulare foi frequentemente isolada na África do Sul e Austrália. Na América do Sul o complexo MAC correspondeu a 31% dos isolados, seguido de M. abscessus e M. fortuitum com 16%, M. kansasii foi a segunda espécie mais isolada na América do Sul e M. gordonae a terceira mais isolada (Tabela 1).

26 25 Tabela 1. Distribuição de isolados respiratórios de micobactérias não tuberculosas (NTM). Distribuição de MNT Distribuição de MAC Europa MAC (37%), MCR (16%), M. gordonae (17%), M. kansasii (5%), M. xenopi (14%), M. malmoense (1%), MCL (10%) M. avium (47%), complexo M. avium (22%), M. intracellulare (8%). América do Norte MAC (52%), MCR (20%), M. xenopi (12%), M. gordonae (12%), MCL (3%), M. kansasii (1%). M. avium (78%), complexo M. avium (14%), M. intracellulare (8%). América do Sul MAC (31%), MCR (21%), M. kansasii (20%), M. gordonae (17%), MCL (11%). M. avium (64%), complexo M. avium (23%), M. intracellulare (13%). Autrália MAC (71%), MCR (15%), MCL (8%), M. kansasii (4%), M. gordonae (1%). M. intracellulare (80%), M. avium (20%). Ásia MAC (54%), MCR (31%), MCL (6%), M. gordonae (6%), M. kansasii (3%). M. avium (45%), complexo M. avium (39%), M. intracellulare (16%). África do Sul MAC (50%), MCL (33%), MCR (7%), M. gordonae (5%), M. kansasii (3%), M. xenopi (1%). M. intracellulare (77%), M. avium (21%), complexo M. avium (2%). Total MAC (47%), MCR (16%), MCL (14%), M. gordonae (11%), M. xenopi (8%), M. kansasii (3%), M. malmoense (1%). M. avium (47%), M. intracellulare (38%), complexo M. avium (15%). *MCR: micobactérias de crescimento rápido; MCL: micobactérias de crescimento lento. Fonte: MNT-Network European TrialsGroup (MNT-NET). A distribuição das espécies de MNT em um país pode ter profundo impacto sobre as frequências e manifestações da doença pulmonar por MNT em cada região sendo necessários estudos futuros para abordar os diferentes nichos ambientais específicos de cada espécie (96) Dados da América Latina e Brasil Na prática clínica diária é observado um número crescente de cirurgias cosméticas realizadas principalmente na América Latina e Caribe associado com o aumento no número de casos de infecções por MNT (55). Houve relatos de focos de infecções por

27 26 M. abscessus em feridas cirúrgicas resultantes de procedimentos de abdominoplastia na República Dominicana e Colômbia (54). O envolvimento da espécie M. fortuitum em infecções de sítio cirúrgico é bem documentado, pode ocorrer em ferida esternal após cirurgia cardiotorácica ou após cirurgia de aumento de mama devido a contaminação da ferida com água da torneira contaminada, no ato do banho (56,57). Recentemente tem sido descrito infecções por MNT em idosos após uso da banheira escalda-pés em salões de manicure e pedicure (58,59). Na América Latina,um estudo realizado em 2014 em um hospital na Colombia, descreveu a prevalência dos casos de MNT em 9,1%, onde o principal fator de risco foi a infecção pelo HIV sendo a forma clínica pulmonar a mais predominante (56,6%) (52). No Brasil são escassos os casos publicados de infecções por MNT, as publicações em sua maioria referen-se a ceratite por M. chelonae, após cirurgia para correção de miopia, infecções cutâneas por M. abscessus e M. fortuitum após aplicações em mesoterapia ou cirurgia plástica e publicações sobre o risco crescente de infecções por essas espécies de micobactérias em pacientes submetidos a procedimentos médicos invasivos. Em razão da não obrigatoriedade da notificação, estima-se que no Brasil ocorra subnotificação de MNT associada às cirurgias (33). No Estado do Rio de Janeiro, entre 1993 e 2011 as espécies de MNT mais foram M. kansassi (33,9%) e complexo MAC (30,4%) destes 9,8% eram soropositivos para o HIV (61). Em um estudo no estado de São Paulo, foram estudadas cepas de MNT entre os anos de 1991 a 1997, desse estudo foi possível estabelecer as manifestações clínicas ocorridas naquele período, 48% foram de origem pulmonar, 29,3% sangue e medula óssea e 15,8% de outras formas extrapulmonares, a associação desses casos com o HIV não foi descratada (28). Segundo dados da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), no período de 1998 a 2009,foram notificados cerca de casos de infecção por micobactérias de crescimento rápido (MCR), sendo casos relatados no estado do Rio de Janeiro, 363 no Espírito Santo, 327 no Pará,193 em São Paulo,149 no Paraná,115 no Rio Grande do Sul, 95 em Goiás, 50 no Mato Grosso, 33 no Distrito Federal,31 em

28 27 Minas Gerais,11 no Piauí,11 na Bahia, 9 no Ceará,6 em Santa Catarina, 5 em Sergipe, 5 em Pernambuco, 3 em Alagoas, 2 no Tocantins, 1 em Roraima, 1 no Rio Grande do Norte, 1 na Paraíba, 1 no Amazonas e1 no Acre (6,63). Entre as micobactérias de crescimento rápido o agente etiológico prevalente na maioria das cidades brasileiras foi a M. massiliense, exceto nas infecções secundárias a mamoplastias, nas quais a maior prevalência foi de M. fortuitum. Outras espécies de MCR foram identificadas: M. abscessus, M. bolletii, M. chelonae, M. smegmatis e M. wolinskyi (62,63). Mesmo com o número elevado de casos notificados de infecção por MCR, entre as espécies potencialmente patogênicas, as micobactérias de crescimento lento (MCL) pertencentes ao complexo MAC e M. kansasii são as mais comumente isoladas no Brasil, ambas causam principalmente infecção pulmonar (63) Dados da região Norte do Brasil Um estudo realizado na Região Norte do Brasil, mais precisamente no estado de Roraima, avaliou no período de dois anos, casos suspeitos de TB pulmonar. Nesse estudo foi possível identificar causando doença pulmonar 369 (20%) casos positivos para TB e 75 (4%) casos positivos para MNT. Dentro do último grupo foi possível identificar 14 espécies por meio de métodos de diagnóstico molecular: M. abscessus, M. avium, M. fortuitum, M. intracellulare, M. gilvum, M. gordonae, M. asiaticum, M. tusciae, M. porcinum, M. novocastrense, M. simiae, M. szulgai, M. phlei e M. holsaticum. Nesse estudo 13 isolados não puderam ser identificados a nível de espécie devido as limitações de reprodutibilidade que o método de cultura sólida impõe (65). No Estado do Pará, em dados coletados nos anos de 1999 a 2010, observou-se que a espécie predominante nas formas clínicas pulmonares foi a M. massiliense. No período de janeiro de 2010 a dezembro de 2011, M. massiliense foi novamente a espécie mais encontrada, com 44,8% dos casos (66). Em 2013, outro estudo, realizado em Belém do Pará, 64,2% dos pacientes que manifestaram doença por MNT tinham acesso a um abastecimento de água por meio de sistemas de tubulações. Esta informação é importante porque, mesmo em zona

29 28 urbana, o abastecimento de água ainda é precário, cerca de 75% dos lares tem acesso a um abastecimento de água, sendo menor a cobertura em áreas urbanas periféricas, de acordo com o Censo Brasil 2010 (67). Na cidade de Manaus, em 2009, num outro estudo investigou-se a presença de MNT em águas de torneira, soluções e luvas cirúrgicas, utilizadas nas etapas dos procedimentos cirúrgicos executados no centro cirúrgico do Hospital Universitário Getúlio Vargas (HUGV). Foram coletadas e analisadas 105 amostras sendo: 24 de águas (coletadas das 2 torneiras existentes no centro cirúrgico), 8 de solução de povidine e 7 de solução de clorhexidina, que servem para a higienização das mãos dos cirurgiões; 39 de luvas cirúrgicas (superfícies internas e externas); e 27 de soluções que foram efetivamente utilizadas durante o ato cirúrgico. Obteve-se 41 isolados micobacterianos apenas de águas das torneiras. O não isolamento de MNT nas soluções utilizadas para higienização das mãos e luvas dos cirurgiões bem como nos procedimentos cirúrgicos, indica que essas soluções têm sido eficazes na eliminação de micobactérias. Entretanto, a presença de M. mucogenicum nas águas das torneiras do centro cirúrgico, espécie já associada a surtos pós-cirúrgicos, indica que devem ser efetuados procedimentos de limpeza e monitoramento em todos os pontos de distribuição de águas, visando à prevenção de surtos de micobacterioses nosocomiais (91). Na Região Amazônica, a predominância de pessoas da cor parda está relacionada a alta heterogenia, essa diversidade genética pode estar associada ao aumento da susceptibilidade a desenvolver infecção por MNT, porém são necessários mais estudos para comprovação. Sabe-se que pescadores e outras pessoas expostas aos peixes estão em risco de desenvolver infecções de pele causadas por M. marinum. Em crianças de 18 meses a 5 anos de idade o risco de desenvolver linfadenite cervical por M. avium está associado a exposição a viveiros de aves. A imunodeficiência, também é um fator de risco para a população dessa região, devido à infecção pelo HIV ou imunossupressão nos casos de câncer e quimioterapia (67).

30 Diagnóstico clínico e epidemiológico das MNT Os sintomas da doença pulmonar por MNT são variáveis e não específicos em alguns casos, nos quais o diagnóstico laboratorial não pode ser realizado, o médico pode confirmar o caso pelo critério clínico-epidemiológico. No entanto, praticamente todos os pacientes tem tosse crônica ou recorrente como na TB. Outros sintomas incluem tosse com expectoração, fadiga, mal-estar, dispneia, febre, hemoptise, dor no peito e perda de peso. Nesses casos o curso da doença é progressivo, causando sintomas persistentes, declínio da função pulmonar e uma piora na qualidade de vida. Além disso, pode também seguir um curso fulminante com insuficiência respiratória aguda (64). O estabelecimento de um diagnóstico de doença por MNT não é simples, o seu isolamento em amostras pulmonares e extrapulmonares não é por si só, diagnóstico de doença, devido contaminação transitória, exigindo o cumprimento dos critérios clínicos e microbiológicos, tais como a presença de sintomas clínicos, evidência radiográfica de lesões compatíveis com doença para as definições de caso sejam feitas. Na tabela 2 estão descritos os critérios de patogenicidade das MNT de crescimento rápido proposto pela ANVISA (63,74).

31 30 Tabela 2. Definição de caso de infecção por MNT: Suspeito Possível Provável Confirmado Paciente submetido a Paciente que preenche os critérios de caso suspeito, procedimentos mas sem investigação invasivos que laboratorial, e que apresente dois respondeu ao tratamento ou mais sinais específico para referidos como micobactérias. clínica compatívele achados radiológicos. Paciente que Paciente que preenche os preenche os critérios de caso critérios de suspeito, que caso suspeito apresente e apresenta manifestações clínicas mais de uma cultura positiva compatíveis com para baciloscopia positiva, mas micobactéria e baciloscopia. cultura negativa para micobactéria. Fonte: Brasil, ANVISA Relatório descrito de investigação de casos de infecções por micobactérias não tuberculosas de crescimento rápido (MCR) no Brasil no período de 1998 a Os achados radiológicos auxiliam nas definições de casos de infecção por MNT, mas não diferenciam dos casos de TB. Os achados mais comuns nas infecções pulmonares por MNT são a bronquiolite, bronquiectasias, nódulos, consolidação, e menos frequentemente cavidades (10). Porém, um estudo em Israel, relacionou achados radiológicos de duas espécies de MNT, M. kansasii estava associada à achados radiológicos com mais cavidades e M. simiae à infiltrados pulmonares. Esses achados revelaram que para M. kansasii existe uma predileção para a doença de lobo superior ao passo que a infecção por M. simiae maior probabilidade de doença lobo médio e inferior. Os derrames pleurais e linfadenopatia foram encontradas apenas na presença de infecção por M. simiae (75) Diagnóstico laboratorial das MNT O número elevado de espécies circulantes de MNT e de seu isolamento ser possível na maioria dos espécimes biológicos e ambientais leva os laboratórios a desenvolver e/ou aplicar métodos mais eficientes e rápidos para a detecção e

32 31 caracterização das micobactérias, incluindo métodos de cultura mais sensíveis, melhoramento das técnicas de identificação e dos testes de susceptibilidade aos antibióticos. É importante que os laboratórios recebam as amostras coletadas corretamente, evitando falsos diagnósticos resultantes de amostras contaminadas (26,36). Os tipos de amostras para diagnóstico de MNT são: escarro, escovado ou lavado broncoalveolar (LBA), biópsia pulmonar, peças cirúrgicas (ósseas, linfáticas, pele), secreções de feridas, sangue e medula óssea (57). A presença de MNT numa amostra clínica pode ter três significados: 1. A micobactéria é o agente etiológico, e neste caso o diagnóstico microbiológico deve ter como base os sinais clínicos e isolamento repetido da micobactéria em uma segunda amostra, ou por um único isolamento no caso das amostras colhidas de forma asséptica; 2. A micobactéria colonizou a amostra, mas não tem significado clínico. Isto resulta frequentemente da utilização de equipamento contaminado, geralmente provenientes de água canalizada. Casos assim não são raros e causam o que é designado de pseudoinfecção ; 3. A detecção de micobactéria na amostra clínica teve origem numa contaminação do laboratório (soluções de descontaminação contaminadas ou contaminação devido a outra amostra positiva), sendo fácil de verificar, caso a mesma micobactérias seja isolada a partir de outras amostras analisadas no mesmo dia (19,20); 4. Micobacteria isolada sem significância clínica não sendo causa real de infecção, significância clínica (3 amostras) isoladas de locais diferentes CUIDADO* ligação com a clínica valorização clínica mais de uma amostra; dias consecutivos e isoldadas de locais diferentes. Na tabela 3 estão descritos os critérios clínicos, radiológicos e laboratoriais para definir caso de infecção pulmonar por MNT de crescimento rápido ou tardio, segundo a ANVISA: Tabela 3. Diagnóstico de doença pulmonar por MNT:

33 32 Critérios clínicos e radiológicos: 1. Sintomas respiratórios associados a opacidade nodulares ou cavidades e/ou na radiografia e/ou bronquiectasias e múltiplos pequenos nódulos na tomografia computadorizada de tórax. e 2. Exclusão de outros diagnósticos, especialmente tuberculose. Critérios microbiológicos: 1. Cultura positiva em duas amostras de escarro. ou 2. Uma cultura positiva por escovado ou lavado broncoalveolar (LBA). ou 3. Biópsia pulmonar: processo inflamatório granulomatoso crônico e/ou BAAR no tecido associado à cultura positiva em tecido, escarro ou LBA. Fonte: Brasil, Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA 2010). Relatório descrito de investigação de casos de infecções por micobactérias não tuberculosas de crescimento rápido (MCR) no Brasil no período de 1998 a Separação das espécies do Complexo M. tuberculosis das micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT): As características culturais (morfologia das colônias e pigmentação), temperatura, taxa de crescimento e testes bioquímicos diferem entres as espécies do complexo M. tb e as MNT (21). Os métodos de cultura e os testes bioquímicos são morosos e laboriosos, podem levar várias semanas, além disso não são totalmente elucidáveis, deixando lacunas de diagnósticos quando ocorre a falta de reprodutibilidade da cepa em meio de cultura (25). A variabilidade de estirpes presentes numa mesma espécie, pode levar a uma variabilidade nos resultados dos testes bioquímicos, podendo também ocorrer espécies diferentes com morfologias e perfis bioquímicos indistinguíveis ou muito idênticos (63,64). Apesar das dificuldades enfrentadas, os laboratórios que realizam cultura para micobactérias devem ser capazes de primeiramente separar espécies do complexo M.tb das MNT através de testes fenotípicos, do contrário terão que reportar o resultado das culturas positivas, como Mycobacterium sp., ou encaminhar a cultura a um

34 33 laboratório de referência para realização da identificação da espécie por método molecular (1). A separação das espécies do complexo M. tuberculosis das MNT pode ser realizada por meio de quatro testes fenotípicos partindo do primo-cultivo: análise microscópica da cultura, inibição de crescimento em meio de cultura LJ-PNB (Lowenstein Jensen ácido p-nitrobenzóico) e teste da Niacina. A análise microscópica da cultura consiste na confecção de um esfregaço de uma alçada da colônia, que é corada com fucsina de ZN. Esse teste avalia a pureza da cultura, a presença de BAAR e a formação de corda (Figura 2). A maioria das MNT não formam fator corda, exceto M. kansasii, M fortuitum e M. chelonae (1,21). a. Complexo M.tb b. MNT Figura 2: Esfregaços de cultura de micobactérias. Fonte: Gerência de Tuberculose FMT/HVD O teste de inibição de crescimento em meio com ácidop-nitrobenzóico 500 µg/ml (PNB) é um teste utilizado na separação das espécies do complexo M.tb das MNT através da cultura, todas as espécies do complexo M.tb não crescem nesse meio ao contrário da maioria das MNT. As espécies de MNT que eventualmente podem não crescer em presença de PNB é o M. kansasii, M. xenopi e M. gastri (79) Identificação fenotípica das espécies de MNT: Após a separação das MNT do complexo M.tb, é necessário a realização do

35 34 teste de identificação fenotípico das espécies de MNT, as diferentes espécies inclusas a esse grupo também possuem diferenças terapêuticas (1,21). Os testes de identificação fenotípico tem como base as características culturais e bioquímicas, tais como: tempo e temperatura de crescimento, pigmentação e testes bioquímicos (1,35). Em 1958, Runyon propôs a classificação das MNT em quatro grupos, baseandose na pigmentação e tempo de crescimento das colônias em meio de cultura sólido (OK e/ou LJ). As espécies que apresentam crescimento após sete dias são classificadas como micobactérias de crescimento lento (MCL) e aquelas que apresentam crescimento em menos de sete dias, micobactérias de crescimento rápido (MCR). As micobactérias pigmentadas produzem intensamente carotenoides amarelos (Figura 3), que podem ser estimulados pela exposição à luz, estes são denominados organismos fotocromogênios ou quando produzidos na ausência de luz, organismos escotocromogênicos, além das micobactérias não pigmentadas (43). Figura 3: Colônias cepas MNT positivas fotocromógenas, acromógenas e escotocromógenas. Fonte: Gerência de Tuberculose FMT/HVD Esse esquema de identificação auxilia a elucidar possíveis lacunas de diagnóstico, todavia, uma micobactéria pigmentada ou de crescimento rápido não deve ser confundida com M. tuberculosis (Tabela 4) (1,4). Tabela 4. Classificação das MNT segundo o sistema de Runyon. São apresentadas algumas espécies exemplificativas de cada um dos grupos:

36 35 Grupo I Característica da cultura Fotocromógenas: Crescimento lento das colônias; Culturas desenvolvem pigmento amarelo somente quando expostas à luz. Exemplo: M. kansasii, M. marinum. II III Escotocromógenas: Caracteriza-se pelo crescimento lento das colônias; Culturas desenvolvem pigmento tanto na luz como no escuro. Exemplo: M. gordonae, M. szulgai. Acromógenas: Caracteriza-se pelo crescimento lento das colônias; Culturas não produzem pigmento. Exemplo: M. avium, M. terrae. IV Crescimento rápido: Caracteriza-se pelo crescimento rápido das colônias; Colônias podem ser pigmentadas ou não. Exemplo: M. fortuitum, M. chelonae, M. abscessos. Fonte: Leão SC, Martin A, Mejia GI, Palomino JC, Robledo J, Telles MA da S, Portaels F Practical Handbook for the phenotypic and genotypic identification of Mycobacteria Identificação genotípica das MNT: Devido a demora no diagnóstico de infecções provocadas pelas MNT, tornou-se necessário o desenvolvimento de métodos de identificação molecular, com uma boa relação custo-benefício e que acima de tudo sejam mais eficazes quando comparados aos métodos convencionais. Estes métodos incluem testes baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), sequenciamento de DNA, sondas genéticas, entre outros (1). O atraso de diagnóstico tem um impacto importante na escolha do tratamento mais adequado do doente, quanto mais precoce o diagnóstico mais eficaz o tratamento com uma maior chance de cura. O diagnóstico molecular consiste na análise do material genético do microrganismo através de regiões específicas do genoma de cada espécie, esta metodologia é específica e tem sido empregada na maioria dos laboratórios, estes métodos têm cada vez mais importância, porque são

37 36 mais rápidos e precisos que os métodos convencionais e na maioria dos casos, produzem resultados mais confiáveis (82). Para esse tipo de metodologia é necessário que seja realizado previamente a extração do DNA, que pode ser realizado através de vários métodos de digestão de membrana como: método enzimático por brometo de cetil trimetilamonio (CTAB), extração por choque térmico e banho ultrasônico (1). Kit comercial GenoType Mycobacterium CM-AS: Estão disponíveis no mercado o sistema da linha GenoType (Hain Lifescience, Nehren, Alemanha). O kit comercial GenoType Mycobacterium CM (do inglês Common Mycobacteria ) e o GenoType Mycobacterium AS (do inglês Additional Species ), juntos são um teste molecular que se baseia em uma técnica de PCR por segmentação de uma região do gene 23S rrna, seguida de hibridização reversa para uma fita de nitrocelulose, permitindo a identificação genética molecular simultânea de M. complexo de tuberculosis e 24 das espécies de MNT mais comuns a partir das culturas positivas. O procedimento completo é dividido em três passos: extração do DNA de cepa cultivada em meio de cultura sólido, amplificação através de técnica de PCR multiplex com primers biotinilados e hibridização reversa, realizado no prazo máximo de 2 dias. A determinação da espécie é realizada com a ajuda de uma tabela de interpretação (83). O GenoType Mycobacterium CM permite a identificação do complexo M. avium, M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. marinum-m. ulcerans, M. peregrinum, M. xenopi e o complexo M. tuberculosis. O GenoType Mycobacterium AS permite a identificação de espécies adicionais de MNT, nomeadamente M. simiae, M. mucogenicum, M. goodie, M. cellatum, M. smegmatis, M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai, M. phlei, M. hemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum e M. shimoidei (85). PRA-hsp65 (Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65).

38 37 O PRA-hsp65 (do inglês Polimerase Chain Reaction Restriction Analysis of the gene hsp65) é uma técnica não comercial, in house que tem apresentado uma boa eficácia na identificação de espécies das MNT, se baseia na amplificação do gene hsp65 e posterior análise de seu polimorfismo mediante a digestão com as enzimas de restrição BstEII e HaeIII. Foi descrito por Telenti e col. em Esse método diferencia amaioria das espécies MNT, mas não as do complexo M. tuberculosis. As variações na sequência do gene hsp65 podem ser exploradas para a identificação ao nível da espécie tanto em micobactérias de crescimento lento como em espécies de crescimento rápido (1). Resumidamente, um fragmento de 441 pares de base (pb) do gene hsp65 é amplificado por reação de PCR e digerido por duas enzimas de restrição, BstE II e Hae III. O produto dessa reação é submetido a análise através de eletroforese em gel de agarose e a determinação das espécies é feita através da leitura desse gel, de acordo com o perfil dos pares de base obtidos a partir da digestão de cada enzima específica. A determinação dos perfis eletrosféricos são comparados aos padrões de restrição de vários algoritmos encontrados no sistema on-line PRASITE através da página eletrônica: (84). Ambos os testes acima descritos são os mais utilizados e tem mostrado bons resultados na identificação das espécies das MNT bem como amostras mistas (MNT e TB) (83). Porém é importante lembrar que o método PRA-hsp65, não permite a diferenciação entre algumas espécies de micobactérias, devido a superposição de perfis de várias espécies distintas, necessitando o sequenciamento para complementação do resultado nessas situações (92). Apesar dessas limitações, o método PRA-hsp65 pode ser utilizado para a identificação preliminar das espécies de MCR mais frequentes (85). Sequenciamento de genes: As definições de espécies, inicialmente baseadas em testes fenotípicos, atualmente estão sendo baseadas no sequenciamento de vários genes essenciais ao metabolismo da célula bacteriana (48). O sequenciamento é a técnica molecular mais sensível, considerada padrão-ouro dos métodos da biologia molecular e é constantemente utilizada em estudos de identificação das espécies de micobactérias

39 38 (92). A identificação é feita através da comparação das sequências de nucleotídeos obtidas com as sequências de referência presentes em várias bases de dados. Geralmente é necessário apenas uma única reação de sequenciamento para uma identificação definitiva (93). Este método permite também a detecção direta de espécies de micobactérias que não cresceram em meios de cultura além de identificar diversas espécies possivelmente não conhecidas. Porém o sequenciamento, no entanto é um método dispendioso e necessita de técnicos e equipamento especializados, ou na ausência dos mesmos, de se recorrer a empresas especializadas (93). Essa técnica utiliza fragmentos de regiões específicas do genoma das micobacterias: hsp65, rpob e 16S rrna. Dentre estas regiões gênicas, o sequenciamento do gene hsp65 é o mais utilizado a nível de espécie e subespécie (92). O sequenciamento do gene rpob é usado como alternativa não só para identificar, mas também diferenciar as MNT entres os grupos de crescimento lento e crescimento rápido (93). O impacto na magnitude exata das infecções por MNT em países onde a TB é endêmica ainda não são conhecidos. A Região Norte do Brasil é endêmica para os casos de TB e está em constante processo de expansão devido à industrialização gerada pela Zona Franca de Manaus, é detentora da maior bacia hidrográfica e é o berço da maior parte da biodiversidade existente do mundo, possivelmente abrigue em seu ecossistema a maior parte das micobatérias. Além disso, segundo dados do Ministério da Saúde, em 2014, está no ranking das unidades da Federação com as maiores taxas de detecção e mortalidade para o HIV/AIDS. Esses fatores apontam para a necessidade de estudos mais detalhados na população da Região Norte elucidando a relação entre TB/MNT/HIV. Devido à escassez de dados de incidência, prevalência e mortalidade nos casos de MNT/HIV na Região Amazônica são necessários estudos a fim de estabelecer critérios clínicos e bacteriológicos para que se possa notificar e tratar de maneira mais eficaz.

40 39 Como as técnicas de identificação de MNT ainda não estão bem estabelecidas, aumenta a necessidade do desenvolvimento de métodos de diagnóstico laboratorial, bem como a avaliação das técnicas existentes. Dessa forma, é recomendável que a identificação em nível de espécie seja realizada por sequenciamento de DNA para a confirmação dos resultados obtidos pelo PRA-hsp65 e outros testes moleculares, como o kit comercial GenoType Mycobacterium CM-AS (86). Considerando que ainda não foram elucidadas as questões epidemiológicas das MNT nessa região e nem sua interação com os pacientes que soropositivos, esse estudo cooperará para o andamento da formulação dos critérios de controle, diagnóstico e tratamento de MNT na Região Amazônica. Visando priorizar a adequação terapêutica e obter dados que possam ser revisados a qualquer momento, é recomendável que a identificação em nível de espécie seja realizada por sequenciamento de DNA. Portanto, a confirmação dos resultados obtidos pelo PRA-hsp65 e outros testes moleculares, como o kit comercial GenoType Mycobacterium CM-AS, é realizada através do sequenciamento genético (86). Com aumento de casos de infecções por MNT aumenta a necessidade da inovação dos métodos de diagnostico laboratorial bem como a criação de técnicas mais precisas para a identificação das espécies de MNT, que hoje são laboriosos e dispendiosos. 2. OBJETIVO 2.1. Geral: Descrever e caracterizar as espécies de micobactérias não tuberculosas isoladas de amostras clínicas de pacientes com suspeita de TB atendidos em uma unidade de referência no Estado do Amazonas.

41 Específicos: Descrever os achados microbiológicos dos pacientes com suspeita de TB e amostra clinica positiva para MNT; Identificar as espécies de MNT por meio de testes moleculares; Comparar as técnicas moleculares PRA hsp65, GenoType Mycobacterium CM/AS e sequenciamento genômico das regiões hsp65 e rpob; Descrever a frequência de coinfecção MNT/TB/HIV. 3. MATERIAIS E MÉTODOS Modelo e período de estudo: Trata-se de um estudo de coorte retrospectivo de casos suspeitos de TB no período de 2011 a 2014, na Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) Amostras clínicas: As amostras foram obtidas através das buscas em livros de registros laboratoriais da Gerência de Tuberculose, foi realizado teste molecular das cepas criopreservadas positivas para MNT do período de 2011 a Os achados clínicos foram obtidos por meio do sistema de prontuário eletrônico on-line I-Doctor e no Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAM) População de referência: Amostras clínicas de pacientes admitidos com suspeita clínica de TB, com amostra encaminhada ao laboratório de tuberculose da FMT-HVD e cultura positiva para MNT no período de 2011 a 2014.

42 Critérios de elegibilidade: Análise clínica e epidemiológica: Amostras clínicas de pacientes com suspeita clínica e epidemiológica de tuberculose independente de idade, sexo e procedência (ambulatório, enfermaria, UTI e/ou pronto atendimento), caracterizados por apresentar sintomas respiratórios, achado radiológico ou tomográfico compatível com doença pulmonar por micobactéria, solicitação de exame de escarro e resultado da cultura. Análise molecular para identificação de espécie de MNT: Amostras clínicas de pacientes com achados clínico-epidemiológicos sugestivos de TB e que possuam cepa criopreservada em condições viáveis de armazenamento (quantidade, aspecto e temperatura -70ºC) Definições para confirmação laboratorial dos casos de Micobactéria não tuberculosa: Infecção pulmonar por MNT confirmada laboratorialmente: Todo paciente que apresentou exame de escarro com resultado de baciloscopia negativa ou positiva variando em +/++ ou +++, teste molecular Xpert MTB/RIF não detectável e cultura em meio sólido com crescimento confluente para MNT identificada por meio de teste fenotípico (análise de coloração e tempo de crescimento) e bioquímico (PNB, TCH e Niacina). Infecção pulmonar por MNT não confirmada laboratorialmente: Todo paciente que apresentou exame de escarro com resultado de cultura negativo, ou seja, com ausência de unidade formadora de colônia (UFC) e/ou cultura contaminada Critérios de não inclusão: Análise clínica e epidemiológica: Não foram incluídos no estudo pacientes que não tiverem amostra clínica coletada e encaminhada ao laboratório de tuberculose e/ou que não possuam resultado do exame de baciloscopia e/ou Xpert MTB/RIF e/ou cultura.

