UFRRJ INSTITUTO DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-FRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA DISSERTAÇÃO

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1 UFRRJ INSTITUTO DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-FRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA DISSERTAÇÃO Diagnóstico Morfológico, Sorológico e Molecular de Agentes Anaplasmataceae em Felinos Domésticos da Região Metropolitana do Rio de Janeiro Andresa Guimarães 2013

2 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA DIAGNÓSTICO MORFOLÓGICO, SOROLÓGICO E MOLECULAR DE AGENTES ANAPLASMATACEAE EM FELINOS DOMÉSTICOS DA REGIÃO METROPOLITANA DO RIO DE JANEIRO ANDRESA GUIMARÃES Sob orientação da Professora Cristiane Divan Baldani e Co-orientação do Professor Huarrisson Azevedo dos Santos Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências, no Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária (Patologia e Ciências Clínicas) Seropédica, RJ Agosto de 2013

3 UFRRJ / Biblioteca Central / Divisão de Processamentos Técnicos G963d T Guimarães, Andresa, Diagnóstico morfológico, sorológico e molecular de agentes anaplasmataceae em felinos domésticos da região metropolitana do Rio de Janeiro / Andresa Guimarães f.: il. Orientador: Cristiane Divan Baldani. Dissertação (mestrado) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária Patologia e Ciências Clínicas. Bibliografia: f Gato Doenças Rio de Janeiro (RJ) Teses. 2. Gato Doenças Diagnóstico Teses. 3. Ehrlichia Teses. 4. Anaplasmose Teses. I. Baldani, Cristiane Divan, II. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Curso de Pós- Graduação em Medicina Veterinária Patologia e Ciências Clínicas. III. Título.

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5 DEDICATÓRIA Primeiramente, à Deus, por tudo que me proporcionou até hoje, pelas grandes oportunidades que surgiram no meu caminho e por me guiar em todos os momentos; Aos meus pais Deise Luci de Araújo Guimarães e Ronaldo Guimarães, minha vozinha Zenith Barbosa de Araújo e meus irmãos Andréa Guimarães e Anderson Guimarães pelo apoio incondicional, por acreditarem e me incentivarem sempre e pelo carinho nos momentos difíceis, essa conquista também é de vocês; À minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Cristiane Divan Baldani, pela dedicação e orientação desde a graduação, por ser justa e compreensiva. Aos meus familiares, amigos e colegas de profissão, que estiveram comigo, me apoiando e colaborando em diversas situações. i

6 Posso, tudo posso naquele que me fortalece Nada e ninguém no mundo vai me fazer desistir Quero, tudo quero, sem medo entregar meus projetos Deixar-me guiar nos caminhos que Deus desejou para mim e ali estar Vou perseguir tudo aquilo que Deus já escolheu pra mim Vou persistir, e mesmo nas marcas daquela dor do que ficou, vou me lembrar E realizar o sonho mais lindo que Deus sonhou Em meu lugar estar na espera de um novo que vai chegar Vou persistir, continuar a esperar e crer E mesmo quando a visão se turva e o coração só chora Mas na alma, há certeza da vitória Eu vou sofrendo, mas seguindo enquanto tantos não entendem Vou cantando minha história, profetizando Que eu posso, tudo posso... Em Jesus Tudo posso Pe. Fábio de Melo Para realizar grandes conquistas, devemos não apenas agir, mas também sonhar; não apenas planejar, mas também acreditar. Anatole France ii