43 42 Análise molecular para identificação de espécie de MNT: Amostras clínicas que tiveram o material perdido com o tempo, que não apresentaram concentração satisfatória para análise (0,5 ml) e que após repique apresentaram contaminantes não foram submetidas aos testes moleculares e sequenciamento de DNA Procedimento laboratorial: Foi realizado o levantamento das informações laboratoriais referentes aos pacientes do estudo primeiramente através de livros de registro da Gerência de tuberculose e posteriormente buscas das cepas criopreservadas em geladeira -70ºC situada na Gerência de Bacteriologia da FMT- HVD. Para determinação e identificação de espécie as cepas rastreadas foram submetidas aos seguintes procedimentos: Identificação fenotípica: As culturas criopreservadas foram semeadas em meio de cultura sólido Ogawa Kudoh e incubadas em estufa bacteriológica à 37ºC (APÊNDICE E) para análise fenotípica através da constatação do tempo de crescimento e a presença de pigmentação conforme protocolo (APÊNDICE F). Foram submetidas a teste molecular (identificação genotípica) as cepas de isolados de espécimes cultivadas de amostras biológicas caracterizadas como Micobactéria não tuberculose que apresentaram crescimento em meio de cultura sem contaminantes Identificação genotípica: a) Etapa 1: extração de DNA Foram utilizados dois métodos: um método de extração de DNA enzimático através de CTAB (APÊNDICE D) conforme técnica descrita por van Soolingen et al (1994) e outro por sonicação (banho ultra-sônico).

44 43 Resumidamente a técnica consistia em: Inativação de cepa e extração de DNA por termobloco: As cepas crescidas foram submetidas à inativação de sua potencialidade contaminante e posterior lise de membrana através de choque térmico (APÊNDICE G), foi retirada de 2 a 3 alçadas do crescimento micobacteriano da cultura e suspensas em um microtubo contendo água ultra-pura (Gibco ), logo após a suspensão foi submetida à banho maria por 20 minutos a 99ºC. b) Etapa 2: As cepas foram submetidas a dois testes moleculares, um através de método não comercial in house e outro através de kit comercial. PCR Restriction Enzyme Analysis (PRA-hsp65): Foi realizada a amplificação deum fragmento de 441 pb do gene hsp65, comum entre as micobactérias e posterior análise de seu polimorfismo mediante a digestão com as enzimas de restrição BstEII e HaeIII (APÊNDICE H). A determinação da espécie foi realizada através da análise do gel de eletroforese, as bandas de DNA encontradas foram comparadas a padrões descritos de restrição algoritmas encontrados na página eletrônica PRASITE: Kit Comercial GenoType Mycobacterium CM-AS: O DNA extraído submetido à técnica PRA-hsp65 também foi submetido a segmentação da região do gene 23S rrna e hibridização reversa em fita de nitronucleose. Nesta fita, sondas específicas imobilizadas (tecnologia Hain LifeScience - DNA-STRIP), permitiram a identificação das seguintes espécies de micobactérias: Mycobacterium avium spp, M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrafulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/m. ulcerans, M. xenopi e CMTB (complexo M.tb). O procedimento é a partir do material cultivado. A determinação da espécie é realizada através de uma tabela de interpretação.

45 44 Os resultados obtidos das duas técnicas foram analisados e comparados entre si e por fim confirmados através da técnica de sequenciamento. c) Etapa 3: Sequenciamento do gene hsp65 e rpob. As técnicas de sequenciamento foram realizadas de acordo com os procedimentos descritos por Adekambi et al., 2003 e Selvaraju et al., Foi realizada a PCR utilizando primers específicos para a região do gene hsp65, com os oligonucleotídeo hsp667f 5 GGCCAAGACAATTGCGTACG e hsp667r 5 GGAGCTGACCAGCAGGAT e outro para a região do gene rpob, com os oligonucleotídios MycoF 5 GGCAAGGTCACCCCGAAGGG e MycoR 5 AGCGGCTGCTGGGTGATCATC. Os produtos amplificados foram purificados utilizando Polietilenoglicol (PEG) 8000/2.5 M NaCl antes do sequenciamento (APÊNDICE I). As reações de amplificação foram realizadas através de termociclador com etapa de desnaturação inicial de 96ºC por 15 segundos, 50ºC por 15 segundos e 60ºC por 4 minutos. Os produtos da PCR foram submetidos a eletroforese em gel de 1%. A reação de sequenciamento foi realizada através do equipamento ABI 3500 Genetic Analyzer com capilares de 50 cm e polímero POP7 (Applied Biosystems). Depois de marcadas foram novamente purificadas através de precipitação e desnaturação através do kit comercial BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems) e eletroinjetadas no analisador genético. Os produtos da reação de sequenciamento (conting) foram alinhados e analisados através do programa DNASTAR Lasergene7 SeqMan. Essas sequencias depois de alinhadas foram submetidas a análise comparativa utilizando o banco de dados mundial Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), essa ferramenta de bioinformática contém uma quantidade gigantesca de informação, retornando sequências mais similares e de significância estatística, encontrado no National Center for Biotechnology Information (NCBI) Coleta e análise de dados

46 45 Coleta de dados: A coleta de dados seguiu de acordo com o instrumento de coleta de dados (APÊNDICE C). Foi criado um banco de dados no software Excel, para organização de dados clínicos e laboratoriais coletados. Análise estatística dos dados: Para os dados demográficos e clínicos foram calculadas média, mediana e intervalo interquantil (IQR). A normalidade dos dados será verificada por meio do teste Kolmogorov-smirnov. Foi aplicado o teste Kappa para análise da concordância entre as técnicas moleculares utilizadas na identificação das espécies de MNT através da escala de Landis onde a concordância é classificada como: pobre (abaixo de 0), discreta (0-0,2), fraca (0,21-0,4), moderada (de 0,41-0,6), substancial (0,61-0,8), quase perfeita (0,81-1) (Landis & Koch, 1977) Considerações éticas: Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FMT-HVD, preservando os direitos dos sujeitos da pesquisa conforme os requisitos da Resolução do Conselho Nacional de Saúde 466/12 e suas complementares. 4. RESULTADOS Artigo a ser submetido BioMed Central Infectious Diseases (BMC Infectious Diseases). Caracterização de Micobactérias não tuberculosas isoladas de amostras biológicas de pacientes suspeitos de tuberculose atendidos em uma Unidade de Referência no Estado do Amazonas Characterization of non-tuberculous mycobacteria isolated from biological samples of patients suspected of tuberculosis treated at a Reference Unit in the State of Amazonas Ana Carolina de O. de Lima 1, Karen B. Schmid 2, Hilda F. de Melo 3, Rafaella Christine C. Athayde 5, Afrânio L. Kritski 4, Maria Lúcia R. Rossetti 2, Marcelo Cordeiros-Santos 1.

47 46 1. Universidade do Estado do Amazonas (UEA), AM, Brasil; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), AM, Brasil. 2. Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde (FEPPS), RS, Brasil; Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CDCT), RS, Brasil. 3. Centro Universitário do Norte (UNINORTE), AM, Brasil; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), AM, Brasil. 4. Rede Brasileira de Pesquisa em Tuberculose, Rio de Janeiro, RJ, Brasil; 5. Universidade Nilton Lins, AM, Brasil. *Autor Correspondente: Marcelo Cordeiro-Santos, PhD Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), Av. Pedro, Teixeira, 25, CEP: , Manaus, AM, Brazil (marcelocordeiro.br@gmail.com) Quantidade de palavras Abstract 358 Texto 2172 Keywords. prevalence, non-tuberculous mycobacteria, molecular techniques, HIV/AIDS. Abstract Background: Non-tuberculous mycobacteria (NTM) have been worldwide prominent because of their pathogenic potentiality. In industrialized countries with a high prevalence of tuberculosis (TB) it is possible to more and more describe MNT infections. This has generated interest in its identification and optimization of molecular methods. Materials and Methods: Retrospective study of suspected cases of TB with a positive biological sample for NTM from 2011 to 2014 at the Fundação de Medicina Tropical (FMT-HVD). Laboratory data, age, sex, HIV, CD4, viral load and molecular identification of cryopreserved strains by PRA-hsp65, GenoType Mycobacterium CM / AS and sequencing were evaluated. Results: In the study period, 20.2% (153/758) of the biological samples were positive for MNT. The median age was 33 years, 66% (37/56) were males, 77% (43/56) were HIV positive, the median viral load and CD4 + were 17,490.5 copies (IQR: 1,899-

48 ) and 244 cells / μl (IQR: ). The species identified were M. gordonae 30.4%, M. fortuitum 19.6%, Complex M. avium (MAC) 17.9%, M. abscessus 10.7% and M. kansasii 5.3%, M. mucogenicum and M. scrofulaceum represented 3.6% of the species identified. The agreement between molecular techniques was evaluated by Kappa measurement, between the PRA hsp65 technique and the commercial GenoType Mycobacterium CM/AS kit, we obtained an agreement of 81% between the commercial GenoType Mycobacterium CM/AS kit and the 76% sequencing and between the PRA hsp65 and the 74% matching sequence. The commercial kit GenoType Mycobacterium CM/AS allowed the identification of 89.3% (50/56) of the samples, with the PRA hsp65 technique it was possible to identify 66% (37/56) and with the genomic sequencing 76, 8% (43/56). Conclusion: The high prevalence of pathogenic NTM species in patients suspected of TB in the majority of HIV-positive patients warns of the need to implement laboratory techniques for the identification of MNT species by separating TB and NTM groups and also identifying cases of TB / MNT. Both techniques used in this study had an excellent identification capacity and the implementation of these techniques in the Region will depend on the characteristics of the different laboratories, the clinical needs of the institution and the predominant groups of species already evaluated in this study. Resumo Introdução: As micobactérias não tuberculosas (MNT) tem tido destaque mundial devido a sua potencialidade patogênica. Em países industrializados, com alta prevalência de tuberculose (TB) é possível descrever, cada vez mais, casos de infecções por MNT. Isso tem gerado interesse na sua identificação e na otimização de métodos moleculares. Materiais e Médodos: Estudo retrospectivo de casos suspeitos de TB com amostra biológica positiva para MNT no período de 2011 a 2014 na Fundação de Medicina Tropical (FMT-HVD). Foram avaliadas as informações laboratoriais, idade, sexo, HIV, CD4, carga viral e realizada identificação molecular de cepas criopreservadas pelo método PRA-hsp65, GenoType Mycobacterium CM/AS e sequenciamento. Resultados: No período de estudo, 20,2% (153/758) das amostras biológicas foram positivas para MNT. A mediana de idade foi de 33 anos, 66% (37/56) eram do sexo masculino, 77% (43/56) eram HIV positivo, a mediana da carga viral e CD4+ foi de

49 ,5 cópias (IQR: ) e 244 células/µl (IQR: 74,5-383,5). As espécies identificadas foram M. gordonae 30,4%, M. fortuitum 19,6%, Complexo M. avium (MAC) 17,9%, M. abscessus 10,7% e M. kansasii 5,3%, M. mucogenicum e M. scrofulaceum representaram 3,6% das espécies identificadas. Foi avaliada a concordância entre as técnicas moleculares pela medida Kappa, entre a técnica PRA hsp65 e o kit comercial GenoType Mycobacterium CM/AS obtivemos concordância de 81%, entre o kit comercial GenoType Mycobacterium CM/AS e o sequenciamento 76% e entre o PRA hsp65 e o sequenciamento 74% de concordância. O kit comercial GenoType Mycobacterium CM/AS permitiu a identificação de 89,3% (50/56) das amostras, com a técnica PRA hsp65 foi possível identificar 66% (37/56) e com o sequenciamento genômico 76,8% (43/56). Conclusão: A alta prevalência de espécies de MNT patogênicas em pacientes suspeitos de TB em em sua maioria HIV positivos alerta para a necessidade da implementação de técnicas laboratoriais para a identificação das espécies de MNT separando os grupos TB e MNT e também idenficando os casos de coinfecção TB/MNT. Ambas as técnicas utilizadas nesse estudo apresentaram uma ótima capacidade de identificação e a implementação dessas técnicas na Região dependerá das características dos diferentes laboratórios, das necessidades clínicas da instituição e dos grupos de espécies predominantes, já avaliadas nesse estudo. Introdução As micobactérias não tuberculosas (MNT) tem tido destaque mundial devido a sua potencialidade patogênica (3,4). Em países industrializados, com alta prevalência de tuberculose (TB) é possível descrever, cada vez mais, casos de infecções por MNT. Isso tem gerado interesse na sua identificação e na otimização de métodos moleculares (11,13). O aumento dos casos associados de TB e MNT nesses países ocorre principalmente devido à crescente incidência de pacientes imunocomprometidos com infecção por HIV (vírus da imunodeficiência humana) (1,16). Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) cerca de 10,4 milhões de pessoas tiveram TB em 2016 e cerca de 1,2 milhões de pessoas apresentam coinfecção TB/HIV. O Estado do Amazonas registrou coeficiente de incidência de 67,2/ hab. e ultrapassando os valores regionais e nacionais, a capital Manaus

50 49 apresentou coeficiente de incidência de 93,2/ hab. (31). No Brasil, estima-se que tenham ocorrido [ ] novas infecções pelo HIV (27,28). Os resultados da testagem para HIV entre os casos novos de TB no Brasil, apontaram para a existência de 9,7% de pessoas com a coinfecção TB/HIV. Indivíduos com HIV são mais propensos a doença causada por MNT e estão em maior risco de doença disseminada e ao contrário da TB, as MNTs são organismos ambientais com elevada diversidade patogênica e relevância clínica (33). Estudos na Nigéria e Papua-Nova Guiné revelaram que através da sintomatologia e exames de imagem ainda é impossível distinguir MNT de TB, a ausência dos resultados de cultura pode levar a resultados falso-positivos para TB e o tratamento inadequado (29,30). No Brasil, as infecções por MNT representam emergência epidemiológica e sanitária, especialmente após casos de micobactérias de crescimento rápido (MCR) em infecções pós-cirúrgicas (2003 a 2009) (10,17). Em contraste com o M. tuberculosis, cuja notificação é obrigatória, as infecções por MNT ainda não geram notificação, fora os casos de MNT pós cirúrgica e isso colabora com a escasses de dados sobre a sua verdadeira incidência e prevalência (8,9). Na Região Norte, mais precisamente Pará e Manaus, estudos revelaram a presença de MCR em água de torneira de centro cirúrgico, a análise dessas espécies revelou estirpes relacionadas a surtos de infecções pós-cirúrgicas (15,24). Sabe-se que pescadores e outras pessoas expostas aos peixes estão em risco de desenvolver infecções de pele causadas por M. marinum (25,26). Em crianças de 18 meses a 5 anos de idade o risco de desenvolver linfadenite cervical por M. avium está associado a exposição a viveiros de aves (19). Atualmente, os métodos de diagnóstico laboratorial são a baciloscopia (BAAR), a cultura microbiológica e o Xpert MTB/RIF. A baciloscopia apesar do baixo custo e simplicidade, tem uma sensibilidade muito baixa (30 a 50%). A análise microbiológica por cultura sólida ou líquida é geralmente utilizada em casos suspeitos com baciloscopia negativa, porém, apesar de sua importância, a cultura é considerada laboriosa e devido ao crescimento lento do Mycobacterium nem sempre apresenta 100% de positividade, além disso a cultura líquida não permite a visualização da morfologia da colônia em casos de infecção mista (TB/MNT) (12,29). O teste molecular Xpert MTB/RIF possui alta sensibilidade nos casos de TB, porém não detecta os casos de infecção por MNT. A diferenciação dos casos de MNT e TB são necessários para a aplicação da melhor conduta terapêutica com um diagnóstico precoce e um

51 50 tratamento imediato (2,5). Vários métodos moleculares foram desenvolvidos para a identificação de espécies de micobactérias, estes métodos incluem testes baseados na técnica PRA-hsp65 (Polimerase Chain Reaction Restriction Analysis of the gene hsp65), na PCR por segmentação da região do gene 23S rrna pelo kit comercial GenoType Mycobacterium CM/AS, sequenciamento de DNA, entre outros (7,14). Materiais e Métodos Tipo de estudo e pacientes Trata-se de um estudo de coorte retrospectivo de casos suspeitos de TB com amostra biológica positiva para MNT no período de 2011 a 2014, na Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD). As informações laboratoriais foram obtidas através das buscas em livros de registros da Gerência de Tuberculose da FMT-HVD e os achados clínicos foram obtidos através do sistema de prontuário eletrônico on-line I-Doctor e no Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAM), as variáveis coletadas foram idade, sexo, HIV, CD4, carga viral e tratamento. Amostras Foi realizado o levantamento das informações clinico-laboratoriais referentes aos pacientes do estudo, usando como critério de elegibilidade os resultados da baciloscopia, cultura líquida ou sólida e Xpert MTB/RIF para posterior busca das cepas positivas para MNT, criopreservadas em geladeira -70ºC situada na Gerência de Bacteriologia da FMT- HVD. Foram recuperadas da criogenia um total de 56 cepas previamente identificadas como pertencentes ao grupo das MNT. Identificação genotípica As cepas foram submetidas a análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65 (PRA), ao kit comercial GenoType Mycobacterium CM- AS e sequenciamento genômico da região hsp65 e rpob respectivamente. PRA-hsp65 - in house : Foi feita a amplificação e a digestão do gene hsp65 com as enzimas de restrição BstEII e HaeIII (Telenti et al., 1993). O produto dessa reação foi submetido a análise através de eletroforese em gel de agarose e a determinação das espécies feita através da leitura desse gel, de acordo com o perfil dos pares de base obtidos a partir da digestão de cada enzima específica. A determinação dos perfis

52 51 eletrosféricos foram comparados aos padrões de restrição de vários algoritmos encontrados no sistema on-line PRASITE através da página eletrônica: GenoType Mycobacterium CM/AS: O ensaio Mycobacterium CM/AS foi realizado de acordo com instruções do fabricante [Hain Lifescience, Nehren, Alemanha]. Sequenciamento: Foram utilizados primers para a região do gene hsp65 e região rpob e os produtos amplificados purificados com Polietilenoglicol (PEG) 8000/2.5 M NaCl. As reações de amplificação foram realizadas através de termociclador com etapa de desnaturação inicial de 96ºC por 15 segundos, 50ºC por 15 segundos e 60ºC por 4 minutos. A reação de sequenciamento foi realizada através do equipamento ABI 3500 Genetic Analyzer com capilares de 50 cm, polímero POP7 (Applied Biosystems) e purificadas através do kit comercial BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems). Os produtos da reação de sequenciamento foram alinhados e analisados através do programa DNASTAR Lasergene7 SeqMan e comparadas com o banco de dados mundial Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Adekambi et al., 2003 e Selvaraju et al., 2005). Análise estatística A análise estatística foi realizada utilizando o programa estatístico SPSS v.21 (SPSS Ins. Chicago, IL, EUA). A concordância entre os métodos foi avaliada usando o escore Kappa. Resultados População e amostras O fluxograma 1 mostra a distribuição do total de pacientes atendidos com suspeita TB na FMT-HVD no período de 2011 a 2014, nesse período 758/3.202 (23,7%) amostras tiveram resultado de cultura positiva para micobactéria sendo 153/758 (20,2%) positivas para MNT e 9/758 (1,2%) apresentaram crescimento de MNT/TB. A mediana de idade, dos pacientes cujo as cepas foram identificadas foi de 33 anos, 37/56 (66%) eram do sexo masculino, 43/56 (77%) eram HIV positivo (Gráfico 1), a mediana da carga viral e CD4+ foi de ,5 cópias (IQR: ) e 244 células/µl (IQR: 74,5-383,5) respectivamente, segundo dados complementares, dos pacientes com suspeita de TB, 5/56 (9%) tiveram desfecho de óbito, as espécies de MNT identificadas nesse grupo foram, M. avium, M. gordonae e M. fortuitum, não havia

53 52 informações sobre o tratamento para MNT, desses 3/5 (60%) realizaram tratamento anti-tb (Tabela 1). Na tabela 2 encontra-se as informações complementares sobre tratamento anti-tb e MNT dos pacientes que tiveram suas cepas submetidas a análise molecular. Análise laboratorial e molecular As cepas selecionadas da criogenia foram submetidas a testes de viabilidade baseados em baciloscopia pela coloração ZN e coloração de GRAM para visualização de possíveis contaminantes como fungos e bactérias, excluída a hipótese de contaminação, essas cepas foram repicadas em meio de cultura sólido (OK) para análise de crescimento e incubadas em estufa bacteriológica (35ºC). Das cepas repicadas em meio de cultura sólido, apenas 10,7% (6/56) não apresentarem crescimento em meio sólido, essas foram submetidas aos processos de purificação, inativação e extração de DNA pelo método CTAB e posterior análise molecular (Fluxograma 2). Foram coletadas as informações sobre os resultados de baciloscopia e GeneXpert (Xpert MTB/RIF) das cepas identificadas, 14,28% (8/56) tiveram baciloscopia positiva variando entre +/++ e 8,92% (5/56) foram submetidos a técnica Xpert MTB/RIF com resultado não detectável para TB, 80,37% (45/56) dos pacientes suspeitos de TB não tiveram amostras processadas no Xpert MTB/RIF, nesse período (de 2011 a 2014) poucas amostras pulmonares foram submetidas a técnica Xpert MTB/RIF pois a mesma encontrava-se em fase de implementação. Foi possível a identificação de 87,5% (49/56) das cepas criopreservadas, em sua maioria amostras pulmonares. As espécies de MNT identificadas foram respectivamente 30,4% (17/56) M. gordonae, 19,6% (11/56) M. fortuitum, 17,9% (10/56) M. avium/intracellulare, 10,7 (6/56) M. abscessus e 5,3 (3/56) M. kansasii, M. mucogenicum e M. scrofulaceum representaram 3,6% (2/56) das espécies identificadas, todas de importância clínica elevada, 12,5% (7/56) não foram identificadas como pertencentes ao complexo MNT (Tabela 5). Das espécies de MNT identificadas o sítio biológico pulmonar teve maior ocorrência das espécies M. gordonae 39,5% (17/43), M. fortuitum 23,2% (10/43), complexo MAC 13,9% (6/43), M. abscessus 11,6% (5/43), M. kansasii 7,2% (3/43) e no sítio extrapulmonar a espécie que com maior predomínio foi complexo MAC 66,8% (4/6) em amostras de sangue e medula óssea (Tabela 7), 73,5% (36/49) pertenciam a

54 53 população de pacientes HIV positivo, 20,4% (10/49) de pacientes sem informação sobre HIV e 6,1% (3/49) HIV negativo. Foi avaliada a concordância entre as técnicas moleculares pela medida Kappa, entre a técnica PRA hsp65 e o kit comercial GenoType Mycobacterium CM/AS obtivemos concordância de 73,21% (41/56), entre o kit comercial GenoType Mycobacterium CM/AS e o sequenciamento 76,79% (43/56) e entre o PRA hsp65 e o sequenciamento 67,86% (38/56) de concordância (Tabela 6). Na análise de Kappa é possível verificar que discreta concordância na compração das técnicas entre si, acredita-se que pelo pequeno número de amostras analisadas. O kit comercial GenoType Mycobacterium CM/AS mostrou eficaz identificação, permitiu a identificação de 89,3% (50/56) das amostras, com a técnica PRA hsp65 foi possível identificar 66% (37/56) e com o sequenciamento genômico 76,8% (43/56). Dessas amostras 5,35% (3/56) foram inconclusivas em ambas as técnicas moleculares, acredita-se que pelas condições da cepa em criogenia (cepas antigas e em pouca quantidade) tivemos também limitações nos resultados do sequenciamento genômico. Discussão Nossos achados remetem a estudos que relatam as possíveis hipóteses para a baixa incidência e prevalência de MNT em regiões endêmicas para TB, como a ausência de notificação dos casos de MNT, a sobreposição de manifestações clínicas de TB e MNT, a falta de infra-estrutura adequada para a identificação de MNT e devido a alta carga de TB, toda a atenção dos trabalhadores da saúde e do governo é direcionado para o M. tuberculosis (36). Nesses casos o paciente pode facilmente ser tratado como um caso de TB revelando um problema de saúde públicas e ética. Foi observado também um número elevado de baciloscopias negativas (73,21%), o que contribui para a demora no diagnóstico, um estudo em uma região endêmica para TB (Zambia) mostrou que a prevalência de MNT era maior em pacientes com baciloscopia negativa (94,47%) (37). A identificação das MNTs é laboriosa e demorada, em alguns casos não sendo possível a identificação de espécie pelos métodos convencionais devido ao aumento do número de espécies de Mycobacterium e a sobreposição das características fenotípicas, com isso é necessário a implementação de técnicas moleculares para o diagnóstico diferencial (4).

55 54 Em um levantamento realizado pela ANVISA em 2010 no Brasil verificou-se que limitações enquanto a realização da cultura, no período de 1998 a 2009 não haviam informação quanto ao resultado de culturas para micobactérias em 41,7% (N: 1.035) dos casos e para os 846 (33,6%) casos com resultado positivo, devido a escasses de métodos moleculares para identificação de espécie de MNT apenas 792 casos foram identificados (31,4%) (62, 63). Nesse estudo foi possível avaliar dois métodos moleculares (PRA hsp65 e o GenoType Mycobacterium CM/AS), usando como padrão de comparação o sequenciamento genômico, o kit comercial GenoType Mycobacterium CM/AS mostrou-se eficaz em identificar as espécies que pela técnica PRA hsp65 encontravam-se inconclusivas, identificando possíveis contaminantes como bactérias com alto teor de guanina e citosina. Foi constatado que os casos suspeitos de TB que apresentaram MNT em seus isolados eram em sua maioria pacientes HIV positivos com espécies de MNT de elevada importância clínica, espécies que podem facilmente levar a óbito. As MNTs e o homem ocupam os mesmos habitats, e devido ao crescente aumento de indivíduos suscetíveis às infecções por micobactérias a sua prevalência vem aumentando. A MNT predominante nesse estudo foi M. gordonae que é considerada saprófita, porém em pacientes soropositivos pode causar infecções pulmonares e cutâneas (18,21). A ocorrência de MNT (21,4%) nesse estudo, no período de quatro anos, pode ser comparada com outro estudo na região de São José do Rio Preto - Instituto Adolfo Lutz - no período de 10 anos (entre 1996 e 2005) registrando cerca de 24,4% de isolados positivos para MNT sendo as espécies predominates Mycobacterium avium complex, 182 (57,4%); M. gordonae, 33 (10,4%) e M. fortuitum, 25 (7,9%) (32). Entre as espécies de MNT, o complexo MAC comumente causa doença disseminada em imunocomprometidos (34), e em países desenvolvidos, MAC é uma das espécies mais relacionadas com mortalidade em HIV (19,35). Conclusão Os resultados obtidos mostraram a importância do diagnóstico diferencial possibilitando um tratamento precoce e adequado. A prevalência de espécies de MNT patogênicas e de alta relevância clínica em pacientes HIV positivos alerta para a necessidade da implementação de técnicas laboratoriais para a identificação das

56 55 espécies de MNT nessa população, separando os grupos TB e MNT e também idenficando os casos de coinfecção TB/MNT. Com base nesses achados, observou-se: a) uma elevada prevalência de MNT de importância clínica acometendo em sua maioria pacientes soropositivos; b) que cerca de 25% dos pacientes com MNT foram tratados como TB, e c) o kit comercial Genotype Mycobacterium CM/AS detectou a espécie de MNT em 89% das amostras. Torna-se urgente a implementação de técnicas moleculares para diagnóstico de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos em referência para HIV. Agradecimentos Universidade do Estado do Amazonas (UEA), AM, Brasil; Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde (FEPPS), RS, Brasil; Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), AM, Brasil. Referencias 1. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactérias - Ministério da Saúde, 2008; 2. Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria. This official statement of the American Thoracic Society was approved by the Board of Directors, March Medical Section of the American Lung Association. Am. J. Respir Crit Care Med. 1997; 156 (2 Pt 2): S1-25. Review; 3. Nasiri MJ, Dabiri H, Darban-sarokhalil D. Prevalence of Non-Tuberculosis Mycobacterial Infections among Tuberculosis Suspects in Iran: Systematic Review and Meta-Analysis. 2015; 1 9; 4. Hoshino Y, Suzuki K.Differential diagnostic assays for discriminating mycobacteria, especially for nontuberculous mycobacteria: what does the future hold? /FMB Future Medicine Ltda.; 5. Ingen J Van. Diagnosis of Nontuberculous Mycobacterial Infections. 2013; 1(212); 6. Ministério da Saúde (BR). Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Alerta sobre infecções por micobactéria não tuberculosa após vídeocirurgia. Brasília (DF): Ministério da Saúde; Disponível em: em 17 junho/2015; 7. Richter E, Rusch GS, Hillemann D. Evaluation of the GenoType Mycobacterium Assay for identification of mycobacterial species from cultures. J Clin Microbiol. 44 (5): , Wu U, Holland SM. Host susceptibility to non-tuberculous mycobacterial infections. 2015; 15(15); 9. Sexton P, Harrison AC. Susceptibility to nontuberculous mycobacterial lung disease. Eur. Respir J. Jun 2008; 31 (6): DOI: / , ; 10. Isolamento de micobactérias provenientes de amostras clínicas da região de Rio Claro: análise da frequência, Rev. Inst. Adolfo Lutz (Impr.) vol.70 Nº. 4 - São Paulo

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59 58 Fluxograma 1. Informações de positividade em cultura e identificação laboratorial por método convencional (teste fenotípico e bioquímico) no período de 2011 a 2014.