7 AGRADECIMENTOS À Deus, por me guiar em todos os momentos. Aos meus pais Ronaldo Guimarães e Deise Luci de Araújo Guimarães, pelo apoio, amor e incentivo sempre. À minha irmã Andréa Guimarães, minha melhor amiga, companheira de UFRRJ, por toda ajuda neste trabalho e na minha vida, amo você. À minha vozinha Zenith Barbosa de Araujo, que além de todo apoio, sempre tinha uma palavra de conforto e um colo a oferecer. Ao meu irmão Anderson Guimarães por acreditar e torcer por mim. Ao meu namorado Agnaldo Machado de Andrade, pela ajuda no presente trabalho e pelo carinho e paciência dedicados a mim por todos esses anos. Aos meus padrinhos e familiares pela torcida e carinho. À Pandora e a todos os animais, razão da minha profissão. À minha orientadora Prof.ª Dr.ª Cristiane Divan Baldani, pelo exemplo de profissional e pessoa, sempre disposta a ajudar e pelo aprendizado nestes anos de convivência. Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Huarrisson Azevedo dos Santos, pelos ensinamentos e dedicação. Ao amigo Marcus Sandes Pires, pela inenarrável ajuda em cada etapa deste trabalho, sendo essencial para esta conquista, vou ser eternamente grata pela sua ajuda. À Maristela Peckle Peixoto, pela imensa contribuição, sem a qual esse trabalho não seria realizado. À Juliana Macedo Raimundo pela ajuda nas análises laboratoriais. À Raisa Braul Rodrigues, minha IC favorita, pela ajuda em diversas etapas e pela companhia agradável. Ao Prof. Dr. Carlos Luiz Massard e aos amigos que frequentam o Laboratório de Hemoparasitos e Vetores (W.O. Neitz) do Departamento de Parasitologia Animal, Maristela Peckle Peixoto, Marcus Sandes Pires, Claudia Bezerra Silva, Joice Aparecida Rezende Vilela, Renata Lins, Gabriela Vivas Vitari, Aline Falqueto, Nelson Meireles da Silva, Larissa Correia de Amorim, Vanessa Raia, pela compreensão e auxílio na execução do presente estudo. Aos amigos de profissão Camila Flávia Magalhães, Caio Balduino Rodrigues, Maria Lopes Correa, Juliana M. Raimundo e Raisa B. Rodrigues pela imensa ajuda nas coletas do teste piloto, cheias de emoção. À Prof.ª Dr.ª Rosângela Zacarias Machado e Prof. Dr. Marcos Rogério André, pela acolhida em Jaboticabal, pelos ensinamentos, principalmente em biologia molecular, e por toda a contribuição essencial para realização deste estudo. Ao Prof. Dr. Carlos Henrique Machado, pelos ensinamentos, colaboração e disposição em ajudar. À Aline Tonussi e Cíntia Morgado, pela contribuição na leitura e correção desta dissertação. Ao amigo Francisco Bernardes Melo, pela valiosa contribuição na correção deste trabalho. Ao amigo de profissão Carlos Roberto Mendes Kling, pela oportunidade, confiança e pelo aprendizado fornecidos. Às amigas Bruna Freire, Jenifer Souza, Tatiane Meira e Alessandra Araujo pelos bons momentos, conselhos e amizade sincera que me deram forças para essa conquista. As amigas Ana Claudia Tavares Miranda e Gabrielli Stefaninni Santiago pelo apoio, torcida e grande auxílio desde a graduação. iii

8 À Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, pela qualidade de ensino e por proporcionar aprendizados e amigos que levarei por toda minha vida. Aos membros da banca, prof. Dr. Carlos Luiz Massard, prof.ª Dr.ª Nádia Regina P. Almosny e Prof. Dr. Adivaldo Henrique da Fonseca, pelas considerações e sugestões de grande relevância, que levaram ao aperfeiçoamento deste trabalho. Ao Programa de pós-graduação em Medicina Veterinária e aos seus professores, pela oportunidade e pelos ensinamentos oferecidos. À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro deste projeto. E a todos que de alguma maneira contribuíram para realização deste trabalho. iv

9 BIOGRAFIA ANDRESA GUIMARÃES, filha de Ronaldo Guimarães e Deise Luci de Araujo Guimarães, nasceu em 21 de dezembro de 1989, no município de Petrópolis, Rio de Janeiro. Cursou o ensino fundamental no Colégio Petrópolis e ensino médio no Centro Educacional Maurício Barroso. Trabalhou como estagiária no ensino de Português e Matemática no Método de Ensino Kumon de 2003 a Ingressou na Universidade Federal rural do Rio de Janeiro (UFRRJ) em 2007, no curso de Medicina Veterinária. Durante a graduação fez estágio nas áreas de Reprodução de equinos, com o prof. Julio Ferraz Jacob, Estágio na área de Clínica e Cirurgia de grandes animais, realizado no Hospital Veterinário de Grandes Animais, além de estágio com pequenos animais na Clínica Veterinária Kling. Foi bolsista de Iniciação Científica de 2008 a 2012, sendo de 2008 a 2010, bolsista balcão do CNPq, sob orientação do prof. Dr. Fernando Queiroz de Almeida, desenvolvendo pesquisas na área de Experimentação em Nutrição de Equinos Atletas, com o tema: Avaliação de diferentes metodologias para estimativa da digestibilidade dos nutrientes de alimentos volumosos em equinos; de 2010 a 2011, bolsista PIBIC, sob orientação do prof. Dr. Carlos Luiz Massard, desenvolvendo a pesquisa: Aspectos hematológicos e soroepidemiológicos da anaplasmose caprina e ovina na microrregião de Itaguaí, Rio de Janeiro; e de 2011 a 2012, bolsista PROIC, sob orientação da prof.ª Dr.ª Cristiane Divan Baldani, desenvolvendo a pesquisa: Investigação sorológica de Ehrlichia canis em felinos domésticos do Rio de Janeiro. Concluiu a graduação em Medicina Veterinária em março de 2012, período em que ingressou no Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária (PPGMV), nível Mestrado, Patologia e Ciências Clínicas, também na UFRRJ, sob orientação da prof.ª Dr.ª Cristiane Divan Baldani, sendo aprovada em primeiro lugar na classificação geral, desenvolvendo o tema: Diagnóstico sorológico e molecular dos agentes Anaplasmataceae em felinos domésticos do Rio de Janeiro, com bolsa da CAPES. Em 2013, foi aprovada no processo seletivo para mudança de nível de mestrado para doutorado pela CAPES. Tem como produção dois artigos completos publicados em periódicos e 45 resumos publicados em anais de congressos, participa de projetos de dissertação e tese do Laboratório de Hemoparasitos e Vetores e do PPGMV da UFRRJ. v

10 RESUMO GUIMARÃES, Andresa. Diagnóstico Sorológico e Molecular dos Agentes Anaplasmataceae em Felinos Domésticos do Rio de Janeiro p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária). Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, Estudos com felinos domésticos são pouco abordados no Brasil, principalmente em relação à pesquisa de hemoparasitoses, em que os gatos podem ser portadores do agente e contribuir para infecção do homem. Os agentes Anaplasmataceae são bactérias gram-negativas que são encontradas em leucócitos, plaquetas ou eritrócitos, formando mórulas, características de sua infecção. A transmissão desses agentes para o homem e animais ocorre principalmente por vetores artrópodes. Como método diagnóstico ressalta-se a sorologia, porém estudos recentes utilizando diagnóstico molecular demonstram maior sensibilidade e especificidade, com melhor caracterização do agente. O presente estudo tem como objetivo diagnosticar felinos domésticos do Rio de Janeiro infectados naturalmente por agentes Anaplasmataceae (Ehrlichia sp. e Anaplasma sp.) por meio de métodos sorológico e molecular, bem como avaliar as alterações hematológicas associadas a estas infecções. Foram utilizadas amostras de 216 animais, provenientes de clínicas localizadas em cidades da Região Metropolitana do Rio de Janeiro. A pesquisa de anticorpos IgG anti-e. canis foi realizada pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e a detecção molecular de Ehrlichia sp., pela nested Reação em Cadeia da Polimerase (nested-pcr) baseada no gene 16s rrna. Os resultados demonstraram que 18 (8,3%) animais foram positivos na detecção direta pelo esfregaço sanguíneo, 57 (26,4%) soropositivos e 37 (17,1%) positivos na nested-pcr para Ehrlichia sp., sendo 91 (42,1%) considerados positivos para Ehrlichia sp. em pelo menos uma técnica. O diagnóstico de A. platys foi efetuado pela PCR em tempo real (qpcr) e nested-pcr baseada nos genes glta e 16S rrna, respectivamente. Dezessete animais (7,9%) apresentaram inclusões em plaquetas, oito (3,7%) foram positivos na qpcr, dois (0,9%) na nested-pcr e 23 (10,6%) animais foram considerados positivos para A. platys em pelo menos uma técnica. A pesquisa de A. phagocytophilum foi realizada por meio da qpcr baseada no gene msp2; no entanto, não foram observados animais positivos. Os achados hematológicos mais frequentes nos animais positivos para agentes Anaplasmataceae foram trombocitopenia, leucocitose, neutrofilia, desvio à esquerda regenerativo, anemia e hiperproteinemia. Apenas um animal apresentou co-positividade para ambos os agentes. Em relação aos dados associados, somente a idade interferiu na positividade para Ehrlichia sp., sendo na RIFI os animais mais jovens menos predispostos à infecção, ao contrário do observado na nested-pcr em que os mais jovens apresentaram maior índice de positividade. Apenas duas amostras positivas na nested-pcr para E. canis foram submetidas ao sequenciamento, sendo que uma sequência apresentou 100% de similaridade com isolados de Ehrlichia sp. e E. canis e a outra demonstrou 99% de similaridade com isolados de Ehrlichia sp. ocelot e Ehrlichia sp. littlespotted-cat. As duas amostras positivas na nested-pcr para A. platys apresentaram 100% de similaridade com isolados de A. platys previamente descritos. O presente trabalho demonstra, portanto, a ocorrência de agentes Anaplasmataceae na população de felinos domésticos do Rio de Janeiro. Palavras chave: gatos, Ehrlichia sp., Anaplasma platys vi