60 59 Fluxograma 2. Etapas do procedimento laboratorial. Diagnóstico de HIV 3% 20% HIV positivo (43/56) Sem informação (10/56) HIV negativo (3/56) 77% Gráfico 1. Distribuição dos casos de HIV em pacientes suspeitos de TB com amostra positiva para MNT (N:56).

61 60 Tabela 5. Informações sobre os resultados de baciloscopia, Xpert MTB/RIF e testes moleculares de identificação de espécie (N: 50 pulmonar/ N: 6 extrapulmonar): Variável Número Porcentagem (%) Xpert MTB/RIF (N: 56) Não realizado 45 80,37 Não detectável 5 8,92 Não se aplica 6 10,71 Baciloscopia (N:56) Negativa 41 73,21 Positiva (+/++) 8 14,28 SI/Não realizada 7 12,51 Identificação molecular (N: 56) M. gordonae 17 30,35 M. fortuitum 11 19,64 M. avium/intracellulare 10 17,85 M. abscessus 6 10,71 M. kansasii 3 5,35 M. mucogenicum 1 1,80 M. scrofulaceum 1 1,80 Complexo M. tuberculosis 1 1,80 Bactérias com alto teor de guanina e 3 5,35 citosina (incluso Rhodococcus) Inconclusiva (nas três técnicas) 3 5,35 Fonte: Dados de baciloscopia e GeneXpert coletados dos livros de registros laboratoriais da Gerência de Tuberculose FMT/HVD. Tabela 6. Análise Kappa entre as técnicas moleculares: Técnica molecular Kappa Concordância P PRA hsp65 e Sequenciamento genômico GenoType Mycobacterium CM/AS e Sequenciamento genômico PRA hsp65 e GenoType Mycobacterium CM/AS 0,223 67,86% 0,000 0,198 76,79% 0,000 0,283 73,21% 0,000

62 61 Tabela 7. Distribuição das espécies de MNT identificadas e sorologia para HIV: Amostras identificadas (N: 49) Pulmonar N: 43 (87,75%) Extrapulmonar N: 6 (12,25%) Espécie N (%) HIV+ SI (%) HIV- (%) HIV+ HIV- (%) SI (%) (%) (%) M. gordonae 17 25,6 11,6 2, (11/43) (5/43) (1/43) M. fortuitum 11 18,6 (8/43) 2,3 (1/43) 2,3 (1/43) ,6 (1/6) M. avium/intracellulare 10 11,6-2,3 66,8 - - (5/43) (1/43) (4/6) M. abscessos 6 9,3 (4/43) 2,3 (1/43) ,6 (1/6) M. kansasii 3 7, (3/43) M. mucogenicum 1 2, (1/43) M. scrofulaceum 1 _ 2,3 (1/43) SI: Sem informação.

63 62 Dados complementares: Tabela 1. Características basais dos indivíduos com isolados positivos para MNT: Variável Número Porcentagem/IQR Idade, mediana 33 28,00-47,50 CD4, mediana ,5-383,5 CD4 <100 8/30 26,6% CD /30 73,3% Carga viral, mediana , Sexo masculino 37/56 66% Notificados SINAM** 13/56 23,2% Óbito* 5/56 9% M. gordonae 2/5 40% M. fortuitum 2/5 40% M. avium 1/5 20% Tratamento MNT (óbito) Sem informação Sem informação Tratamento TB (óbito) 3/5 6% TARV 15/56 26,7% Sem informação sobre uso de TARV 41/56 73,3% *Fonte: Dados do sistema de prontuário virtual I-doctor; **SINAN/TB - FMT/AM Tabela 2. Informação sobre tratamento anti-tb e MNT: Variável (N: 56) Número Porcentagem (%) Tratamento TB/ Espécie* 18/56 32 M. avium/intracellulare 5/18 27,8 M. fortuitum 4/18 22,3 M. gordonae 3/18 16,6 Não identificada 3/18 16,6 M. abscessus 2/18 11,2 Rhodococcus sp. 1/18 5,5 Tratamento MNT/Espécie** 5/56 9 M. abscessus 2/5 40 M. gordonae 1/5 20 M. fortuitum 1/5 20 M. avium 1/5 20 Sem informação sobre tratamento 33/56 59 *Drogas anti-tb prescritas: RIPE (RMP+INH+PZA+EMB), INH+RMP, INH; **Drogas MNT: CIPROFLOXACINA e/ou CLARITROMICINA e/ou AMICACINA.

64 63 5. DISCUSSÃO: Nossos achados remetem a estudos que relatam as possíveis hipóteses para a baixa incidência e prevalência de MNT em regiões endêmicas para TB, como a ausência de notificação dos casos de MNT, a sobreposição de manifestações clínicas de TB e MNT, a falta de infra-estrutura adequada para a identificação de MNT e devido a alta carga de TB, toda a atenção dos trabalhadores da saúde e do governo é direcionado para o M. tuberculosis (36). Nesses casos o paciente pode facilmente ser tratado como um caso de TB revelando um problema de saúde públicas e ética. Foi observado também um número elevado de baciloscopias negativas (73,21%), o que contribui para a demora no diagnóstico, um estudo em uma região endêmica para TB (Zambia) mostrou que a prevalência de MNT era maior em pacientes com baciloscopia negativa (94,47%) (37). A identificação das MNTs é laboriosa e demorada, em alguns casos não sendo possível a identificação de espécie pelos métodos convencionais devido ao aumento do número de espécies de Mycobacterium e a sobreposição das características fenotípicas, com isso é necessário a implementação de técnicas moleculares para o diagnóstico diferencial (4). Nesse estudo foi possível avaliar dois métodos moleculares (PRA hsp65 e o GenoType Mycobacterium CM/AS), usando como padrão de,comparação o sequenciamento genômico, o kit comercial GenoType Mycobacterium CM/AS mostrou-se eficaz em identificar as espécies que pela técnica PRA hsp65 encontravam-se inconclusivas, identificando possíveis contaminantes como bactérias com alto teor de guanina e citosina. Foi constatado que os casos suspeitos de TB que apresentaram MNT em seus isolados eram em sua maioria pacientes HIV positivos com espécies de MNT de elevada importância clinica, espécies que podem facilmente levar a óbito. As MNTs e o homem ocupam os mesmos habitats, e devido ao crescente aumento de indivíduos suscetíveis às infecções por micobactérias a sua prevalência vem aumentando. A MNT predominante nesse estudo foi M. gordonae que é considerada saprófita, porém em pacientes soropositivos pode causar infecções pulmonares e cutâneas (18,21). A ocorrência de MNT (21,4%) nesse estudo, no período de quatro anos, pode ser comparada com outro estudo na região de São José do Rio Preto - Instituto Adolfo

65 64 Lutz - no período de 10 anos (entre 1996 e 2005) registrando cerca de 24,4% de isolados positivos para MNT sendo as espécies predominates Mycobacterium avium complex, 182 (57,4%); M. gordonae, 33 (10,4%) e M. fortuitum, 25 (7,9%) (32). Entre as espécies de MNT, o complexo MAC comumente causa doença disseminada em imunocomprometidos (34), e em países desenvolvidos, MAC é uma das espécies mais relacionadas com mortalidade em HIV (19,35). 6. CONCLUSÃO: As técnicas de PRA-hsp65, GenoType Mycobacterium CM/AS e o sequenciamento genômico, utilizadas nesse estudo, se mostraram bastante discriminatórias na identificação de diferentes espécies de MNT. Foi possível a identificação das espécies de MNT predominantes na região Amazônica bem como a prevalência de espécies de MNT causando doença em pacientes soropositivos para o HIV. Observa-se a necessidade da implementação de técnicas laboratoriais para a identificação das espécies de MNT nessa população, separando os grupos TB e MNT e também idenficando os casos de coinfecção TB/MNT, esses achados revelaram a importância da identificação das espécies de MNT para um tratamento adequado. Com base nesses achados é possível concluir que existe uma elevada prevalência de MNT de importância clínica acometendo em sua maioria pacientes soropositivos; cerca de 25% dos pacientes com MNT foram tratados como TB, e o kit comercial Genotype Mycobacterium CM/AS detectou a espécie de MNT em 89% das amostras. Por fim, torna-se urgente a implementação de técnicas moleculares para diagnóstico de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos em referência para HIV. Por fim observou-se: a) uma elevada prevalência de MNT de importância clínica acometendo em sua maioria pacientes soropositivos; b) que cerca de 25% dos pacientes com MNT foram tratados como TB, e c) o kit comercial Genotype Mycobacterium CM/AS detectou a espécie de MNT em 89% das amostras. Torna-se

66 65 urgente a implementação de técnicas moleculares para diagnóstico de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos em referência para HIV. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactérias - Ministério da Saúde, 2008; 2. Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria. This official statement of the American Thoracic Society was approved by the Board of Directors, March Medical Section of the American Lung Association. Am. J. Respir Crit Care Med. 1997; 156 (2 Pt 2): S1-25. Review; 3. Nasiri MJ, Dabiri H, Darban-sarokhalil D. Prevalence of Non-Tuberculosis Mycobacterial Infections among Tuberculosis Suspects in Iran: Systematic Review and Meta-Analysis. 2015; 1 9; 4. Hoshino Y, Suzuki K. Differential diagnostic assays for discriminating mycobacteria, especially for nontuberculous mycobacteria: what does the future hold? /FMB Future Medicine Ltda.; 5. Ingen J Van. Diagnosis of Nontuberculous Mycobacterial Infections. 2013; 1(212); 6. Ministério da Saúde (BR). Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Alerta sobre infecções por micobactéria não tuberculosa após vídeocirurgia. Brasília (DF): Ministério da Saúde; Disponível em: em 17 junho/2015; 7. Gorocica P, Jiménez-Martínez MC, Garfias Y, Sada I, Lascurain R. Componentes glicosilados de la envoltura de Mycobacterium tuberculosis que intervienen en la patogénesis de la tuberculosis. Rev Inst Nal Enf Resp Mex. 2005;18(2): ; 8. Wu U, Holland SM. Host susceptibility to non-tuberculous mycobacterial infections. 2015; 15(15); 9. Sexton P, Harrison AC. Susceptibility to nontuberculous mycobacterial lung disease. Eur. Respir J. Jun 2008; 31 (6): DOI: / , ; 10. Kahkouee S, Esmi E, Moghadam A, Karam MB, et al. Multidrug resistant tuberculosis versus non-tuberculous mycobacterial infections: a CT-scan challenge; Braz. J. Infectidis. 2013;17(2): ; 11. WHO (World Health Organization) 2015.Library Cataloguing in Publication Data. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT Disponível em: Acesso em: 01 de janeiro/2016; 12. WHO World Health Organization. The Global Plan to Stop TB Disponível em: Note _Global Plan.pdf. Acesso em: 14 de março/2015; 13. Brasil. Ministério da Saúde. Boletim Epidemiológico - O controle da tuberculose no Brasil: avanços, inovações e desafios. [Internet]. Disponível em: pdf. Acesso em: 02 de Dezembro/2015; 14. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Boletim Especial Tuberculose. Volume 43, março Disponível em:

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73 APÊNDICE 72

74 73 Apêndice A Equipe Nome Marcelo Cordeiro dos Santos Maria Lúcia Rosa Rossetti Ana Carolina de Oliveira de Lima Rossicléia Lins Monte Cynthia Pessoa das Neves Maria Francisca de Souza Rodrigues Formação (Titulação) Instituição Participação no projeto Médico, Doutor FMT/HVD - AM Orientador Farmacêutica, FEPPS/RS Co-orientadora Doutora Biomédica, FMT/HVD - UEA Aluna de Mestrado Especialista Farmacêutica, FMT/HVD Gerência de Mestre Bacteriologia Fisioterapeuta, FMT/HVD - UEA Colaboradora/Alun Especialista a de Mestrado Enfermeira, FMT/HVD - UEA Colaboradora/Alun Especialista a de Mestrado Hilda Ferreira de Melo Acadêmica do curso de Farmácia FMT/HVD - PAIC Colaboradora/Alun a de Iniciação Científica Rafaella Athayde Acadêmica do UNI-NILTON LINS Colaboradora curso de Medicina Karen Schmid Biomédica, Mestre FEPPS/RS Colaboradora/Alun a de Doutorado

75 74 Apêndice B Cronograma Nº Meta Atividade Levantamento Bibliográfico R R R R R R R R R R R R 2 Cumprimento dos créditos das disciplinas R R R R R R R R R R 3 Sequenciamento de DNA Micobacteriano R 4 Coleta de dados retrospectivos R R R R R R R R 5 Análise de dados R R R Treinamento técnicas de sequenciamento 6 de DNA Micobacteriano R R 7 Análise do projeto para qualificação R Nº Meta Atividade de Levantamento Bibliográfico R R R R R R R R R R R R 2 Qualificação R Adequação às modificações exigidas pela 3 qualificação R R 4 Encaminhamento para o CEP R R 5 Análise de dados para defesa do projeto R 3 Apresentação em eventos científicos R R R Nº Meta Atividade de Defesa do projeto de Mestrado E 2 Elaboração do artigo para revista científica E E E E E E E E R E Realizado Em andamento

76 75 Apêndice C Orçamento A. Teste de viabilidade da cepa Micobacteriana: INSUMO QUANTIDADE VALOR TOTAL Caixa Criobox para tubos 5 cx 117,00 585,00 Meio de Cultura LJ 1000 g 464,00 928,00 Middlebrook ADC Enrichment 1 VL 316,00 316,00 Middlebrook 7H9 500 g 1.130, ,00 Criotubos (2.0 ml) 1 pct 2.145, ,00 Pipeta Pasteur Descartável Estéril 2 pct 136,00 272,00 Alças Calibradas Estéreis (1uL) 1 pct 1.172, ,00 B. Teste molecular PRA (PCR Análise por Enzima de Restrição): INSUMO QUANTIDADE VALOR TOTAL Primers Tb11 e Tb12 25 pmol 250,00 250,00 Água ultrapura 500 ml 119,00 119,00 Taq DNA Polimerase (a comum) 500 u 997,00 997,00 (acompanha tampão 10X MgCl 2) dntps (diluição a 10 mm) 4 x 250 µl 368,00 368,00 Glicerol 1L 247,00 247,00 Enzimas HAe III e BstEII:. 1 de cada (2, ,00 734,00 u) Ladder 25pb 20 aplicações 755,00 755,00 Ladder 50pb 100 reações 330,00 330,00 GenoType Mycobacterium CM/AS 2 kits (98 reações) 0,00 Financiamento biomérieux C. Inativação e extração de DNA Micobacteriano: INSUMO QUANTIDADE VALOR TOTAL NaCl (Cloreto de Sódio) 1 kg Pó CTAB (Cetyl 100 g 581, ,00 trimethylammonium bromide) Clorofórmio (Reagente) 1L 409,00 409,00 Etanol 1L 605,00 605,00 TRIS HCL (Cloridrato) 100 g 2, ,00 EDTA (Sal dissódico) 250 g 454,00 454,00

77 76 Dodecilsulfato de sódio (SDS) 100 g Proteinase K 25 mg Agarose para Eletroforese checagem comum 500 g 1.658, ,00 Agarose para eletroforese 500 g , ,00 Reação de clivagem Microtubo Eppedendorf 0,5 ml 2 pcts 172,00 344,00 Microtubo Eppedendorf 0,2 ml 2 pcts 172,00 344,00 Microtubo Eppendorf 1,5 ml 1 pct 673,00 673,00 Pipeta Eppendorf multivolume , ,00 volume μl Pipeta Eppendorf multivolume , ,00 Volume μl Ponteiras com filtro (0,1-10 μl) 10 cxs com , ,00 ponteiras Ponteiras com filtro 10 cxs c/ ,00 ( μl) ponteiras 1.260,00 TOTAL: ,00

78 77 Apêndice D Procedimento operacional para extração de DNA de Micobactérianão tuberculosa por CTAB PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE MICOBACTÉRIAS POP Nº 001 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 1/2 EXTRAÇÃO DE DNA DE MICOBACTÉRIAS PELO MÉTODO CETRIMIDA/CLORETO DE SÓDIO (CTAB/NaCl). ELABORAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima APLICAÇÃO: Laboratório da Gerência de Tuberculose REVISÃO: Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti APROVAÇÃO: Drº Marcelo Cordeiro dos Santos OBJETIVO: Extrair o DNA genômico de isolados de espécimes de Micobactérias não tuberculosas e pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis para análise pelos métodos de biologia molecular. EQUIPAMENTOS: a) Banho-maria a 36 ± 1ºC e 59 ± 1ºC; b) CSB; c) Microcentrífuga; d) Micropipetas automáticas; INSUMOS: a) Microtubos de polipropileno de 0,2 e 1,5 ml estéreis, livres de Dnase. b) Ponteiras com barreira estéreis. REAGENTES: a) TE tampão 10x; b) Proteína K; c) Solução de Lisozima; d) SDS 10%; e) Água ultra pura; f) Clorofórmio; g) NaCl 5M; h) Etanol (GELADO).