11 ABSTRACT GUIMARÃES, Andresa. Serological Diagnosis and Molecular Agents Anaplasmataceae in Domestic Cats of Rio de Janeiro p. Dissertation (Master Science in Veterinary Medicine). Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, Studies of domestic cats are little discussed in Brazil, especially regarding hemoparasita research where cats can be carriers of the agent and contribute to infection of man. Anaplasmataceae agents are gram-negative bacteria found in leukocytes and platelets, in which morulae characteristic of the infection is observed. The transmission of these agents to humans and animals occurs by arthropod vectors. Sorologic diagnostic methods are emphasized, but recent studies using molecular techniques demonstrate greater sensitivity and specificity, with better characterization of the agent. The present study aims to diagnose domestic cats in Rio de Janeiro naturally infected by agents Anaplasmataceae (Ehrlichia sp., and Anaplasma sp.) by serological and molecular methods, as well as evaluate hematological changes associated with these infections to guide veterinarians in the diagnosis of these diseases. Samples of 216 animals from clinics located in cities in the metropolitan region of Rio de Janeiro were used. The research of antibodies IgG anti-e. canis was performed by Immunofluorescence Assay (IFAT) and molecular detection of Ehrlichia sp. by nested Polymerase Chain Reaction (PCR) based on 16S rrna gene. The results demostrate that 18 (8.3%) animals were positive in the direct detection by blood smear, 57 (26.4%) seropositive and 37 (17.1%) positive by nested-pcr for Ehrlichia sp., being 91 (42.1%) positive in at least one technique. The diagnosis of A. platys was performed by real-time PCR (qpcr) and nested-pcr based on 16S rrna and glta genes, respectively. Seventeen animals (7.9%) showed inclusions in platelet, eight (3.7%) were positive in qpcr, two (0,9%) in nested-pcr and 23 (10.6%) cats were considered positive for A. platys in at least one technique. The detection of A. phagocytophilum was performed by qpcr based on gene msp2, however, positive animals were not observed. The most common hematologic findings in animals positive for agents Anaplasmataceae were thrombocytopenia, leukocytosis, neutrophilia, regenerative left shift, anemia and hyperproteinemia. Only one animal showed co-positivity for both agents. Regarding the associated factor, only age interfered with positivity for Ehrlichia sp., in wich younger IFAT positive animals were less prone to infection, unlike that observed in the nested-pcr in which the younger had higher positivity. Only two positive samples in the nested-pcr for E. canis were subjected to sequencing. One sequence demonstrated 100% similarity with isolates of Ehrlichia sp. and E. canis and another showed 99% similarity with isolates of Ehrlichia sp. ocelot and Ehrlichia sp. little-spotted-cat. The two positive samples in the nested-pcr for A. platys demonstrated 100% similarity with isolates of A. platys reported in advanced. The present work demonstrates the circulation of agents Anaplasmataceae in domestic cats in Rio de Janeiro. Key words: cats, Ehrlichia, Anaplasma platys vii

12 LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. Localização geográfica dos municípios do estado do Rio de Janeiro de obtenção das amostras de sangue de gatos domésticos Figura 2. Esfregaço sanguíneo demonstrando uma inclusão em plaqueta sugestiva de agentes Anaplasmataceae (Corante rápido, 1000x) Figura 3. Esfregaço sanguíneo demonstrando uma inclusão em monócito sugestiva de agentes Anaplasmataceae (Corante rápido, 1000x) Figura 4. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para diagnóstico de E. canis, sendo (a) controle positivo; (b) controle negativo e (c) amostra positiva de felino doméstico da Região Metropolitana do Rio de Janeiro Figura 5. Fotografia de eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros visualizados na foto são relativos à nested-pcr para Ehrlichia sp. obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores ECAN/HE3. Canaleta PM: peso molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen ); Canaleta 1: Controle negativo; Canateta 2: Controle positivo; demais Canaletas amostras de felinos domésticos da Região Metropolitana do Rio de Janeiro testadas, sendo as Canaletas 5 e 8 de animais positivos Figura 6. Curva de amplificação do gene glta de Anaplasma platys em gatos domésticos da Região Metropolitana do Rio de Janeiro obtidas pela PCR em tempo real utilizando o sistema TaqMan. As linhas vermelhas representam os controles positivos e as linhas azuis e rosa representam três amostras positivas Figura 7. Fotografia de eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros visualizados na foto são relativos à nested-pcr para Anaplasma platys obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores PLATYS e EHR16sR. Canaleta PM: peso molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen ); Canaleta 1: Controle positivo; Canateta 2: Controle negativo; Canaleta 3: Gato 105 e Canaleta 4 : Gato Figura 8. Curva de amplificação do gene msp2 de Anaplasma phagocytophilum em gatos domésticos da Região Metropolitana do Rio de Janeiro obtidas pela PCR em tempo real utilizando o sistema TaqMan. A linha vermelha representam os controles positivos viii

13 LISTA DE TABELAS Página Tabela 1. Descrição dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados e das condições de termociclagem para as reações de PCR e nested PCR, utilizadas para detecção molecular de Ehrlichia sp. e E. canis baseadas no gene 16S rrna Tabela 2. Descrição dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados e das condições de termociclagem para as reações para as reações de PCR e nested-pcr, utilizadas para detecção molecular de Anaplasma spp. e Anaplasma platys baseadas no gene 16S rrna Tabela 3. Frequência de felinos domésticos com inclusões em plaquetas e/ou leucócitos sugestivas de agentes Anaplasmataceae observadas em esfregaços sanguíneos corados por corante Rápido Panótico domiciliados nos municípios da região metropolitana do Rio de Janeiro e nas regiões Baixada fluminense e Rio de Janeiro Tabela 4. Frequência de felinos domésticos positivos pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Ehrlichia canis domiciliados nos municípios da região metropolitana do Rio de Janeiro e nas regiões Baixada fluminense e Rio de Janeiro Tabela 5. Frequência de felinos domésticos positivos pela nested-pcr para Ehrlichia sp. domiciliados nos municípios da região metropolitana do Rio de Janeiro e nas regiões Baixada fluminense e Rio de Janeiro Tabela 6. Frequência de felinos domésticos positivos pela PCR em tempo real para Anaplasma platys domiciliados nos municípios da região metropolitana do Rio de Janeiro e nas regiões Baixada fluminense e Rio de Janeiro Tabela 7. Resultados obtidos pelo esfregaço sanguíneo (ES), RIFI e nested-pcr para Ehrlichia sp. em amostras de felinos domésticos da região metropolitana do Rio de Janeiro Tabela 8. Valores médios dos parâmetros relacionados ao eritrograma, leucograma, trombograma e proteína plasmática total de felinos domésticos da Região Metropolitana do Rio de Janeiro positivos para Ehrlichia sp em pelo menos um teste de diagnóstico Tabela 9. Associação entre os resultados obtidos pelo esfregaço sanguíneo (ES), Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Nested Reação em Cadeia pela Polimerase (nested- PCR) e achados hematológicos nas amostras positivas para E. canis obtidas de felinos domésticos da região metropolitana do Rio de Janeiro ix