79 78 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE MICOBACTÉRIAS POP Nº 001 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 2/2 EXTRAÇÃO DE DNA DE MICOBACTÉRIAS PELO MÉTODO CETRIMIDA/CLORETO DE SÓDIO (CTAB/NaCl). ELABORAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima APLICAÇÃO: Laboratório da Gerência de Tuberculose REVISÃO: Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti APROVAÇÃO: Drº Marcelo Cordeiro dos Santos DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: 1 Em um microtubo de 2mL, pipetar 567 µl de TE 1x; 2 Adicionar ao microtubo o máximo de colônias possível; 3 Adicionar 3 µl de Proteinase K (10mg/mL) e 30 µl de SDS 10%. Vortexar bem e por pelo menos 1 minuto (Passo muito importante!); 4 Incubar em banho seco por 1 hora à 37 C (aqui a solução se torna clara, viscosa e ocorre a inativação da cepa); 5 Retirar os tubos do banho e ajustar a temperatura para 65 C; 6 Adicionar 100 µl de NaCl 5M e 80 µl de CTAB/NaCl e vortexar bem; 8 Incubar por 10 minutos à 65 C; 9 Pipetar 750 µl de Clorofórmio, vortexar bem e centrifugar por 5 minutos em velocidade máxima; 10 Transferir o sobrenadante para um microtubo de 1,5mL (cuidado para não deslocar a película que divide o sobrenadante da sujeira); 11 Adicionar 450 µl de etanol absoluto GELADO e mexer o tubo para precipitar o DNA (Aqui é possível enxergar o DNA); 12 Centrifugar por 5 minutos em velocidade máxima; 13 Descartar o sobrenadante e dar leves batidinhas em um papel absorvente para retirar o máximo possível do etanol. Depois disso, deixar os tubos virados apoiado no papel para que mais etanol seja absorvido; 14 Secar por 10 minutos à 70 C com a tampa do tubo aberta; 15 Ressuspender o DNA em 100 µl de água ultra pura caso o pellet esteja visível. Se o pellet não estiver visível, ressuspender em 50 µl; 16 Incubar por 10 minutos à 70 C. Depois, quantificar; REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Devallois A, et al. Rapid Identification of Mycobacteria to Species Level by PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of the hsp65 Gene and Proposition of an Algorithm To Differentiate 34 Mycobacterial Species. Journal of Clinical Microbiology. v.35, p ; 2. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactérias - Ministério da Saúde, 2008; 3. Cardoso CM. Avaliação de técnicas moleculares para identificação de Micobactérias não causadoras de tuberculose. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal do Rio Grande Sul Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Porto Alegre BR-RS, 2012.

80 79 Apêndice E - Procedimento operacional padrão para o congelamento e recuperação de cepa de Micobactéria não tuberculosa PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARACONGELAMENTO E RECUPERAÇÃO DE CULTURAS DE POP Nº 002 Data: 26/03/2016 MICOBACTÉRIAS REVISÃO: 00 Pág. 1/3 RECUPERAÇÃO E CONGELAMENTO DE CULTURAS DE MICOBACTÉRIAS EM MEIO LÍQUIDO A 70ºC. ELABORAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima APLICAÇÃO: Laboratório da Gerência de Tuberculose REVISÃO: Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti APROVAÇÃO: Drº Marcelo Cordeiro dos Santos CONCEITO: O procedimento de recuperação de cepa micobacteriana é utilizado para verificação da viabilidade de cepa submetida a congelamento em temperatura -70ºC. As cepas são congeladas em meio de cultura líquido e ficam catalogadas e identificadas para o controle dos resultados diagnósticos bem como pesquisas futuras. PRECAUÇÕES: A manipulação das culturas para o congelamento deve ser realizada em CSB. As cepas devem ser congeladas com 3 a 4 semanas de incubação. A manipulação incorreta dos congeladores a -20ºC ou -70ºC acarreta risco de queimadura e ferimento grave ao manipulador, por isso utilize luvas para baixas temperaturas. Fazer o controle de qualidade da temperatura dos congeladores -20ºC ou -70ºC diariamente, para manter a viabilidade das cepas congeladas. EQUIPAMENTOS: a. Cabine de Segurança Biológica (CSB); b. Congelador/freezers a -20ºC ou a -70ºC. REAGENTES: a. Meio de congelamento: Meio líquido Middlebrook 7H9 com OADC e 10% de glicerol INSUMOS: a. Criotubos de polipropileno de 2,0 ml (próprios para suportar temperaturas baixas) com tampa de rosca, estéril, devidamente identificados com os números das culturas a serem congeladas; b. Alças descartáveis estéreis; c. Suporte para criotubos; d. Caixas de poliestireno numeradas para armazenamento dos criotubos nos congeladores; e. Caneta indelével, de retroprojetor escrita fina. f. Culturas puras de micobactérias em meio sólido ou líquido.

81 80 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARACONGELAMENTO E RECUPERAÇÃO DE CULTURAS DE POP Nº 002 Data: 26/03/2016 MICOBACTÉRIAS REVISÃO: 00 Pág. 2/3 RECUPERAÇÃO E CONGELAMENTO DE CULTURAS DE MICOBACTÉRIAS EM MEIO LÍQUIDO A 70ºC. ELABORAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima APLICAÇÃO: Laboratório da Gerência de Tuberculose REVISÃO: Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti APROVAÇÃO: Drº Marcelo Cordeiro dos Santos DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: PREPARO DO MEIO DE MIDDLEBROOK 7H9: O meio de Middlebrook 7H9 é preparado a partir de base disponível comercialmente e suplementado com OADC após a esterilização da base. 1. Para preparar ml de meio dissolver 4,7 gramas do meio base em 800 ml de água deionozada. Adicionar 100 ml de glicerol. 2. Autoclavar por 15 minutos a 127ºC. Aguardar até que esfrie e adicionar 100 ml de OADC. 3. Armazenar em geladeira. Colocar um rótulo contendo o nome do meio, nº do lote, data do preparo e de validade. 4. Dependendo da quantidade de cepas congeladas na rotina do laboratório pode se fazer este meio em menor volume ou fazer 5 alíquotas de 200 ml. Isto evita a contaminação do meio. PREPARO DAS CEPAS A SEREM CONGELADAS: 1. Identificar os criotubos com os números dos isolados bacterianos ou nome das cepas a serem congeladas; 2. Colocar 1 ml de meio de congelamento em cada criotubo; 3. Retirar 2 alçadas bem cheias do crescimento micobacteriano de cada cultura em meio sólido a serem congeladas; 4. Transferir para o criotubo contendo o meio de congelamento; 5. Girar a alça dentro do meio para se certificar que todas as colônias foram transferidas para o meio; 6. Fechar bem a tampa do criotubo; 7. Acondicionar os criotubos nos poços da caixa (criobox); 8. Registrar no Formulário de Localização das Cepas Congeladas o número de identificação do criotubo a ser congelado, no quadrado correspondente ao poço em que o mesmo será colocado. 9. Levar imediatamente as caixas contendo os criotubos com as cepas, devidamente registradas, para o congelador -70ºC.

82 81 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARACONGELAMENTO E RECUPERAÇÃO DE CULTURAS DE POP Nº 002 Data: 26/03/2016 MICOBACTÉRIAS REVISÃO: 00 Pág. 3/3 RECUPERAÇÃO E CONGELAMENTO DE CULTURAS DE MICOBACTÉRIAS EM MEIO LÍQUIDO A 70ºC. ELABORAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima APLICAÇÃO: Laboratório da Gerência de Tuberculose REVISÃO: Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti APROVAÇÃO: Drº Marcelo Cordeiro dos Santos DESCRIÇÃO DA TÉCNICA (CONT.): RECUPERAÇÃO DAS CEPAS CONGELADAS: 1. Localizar a cepa que se deseja descongelar no Formulário de Registro de Amostras Congeladas; 2. Retirar o criotubo desejado do congelador e colocar a 36 ± 1ºC para que descongele rapidamente; 3. Guardar a caixa novamente no congelador o mais rápido possível; 4. Com o auxílio de uma pipeta Pasteur, retirar um pouco da suspensão bacteriana e inocular em um frasco contendo meio sólido de Löwenstein-Jensen (LJ) ou Ogawa-Kudoh (OK); 5. Incubar a 36ºC ± 1 e acompanhar semanalmente o crescimento do subcultivo. ATENÇÃO: 1. Verificar se as características das colônias são coincidentes com as esperadas para a espécie; 2. Verificar a ausência de contaminantes realizando um esfregaço da colônia corando pelo método de Ziehl-Neelsen; 3. Realizar a Identificação fenotípica ou molecular. INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS DE CRESCIMENTO: 1. Cepa viável: crescimento de colônias de micobactérias nos meios semeados. 2. Cepa inviável: quando não há crescimento nos meios semeados. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA: 1. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactérias - Ministério da Saúde, 2008.

83 82 Apêndice F - Procedimento operacional padrão para a identificação fenotípica das Micobactérias não tuberculosas por tempo de crescimento e pigmentação PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS NÃO CAUDADORAS DE TUBERCULOSE (MNT) POP Nº 003 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. ¼ IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA DAS MICOBACTÉRIAS NÃO CAUDADORAS DE TUBERCULOSE (MNT) POR TEMPO DE CRESCIMENTO E PIGMENTAÇÃO ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti APROVAÇÃO: CONCEITO: OBJETIVO: PRECAUÇÕES: INSUMOS E EQUIPAMENTOS: Drº Marcelo Cordeiro dos Santos O método fenotípico de identificação inclui um conjunto de testes baseados em características culturais e bioquímicas, tais como: tempo e temperatura de crescimento, que varia de acordo com a espécie de 25 a 45ºC, pigmentação, capacidade de crescimento em meios seletivos e testes enzimáticos. Em 1958, Runyon propôs uma classificação das MNT em quatro grupos baseada na pigmentação e tempo de crescimento das colônias. As espécies que apresentam crescimento em meio sólido após sete dias são classificadas como de crescimento lento e aquelas que apresentam crescimento em menos de sete dias, de crescimento rápido. Essa classificação é, ainda, utilizada para identificação das MNT. Para avaliação das temperaturas de crescimento, é imprescindível que as estufas sejam calibradas e monitoradas com termômetros de máxima e mínima. a. Meio de cultura sólido (OK/JL); b. Estufa bacteriológica regulada; c. Alça descartável; d. Cabine de Segurança Biológica; e. Pipeta Pauster estéril; f. Água ultra-pura; g. Vótex; h. Tubo tampa rosca com pérola de vidro estéril.

84 83 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS NÃO CAUDADORAS DE TUBERCULOSE (MNT) POP Nº 003 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 2/4 IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA DAS MICOBACTÉRIAS NÃO CAUDADORAS DE TUBERCULOSE (MNT) POR TEMPO DE CRESCIMENTO E PIGMENTAÇÃO ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: Com pipeta Pasteur descartável e estéril, inocular cinco tubos com meio de LJ ou OK, uma gota da suspensão bacteriana no início da superfície do meio e incubar os tubos na posição horizontal por 15 dias em estufa bacteriológica. Se necessário diluir a suspensão bacteriana em tubos com pérolas de vidro estéreis e homogeneizar com vórtex. 1) TEMPERATURA DE CRESCIMENTO E PIGMENTAÇÃO DAS COLÔNIAS: Esses testes permitem classificar a micobactéria em um dos quatro grupos de Runyon e identificar a temperatura ótima de crescimento. Em geral, a temperatura ótima de crescimento é 36-37ºC. No entanto, algumas espécies crescem melhor em temperaturas mais baixas (25-30ºC) como o M. marinum, M. ulcerans, M. haemophilum e outras em temperaturas mais elevadas, como M. xenopi (42ºC) e M. thermoresistible (52ºC). 1. Dois tubos de LJ para a prova de produção de pigmento: tubo 1 a 36 ± 1ºC, dentro de uma caixa fechada, sem penetração de luz ou embrulhado em papel alumínio; tubo 2 a 36 ± 1ºC, em uma bandeja exposta à luz da estufa; 2. Três tubos de LJ para a prova das temperaturas de crescimento. Incubar nas temperaturas de Estufa bacteriológica a 24 ± 1ºC, 36 ± 1ºC e 44 ± 1ºC; 3. Os tubos dos testes da temperatura serão utilizados como controle de crescimento; Leitura e interpretação do teste produção de pigmento - Comparar o crescimento do tubo 1 com o crescimento do tubo 2 e classificar: a) Escotocromógena, se as colônias dos tubos 1 e 2 forem pigmentadas; b) Fotocromógena, se as colônias do tubo 1 não apresentarem pigmentação e as colônias do tubo 2 forem pigmentadas; c) Acromógenas, se as colônias dos tubos 1 e 2 não apresentarem pigmento. 4. Controles de referência para interpretação do teste: a) Escotocromógena M. gordonae (ATCC 14470). b) Fotocromógena M. kansasii (ATCC 12478). c) Acromógena M. terrae (ATCC 15755) ou M. tuberculosis H37Ra (ATCC25177). 5. Leitura e interpretação da temperatura de crescimento: Comparar o crescimento do tubo 2 mantido a 36 ± 1ºC com os tubos incubados nas temperaturas de 24 ± 1ºC e 44 ± 1ºC. Anotar o resultado.

85 84 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS NÃO CAUDADORAS DE TUBERCULOSE (MNT) POP Nº 003 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. ¾ IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA DAS MICOBACTÉRIAS NÃO CAUDADORAS DE TUBERCULOSE (MNT) POR TEMPO DE CRESCIMENTO E PIGMENTAÇÃO ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos DESCRIÇÃO DA TÉCNICA (CONT.): 2) CLASSIFICAÇÃO DAS MICOBACTÉRIAS DE ACORDO COM TEMPO DE CRESCIMENTO E PIGMENTAÇÃO DAS COLÔNIASG RUPO CARACTERÍSTICA DA CULTURA Grupo Característica da cultura I Fotocromógenas - Exemplo: M. kansasii, M. marinum. II III IV Crescimento lento das colônias; Culturas desenvolvem pigmento amarelo somente quando expostas à luz. Escotocromógenas - Exemplo: M. gordonae, M. szulgai. Caracteriza-se pelo crescimento lento das colônias; Culturas desenvolvem pigmento tanto na luz como no escuro. Acromógenas - Exemplo: M. avium, M. terrae. Caracteriza-se pelo crescimento lento das colônias; Culturas não produzem pigmento. Crescimento rápido - Exemplo: M. fortuitum, M. chelonae. Caracteriza-se pelo crescimento rápido das colônias; Colônias podem ser pigmentadas ou não. 3) DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE CRESCIMENTO: Esse teste permite a classificação das MNT em micobactérias de crescimento lento ou rápido. No entanto, algumas espécies apresentam crescimento intermediário, por isso a definição de crescimento lento ou rápido é feita com base em três testes. a) Determinação do tempo de crescimento das colônias em meio LJ. b) Crescimento em meio de agar comum. c) Crescimento em meio de Sauton com ácido pícrico 0,2%.

86 85 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS NÃO CAUDADORAS DE TUBERCULOSE (MNT) POP Nº 003 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 4/4 IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA DAS MICOBACTÉRIAS NÃO CAUDADORAS DE TUBERCULOSE (MNT) POR TEMPO DE CRESCIMENTO E PIGMENTAÇÃO ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos DESCRIÇÃO DA TÉCNICA (CONT.): 4) PROCEDIMENTO PARA DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE CRESCIMENTO DAS COLÔNIAS EM MEIO LJ: Inocular um tubo de LJ, com uma gota da suspensão bacteriana. Incubar por 15 dias a 36 ± 1ºC. Leitura e interpretação - Observar o crescimento após sete dias de incubação e classificar em: a. Crescimento rápido: se houver crescimento abundante; b. Crescimento lento: se não houver crescimento. Controles de referência para interpretação do teste: a. Crescimento rápido: M. fortuitum (ATCC 6841). b. Crescimento lento: M. avium (ATCC 25291) ou M. tuberculosis H37Ra (ATCC25177). 5) PROCEDIMENTO PARA DETERMINAÇÃO DO CRESCIMENTO EM AGAR COMUM E MEIO CONTENDO ÁCIDO PÍCRICO: 1. Inocular, com pipeta Pasteur estéril, uma gota da suspensão bacteriana nos tubos agar comum e Sauton com ácido pícrico; 2. Incubar por 15 dias a 36 ± 1ºC. Leitura e interpretação: a. Crescimento rápido: crescimento nos dois meios. b. Crescimento lento: ausência de crescimento nos dois meios. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactérias Ministério da Saúde, 2008; 2. Lima, AS. Fatores e espécies de micobactérias não tuberculosas associadas aos casos de micobacterioses pulmonar e extrapulmonar no estado de Pernambuco / Andrea Santos Lima. - Recife: [s.n.], 2014.

87 86 Apêndice G - Procedimento operacional padrão para inativação e extração de DNA por termobloco de Micobactéria não tuberculosa PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA INATIVAÇÃO E EXTRAÇÃO DE DNA DE MICOBACTÉRIAS POP Nº 004 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. ½ INATIVAÇÃO E EXTRAÇÃO DE DNA DE MICOBACTÉRIASPOR TERMOBLOCO. ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: CONCEITO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos Submeter a cepa de micobactéria a altas temperaturas a fim de inativar sua potencialidade patogênica e consequentemente promover lise de membrana celular e liberação de material genético para análise molecular OBJETIVO:. Extração de DNA Micobacteriano para análise por método de Biologia Molecular. EQUIPAMENTOS: a. Cabine de Segurança Biológica (CBS); b. Termobloco; c. Microcentrífuga. INSUMOS: a. Microtubo 1,5 ml; b. Água Milli-Q; c. Ponteiras com barreira estéreis.

88 87 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA INATIVAÇÃO E EXTRAÇÃO DE DNA DE MICOBACTÉRIAS POP Nº 004 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 2/2 INATIVAÇÃO E EXTRAÇÃO DE DNA DE MICOBACTÉRIASPOR TERMOBLOCO. ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: 1- Retirar uma alça cheia do crescimento bacteriano em meio sólido e colocar em um microtubo contendo 500 l de água ultrapura esterilizada; 2- Se for utilizar cultura em meio líquido, transferir 1,5 ml da cultura em um microtubo esterilizado; 3- Centrifugar a x g por 5 minutos e ressuspender o sedimento em 100 l de água purificada do tipo Milli-Q esterilizada; 4- Aquecer por 20 minutos a 99ºC em termobloco localizado dentro da CSB; 5- Congelar a -20ºC. No momento de uso, descongelar, centrifugar brevemente e usar 5 l do sobrenandante. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactérias Ministério da Saúde, 2008; 2. Lima, AS. Fatores e espécies de micobactérias não tuberculosas associadas aos casos de micobacterioses pulmonar e extrapulmonar no Estado de Pernambuco - Recife: [s.n.], 2014; 3. Cardoso CM. Avaliação de técnicas moleculares para identificação de Micobactérias não causadoras de tuberculose. Porto Alegre BR-RS, [s.n.], 2012.

89 88 Apêndice H - Procedimento operacional padrão para identificação molecular pelo método PRA-hsp65(Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65) PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65 POP Nº 005 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 1/7 IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65(Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65). ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos CONCEITO: O método de PRA-hsp65 (do inglês Polimerase Chain Reaction Restriction Analysis of the gene hsp65) foi descrito por Telenti e col. em Esse método diferencia amaioria das espécies de Micobactérias não tuberculosas (MNT), mas não as do Complexo M. tuberculosis (CMTB). Resumidamente, um fragmentode 441 pb do gene hsp65 é amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e digerido com duas enzimas de restrição, BstE II e Hae III. A determinação da espécieé possível comparando os padrões de restrição com um algoritmo. O algoritmoestá disponível na página eletrônicahttp://app.chuv.ch/prasite/index.html. PRECAUÇÕES: Para realização da reação de PCR são necessárias salas separadas para extração de DNA, preparação da mistura para PCR e adição de DNA na reação e eletroforese dos produtos amplificados. EQUIPAMENTOS: a) Banho-maria a 36 ± 1ºC e 59 ± 1ºC; b) CSB; c) Microcentrífuga; d) Micropipetas automáticas; e) Sistema de gel eletroforese; f) Sistema para documentação de gel de agarose; g) Termociclador.

90 89 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65 POP Nº 005 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 2/7 IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65(Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65). ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos REAGENTES: a) Agarose ultrapura; b) Enzimas de restrição Hae III e BstE II; c) Água ultrapura esterilizada do tipo Milli-Q; d) Glicerol para biologia molecular esterilizado; e) Marcador de peso molecular de 50 e 100 pb; f) Oligonucleotídeo iniciador TB11 (5 -ACC AAC GAT GGT GTG TCC AT); g) Oligonucleotídeo iniciador TB12 (5 -CTT GTC GAA CCG CAT ACC CT); h) Deoxinucleotídeos (datp, dctp, dgtp, dttp); i) Solução de arraste de Azul de bromofenol; j) Solução de Brometo de etídio a 0,5% (Anexo ). Manter em frasco escuro; k) Taq DNA polimerase; l) Tampão TBE 0,5x concentrado. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: 1) AMPLIFICAÇÃO DO GENE hsp65 DE MICOBACTÉRIAS: Com o número de amostras a serem analisadas e mais uma amostra que será o branco (Controle Negativo). O mix é preparado com todos os reagentes menos o DNA. O mix pode ser preparado em um microtubo de 1,5 ml de acordo com o esquema abaixo: 1 amostra 2 amostras 3 amostras 4 amostras 5 amostras H2O 36,1 72,5 108,6 145,0 181,1 Tampão 10x 5,0 10, MgCl2 50mM 1,5 3,0 4,5 6,0 7,5 Glicerol 3,0 6,0 9,0 12,0 15,0 TB 11(25 pmol/μl) 0,3 0,5 0,8 1,0 1,3 TB 12 (25 pmol/μl) 0,3 0,5 0,8 1,0 1,3 dntp 10 mm 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Taq 5U/μL 0,3 0,5 0,8 1,0 1,3 Total 47,5 95,0 142,5 190,0 237,5

91 90 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65 POP Nº 005 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 3/7 IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65(Análise de restrição Reacção em Cadeia da Polimerase do gene hsp65). ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos DESCRIÇÃO DA TÉCNICA (CONT.): Após adicionar todos os constituintes, com a micropipeta homogeneizar e colocar 47,5 μl do mix em tubos de 0,2 ml (muitas vezes o volume para o último tubo não é o suficiente, então se deve colocar todo o volume possível no microtubo e deixá-lo como branco. Adicionar 2,5 μl do DNA molde nos tubos testes, em seguida dar um spin nos tubos e colocá-los termociclador. Programa da reação: 1 ciclo 94ºC / 5 min 45 ciclos 94ºC / 1 min 60ºC / 1 min 72 ºC / 1 min 1 ciclo 72ºC / 10 min 4ºC OBS.: os primers utilizados apresentam a seguinte seqüência: Tb11: 5 ACCAACGATGGTGTGTCCAT Tb12: 5 CTTGTCGAACCGCATACCCT Eletroforese do produto da PCR: No gel 1 % serão corridos os produtos de PCR para verificar se ocorreu a amplificação do hsp65 e que tenha uma boa quantidade do amplificado pois ele será digerido. Deve-se colocar em cada poço: 1 μl Loading + 6 μl do marcador /PstI 1 μl Loading + 6 μl do produto de PCR Os fragmentos devem apresentar o seguinte tamanho: hsp65: ~441 pb Se o fragmento for fraco ou não aparecer, é possível repetir a PCR utilizando como DNA molde o produto desta primeira PCR. Outra opção é repetir a extração de DNA utilizando uma maior quantidade de massa bacteriana no início; 2) DIGESTÃO DO PRODUTO DA PCR COM AS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: Toda reação deve ser preparada no gelo; Se forem mais de uma amostra, fazer um mix semelhante ao PCR, colocando todos componentes menos o DNA.ATENÇAO: Utilizar o tampão adequado para a enzima, geralmente sua tampa tem a mesma cor que a enzima; Digestão do gene hsp65 de micobactériascom a enzima de restrição Hae III: Água Tampão 10x Enzima Hae III DNA (hsp65) Volume por amostras 7 μl 2 μl 1 μl 10 μl Colocar esta reação em banho-maria a 37 ºC por 3 horas.

92 91 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65 POP Nº 005 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 4/7 IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65(Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65). ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos DESCRIÇÃO DA TÉCNICA (CONT.): Digestão do gene hsp65 de micobactérias com a enzima de restrição BstEII: Volume por amostras Água 7 μl Tampão 10x 2 μl Enzima BsteII 1 μl DNA (hsp65) 10 μl Colocar esta reação em banho-maria a 60 ºC por 3 horas. 3) ELETROFORESE DOS PRODUTOS DA DIGESTÃO: PREPARO DO GEL DE AGAROSE3,5%: O gel pode ser preparado enquanto está sendo feita a digestão; Este gel é preparado na cubeta maior. O volume que deve ser adicionado nela é de 120 ml. 1. Lavar a cubeta maior, passar água destilada, secar e colocar a fita adesiva nas extremidades; 2. Colocar o banho-maria a 60 ºC; 3. Pesar 4,2 g de agarose, colocar no frasco de vidro com tampa azul, identificado para a realização de gel, adicionar 120 ml de TAE 1x e levar ao microondas. Podes deixar a tampa levemente aberta e ficar observando o aquecimento do líquido, cada vez que ele ferver, parar o microondas, retirar o frasco, dar uma agitada e colocar novamente no microondas, repetir o processo até que não se veja nenhum grumo de ágar; 4. Quando estiver no ponto desejado, colocar o frasco no banho-maria e agitar bem lentamente em movimentos circulares para que as bolhas subam; 5. Transferir com muito cuidado para a cubeta e colocar o pente maior; 6. Deixar polimerizando de 30 a 40 minutos e mergulhar na cuba para sua utilização imediata; 7. Corrida das amostras: Para correr as amostras é interessante não colocar material nos dois poços extremos, pois em gel muito grande, eles correm menos formando uma curva. 8. A seqüência de amostras para a corrida deve ser: o o o o 1º marcador de 50 pb: colocar 1,5 μl do loading + 8,5 μl do T.E. + 0,5 μl do marcador; Amostras digeridas com BsteII: adicionar 4 μl do Loading no tubo de digestão contendo 20 μl da digestão; Marcador de 25 pb: colocar 1,5 μl do loading + 8,5 μl do T.E. + 0,5 μl do marcador; Amostras digeridas com HaeIII: adicionar 4 μl do Loading no tubo de digestão contendo 20 μl da digestão;

93 92 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65 POP Nº 005 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 5/7 IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65(Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65). ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti APROVAÇÃO: DESCRIÇÃO DA TÉCNICA (CONT.): Drº Marcelo Cordeiro dos Santos 9. Correr a 100 V até que o corante amarelo do Loading chegue à extremidade (leva em torno de 2 horas); 10. Colocar o gel em um banho de brometo de etídeo por 40 min. (pote plástico contendo 300 ml de H2O mais 15 μl de brometo (10 mg/ml); 11. Para captar a imagem deve-se primeiro visualizar no transluminador para ver onde estão as bandas e cortar o gel no tamanho que se enquadre entre a borracha que está sobre o transluminador; 12. Imprimir a imagem e analisar as alturas das bandas; *Exemplo de imagem: M 1B 2B 3B 4B M 1H 2H 3H 4H Imagem: Gel de eletroforese. Fonte: Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactérias Ministérioda Saúde, 2008.

94 93 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65 POP Nº 005 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 6/7 IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65(Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65). ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti APROVAÇÃO: Drº Marcelo Cordeiro dos Santos DESCRIÇÃO DA TÉCNICA (CONT.) 4) EXEMPLO DE ANÁLISE DAS IMAGENS: Tamanho das bandas (pb) Agentes BsteII HaeIII micobacterianos prováveis 1 245/120/ /140/60 M. intracellulare 2 245/ /140 M. simiae 3 245/120/ /140/60 M. intracellulare 4 325/ /105 M. genavense 5 245/ /105/80 M. kansasii 6 245/ /105/80 M. kansasii 7 Não digeriu Sem identificação 8 245/120/80 150ou155/135 M. fortuitum IouII 9 245/ /115 M. gordonae /120/80 150ou155/135 M. fortuitum IouII /120/80 150/80/60 Sem identificação /120/80 170/105 M. xenopi / /105/80 M. kansasii I mais

95 94 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65 POP Nº 005 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 7/7 IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS POR MÉTODO MOLECULAR PRA-hsp65(Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65). ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti APROVAÇÃO: DESCRIÇÃO DA TÉCNICA (CONT.): Drº Marcelo Cordeiro dos Santos 5) ALGUNS ALGORITMOS DOS PERFIS DE RESTRIÇÃO DE 441 pb DO GENE hsp65 DIGERIDOS COM AS ENZIMAS BstEII E HaeIII DISPONPIVEIS NA PLATAFORMA PRASITE: / REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Lima, AS. Fatores e espécies de micobactérias não tuberculosas associadas aos casos de micobacterioses pulmonar e extrapulmonar no Estado de Pernambuco - Recife: [s.n.], 2014; 2. Cardoso CM. Avaliação de técnicas moleculares para identificação de Micobactérias não causadoras de tuberculose. Porto Alegre BR-RS, [s.n.], Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactérias Ministério da Saúde, Devallois A, et al.rapid Identification of Mycobacteria to Species Level by PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of the hsp65. Gene and Proposition of an Algorithm To Differentiate 34 Mycobacterial Species. Journal of Clinical Microbiology. v.35, p

96 95 Apêndice I - Procedimento operacional para técnica de purificação de DNA para sequenciamento utilizando PED 8000/ 2,5 M NaCl PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA PURIFICAÇÃO DE DNA PARA TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO POP Nº 006 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. ½ PURIFICAÇÃO DE DNA UTILIZANDO PEG 8000/2.5 M NaCl ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos CONCEITO: Submeter o DNA extraído à precipitação em solução de PEG 8000/2.5 M NaCl antes do procedimento de sequencimento genético a fim de remover impurezas que dificultam a análise das sequências genéticas. OBJETIVO: Tornar o material genético livre de impurezas para a análise das sequencias genômicas EQUIPAMENTOS: a) Cabine de Segurança Biológica (CBS); b) Termobloco; c) Microcentrífuga; d) Vortéx INSUMOS: a) Microtubo 1,5 ml; b) Ponteiras com barreira estéreis; c) Etanol 70% (GELADO); d) Água Mili-Q.

97 96 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA PURIFICAÇÃO DE DNA PARA TÉCNICA DE SEQUENCIAMENTO POP Nº 006 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 2/2 PURIFICAÇÃO DE DNA UTILIZANDO PEG 8000/2.5 M NaCl ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: 1. Em um microtubo de 1,5 ml adicionar 600 μl de PEG 8000/ 2,5 M NaCl; 2. Transferir os conteúdos dos tubos de PCR para os tubos preparados com o PEG e misturar com a pipeta; 3. Incubar no termobloco por 15 minutos à 37ºC; 4. Centrifugar em rpm por 10 minutos; 5. Descartar com a pipeta o sobrenadante e lavar o pellet com 500 μl de etanol à 70% GELADO por inversão; 6. Centrifugar em rpm por 5 minutos; 7. Descartar o sobrenadante por inversão, secar a borda com papel toalha e secar em termobloco a 90º-92ºC por 2-4 minutos com a tampa aberta (ou a 37ºC por minutos); 8. Deixar em repouso fora do termobloco por pelo menos 30 minutos, ou de um dia para o outro; 9. Adicionar 20 μl de água Mili-Q em cada tubo; 10. Colocar no termobloco a 37ºC por 30 minutos; 11. Vortexar 30 segundos; 12. Armazenar à -20ºC. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactérias Ministério da Saúde, 2008; 2. Lima, AS. Fatores e espécies de micobactérias não tuberculosas associadas aos casos de micobacterioses pulmonar e extrapulmonar no Estado de Pernambuco - Recife: [s.n.], 2014; 3. Cardoso CM. Avaliação de técnicas moleculares para identificação de Micobactérias não causadoras de tuberculose. Porto Alegre BR-RS, [s.n.], 2012.

98 97 Apêndice J Procedimento operacional padrão para teste de genética molecular para identificação a partir de material de cultura de espécies de Micobactérias (GenoType Mycobacterium CM/AS) PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 1/7 GenoType Mycobacterium CM/AS ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos CONCEITO: O teste é baseado na tecnologia comercial DNA STRIP e permite a identificação das espécies de micobactérias. No kit de fitas AS é possível identificar as espécies: M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M. celatum, M. smegmatis, M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai/ M. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum e M. schimoidei; e o kit CM as espécies clinicamente mais relevantes: M. avium ssp, M. chelonae, M. abscessos, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/ M. ulcerans, o complexo M. tuberculosis e M. xenopi. A técnica é dividida em 3 passos: extração de DNA, amplificação multiplex com primers biotinilados e hibridização reversa. OBJETIVO: Identificação das espécies de micobactérias. EQUIPAMENTOS: a) Cabine de Segurança Biológica (CBS); b) Termobloco; c) Microcentrífuga; d) Vortéx; e) Banho de água; f) Pinças; g) Pipetas ajustáveis para 10, 20, 200 e 1000 ul; h) Termociclador (taxa de aquecimento 3ºC/sec, taxa de arrefecimento 2ºC/sec, precisão +/- 0,2ºC); i) TwinCubator; j) Banho ultrasónico; k) Centrífuga de bancada.

99 98 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 2/7 GenoType Mycobacterium CM/AS ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos INSUMOS: a) Microtubo livre de DNases e RNases (0,2 ul ou 0,5 ul e 1,5 ml ou 2,0 ml); b) Ponteiras com barreira estéreis (vol. 0,5-10 ul, ul, ul, ul); c) Água Mili-Q; d) DNA polimerase termoestável com tampão (10x); e) Solução MgCl2 (pode variar entre 1,5 a 2,5 mm) *Alguns tampões de incubação já possuem MgCl2; f) Kit comercial reagentes GenoType Mycobacterium AS/CM; g) Tubo falcon de 15 ml e 50 ml; h) Tubo de polipropileno cônico com tampa de rosca tipo eppendorf (resistente ao calor); DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: 1. Extração de DNA por banho ultrasónico; *Poderá ser utilizado qualquer procedimento de extração de DNA desde que produza DNA amplificável de bactérias. a) Ao usar bactérias cultivadas em meio sólido, colher as bactérias com umas alça de inoculação e suspender em aproximadamente 300 ul de água (para uso de biologia molecular); b) Ao usar bactérias cultivadas em meio líquido, aplicar diretamente 1 ml. Precipitar as bactérias centrifugando, a aproximadamente x g durante 15 min, numa centrifuga de bancada normal com um rotor estanque a aerossóis, numa câmara de segurança da classe II. Descartar o sobrenadante e ressuspender as bactérias em ul de água com auxílio do vortéx; c) Incubar as bactérias em ul de água durante 20 min a 95ºC banho de água (banho maria) ou banho seco (termobloco); d) Incubar durante 15 min em banho ultrasónico; e) Centrifugar durante 5 min à velocidade máxima e usar 5 ul do sobrenadante para PCR. No caso de a solução de DNA ser para armazenar durante um período longo, transferir o sobrenadante para um novo tubo.

100 99 ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP GenoType Mycobacterium CM/AS Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 3/7 CONT. DA DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: 2. Amplificação: *Preparar a mistura de amplificação (45uL) numa sala livre de DNA. A amostra deve ser adicionada numa área separada. Mistura por tubo: 35 ul de PNM (mistura primer) kit comercial; 5 ul de tampão de PCR 10x; x ul de solução de MgCl2; 1-2 unidades de DNA polimerase termoestável (recomendada: HotStarTaq DNA Polymerase da Quiagen); x ul de água para obter um volume de 45 ul (não considerar o vol. da enzima); 5uL do DNA extraído ( ng de DNA), levando a um volume final de 50 ul (não considerando a enzima); Programa da amplificação: 15 min 95ºC 1 ciclo 30 sec 95ºC 2 min 58ºC 10 ciclos 25 sec 95ºC 40 sec 53ºC 20 ciclos 40 sec 70ºC Os produtos amplificados podem ser armazenados de +8 a -20ºC. Para verificação da reação de amplificação, 5 ul de cada amostra poderão ser diretamente aplicadas ao um gel de agarose a 2% sem adição de loading buffer. Os amplicons têm um tamanho de aproximadamente 230 pb (controle universal) e de 200 pb (controle universal/fragmentos específicos das espécies). 8 min 70ºC 1 ciclo

101 100 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 4/5 ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: GenoType Mycobacterium CM/AS Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos CONT. DA DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: 3. Hibridização: Preparação: Pré aqueça o banho maria a 45ºC; o desvio máximo tolerado em relação a temperatura alvo é de +/- 1ºC. pré-aqueça as soluções HYB (Tampão de hibridização-kit) e STR (Solução de lavagem adstringente-kit) a 37-45ºC antes de as usar. Os reagentes têm que estar livres de precipitados. Aqueça os restantes reagentes, com exceção do CON-C (conjugado concentrado) e do SUB-C (substrato concentrado), à temperatura ambiente. Usando um tubo adequado, dilua 1:100 o CON-C, laranja e o SUB-C, amarelo com as quantidades necessárias dos respectivos tampões (CON-C com CON-D, SUB-C com SUB-D). Agite bem e deixe estabilizar à temperatura ambiente. Para cada tira, adicione 10 μl de concentrado a 1 ml do tampão respectivo. Dilua o CON-C antes de cada utilização. O SUB-C diluído é estável durante 4 semanas se armazenado à temperatura ambiente e protegido da luz. a) Dispense 20 μl da Solução de Desnaturação (DEN, azul) num canto de cada um dos poços usados; b) Adicione à solução 20 μl da amostra amplificada, com a pipeta aspire e dispense para misturar bem e incube à temperatura ambiente durante 5min. Retire as tiras do tubo, usando uma pinça, e marqueas com um lápis abaixo do marcador colorido. Use sempre luvas quando manusear as tiras; c) Cuidadosamente, adicione a cada poço 1ml de HYB (verde) pré-aquecido. Agite suavemente a tina até que a solução adquira uma cor homogênea. d) Tenha cuidado para não salpicar solução para os poços vizinhos. Coloque uma tira em cada poço; e) As tiras têm que ficar completamente imersas na solução e com o lado revestido pelas sondas (identificável pela marcador colorido perto da extremidade inferior) virado para cima; f) Coloque a tina no TwinCubator e incube durante 30 min a 45 C; Aspire completamente o Tampão de Hibridização;

102 101 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 5/7 GenoType Mycobacterium CM/AS ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos CONT. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: 3. Hibridização: g) Adicione 1 ml de STR (vermelho) a cada tira e incube durante 15 minutos a 45 C (TwinCubator); h) Em temperatura ambiente remova completamente a STR; i) Lave cada tira uma vez com 1 ml de Solução Rinse (RIN) durante 1 minuto no TwinCubator (plataforma de agitação) (rejeite o RIN depois da incubação); j) Adicione 1 ml do conjugado diluído a cada tira e incube durante 30 minutos no TwinCubator (plataforma de agitação); k) Remova a solução e lave cada tira duas vezes, durante 1 minuto, com 1 ml de RIN e uma vez, durante 1 minuto, com aproximadamente 1 ml de água destilada TwinCubator (plataforma de agitação) (rejeite a solução em cada lavagem); l) Adicione 1 ml de substrato diluído a cada tira e incube no escuro sem agitação; m) Dependendo das condições do teste (por ex., temperatura ambiente), o tempo de incubação do substrato pode variar entre 3 e 20 minutos. Um alongamento dos tempos de incubação do substrato pode levar a um aumento do ruído da coloração de fundo, o que pode impossibilitar a interpretação dos resultados; n) Pare a reação enxaguando brevemente por duas vezes com água destilada; o) Usando pinças, remova as tiras da tina e seque-as entre duas camadas de papel absorvente; 4. Interpretação dos Resultados: Cole as tiras e armazene-as protegidas da luz. Cole as tiras desenvolvidas nos campos designados alinhando as bandas CC e UC com as linhas respectivas na ficha. Anote as bandas positivas na penúltima coluna, determine as espécies com a ajuda da tabela de interpretação e introduza o nome das espécies identificadas na última coluna. Cada tira possui um total de 17 zonas de reação (ver a figura).

103 102 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 6/8 GenoType Mycobacterium CM/AS ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos CONT. DESCRIÇÃ DA TÉCNICA: 4. Interpretação dos Resultados: CC: O desenvolvimento de uma linha nesta zona documenta a eficiência da ligação do conjugado e da reação do substrato. UC: Esta zona detecta todas as micobactérias conhecidas e membros do grupo das bactérias gram-positivas com um conteúdo alto de G+C. GC: A aparência desta banda documenta a presença de um membro do gênero Mycobacterium. A intensidade desta banda varia dependendo da espécie. A banda de Controlo do Género pode não aparecer apesar da presença do DNA micobacteriano; desde que um padrão de bandas específicas das espécies esteja presente, no entanto, a reação de amplificação foi efetuada corretamente e o teste é valido. Se nenhuma padrão de bandas específicas das espécies é visível, um padrão de bandas que indica a presença de uma bactéria gram-positiva com um conteúdo alto de G+C pôde, em casos raros, para originar também de uma bactéria que não pudesse ser detectada por este kit. Espécies bacterianas adicionais podem ser identificadas com o kit GenoType Mycobacterium AS. Outras bandas: Sondas específicas, para avaliação ver tabela de interpretação. As bandas de uma tira não têm que mostrar todas a mesma intensidade de sinal. Se for usada uma grande quantidade de amplicon, poderão aparecer bandas adicionais.

104 103 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE MICOBACTÉRIAS ATRAVES DE TECNOLOGIA COMERCIAL *DNA STRIP POP Nº 007 Data: 26/03/2016 REVISÃO: 00 Pág. 7/8 GenoType Mycobacterium CM/AS ELABORAÇÃO: APLICAÇÃO: REVISÃO: APROVAÇÃO: Ana Carolina de Oliveira de Lima Laboratório da Gerência de Tuberculose Drª Maria Lúcia Rosa Rossetti Drº Marcelo Cordeiro dos Santos CONT. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: 4. Interpretação dos Resultados: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: 1. Lifescience, hain. Genotype Mycobacterium CM. Teste de Genética para identificação, a partir de cultura, das espécies de micobactérias mais relevantes. VER 1.0. IFU Jan. 2011; 6.6. Apêndice L 2. Lifescience, hain. Genotype Mycobacterium AS. Teste de Genética para identificação, a partir de cultura, de espécies de micobacterias. VER 1.0. IFU Fev

105 ANEXO 104

106 Anexo A - Parecer consubstanciado do CEP 105

107 Anexo B Modelo da ficha de notificação da Tuberculose 106

108 Anexo C Termo de Dispensa do Consentimento Livre e Esclarecido (TDCLE) 107

109 Anexo D Termo de Compromisso de Utilização de Dados (TCUD) 108

110 Anexo E Carta de Anuência 109

111 110