14 Tabela 10. Valores médios dos parâmetros relacionados ao eritrograma, leucograma e trombograma de felinos domésticos do Rio de Janeiro em função do resultado positivo para Anaplasma platys em pelo menos um teste Tabela 11. Associação entre os resultados obtidos pelo esfregaço sanguíneo (ES) e PCR em tempo real (qpcr) e achados hematológicos nas amostras positivas para A. platys obtidas de felinos domésticos da região metropolitana do Rio de Janeiro Tabela 12. Valores médios dos parâmetros relacionados ao eritrograma, leucograma, trombograma e proteína plasmática total de felinos domésticos da Região Metropolitana do Rio de Janeiro positivos para Anaplasma platys pela qpcr Tabela 13. Associação entre os dados de sexo, raça e idade com os resultados na detecção por esfregaço sanguíneo (ES), Reação de Imunofluorescencia Indireta (RIFI) e Nested Reação em Cadeia pela Polimerase (nested-pcr) para Ehrlichia sp Tabela 14. Associação entre os dados de sexo, raça e idade com os resultados na detecção por esfregaço sanguíneo (ES) e Reação em Cadeia pela Polimerase em tempo real (qpcr) para Anaplasma platys x

15 LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS A BAS C CHCM C q DNA dntps EDTA ELISA EOS FIB G HB HCM HEM IBGE LEUC LINF MON Nested-PCR NEUT PCR PLAQ PPT qpcr q.s.p. RIFI rrna T UFRRJ UV VCM VG Base purina Adenina Número de basófilos Base pirimidina Citosina Concentração de hemoglobina corpuscular média Ciclo de quantificação Ácido desoxirribonucleico Trifosfato desoxirribonucleotídeos Ácido etilenodiamino tetra-acético Ensaio imunoenzimático Número de eosinófilos Fibrinogênio Base purina Guanina Concentração de hemoglobina plasmática Hemoglobina corpuscular média Número de hemácias Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística Número de leucócitos Número de linfócitos Número de monócitos Nested Reação em Cadeia pela Polimerase Número de neutrófilos Reação em Cadeia pela Polimerase (Polymerase Chain Reaction) Plaquetas Proteína plasmática total PCR em tempo real Quantitade suficiente para Reação de imunofluorescência indireta Ácido Ribonucléico Ribossômico Base pirimidina Timina Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro Ultravioleta Volume corpuscular médio Volume globular xi

16 SUMÁRIO Página 1 INTRODUÇÃO 1 2 REVISÃO DE LITERATURA Infecções por Agentes Anaplasmataceae Histórico da infecção por agentes Anaplasmatacea em felinos domésticos Importância e distribuição Transmissão, Ciclo Biológico e Mecanismos de defesa Sinais clínicos, determinações laboratoriais e achados patológicos Importância em saúde pública Diagnóstico Detecção direta por esfregaço sanguíneo Isolamento em cultura de células Testes sorológicos Detecção molecular Tratamento e profilaxia 12 3 MATERIAL E MÉTODOS Animais Coleta de Sangue Análise Hematológica Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) Extração de DNA de sangue total Reações de amplificação para Ehrlichia sp. baseadas no gene 16S rrna PCR em Tempo Real para Anaplasma platys Reações de amplificação para Anaplasma platys baseadas no gene 16S rrna PCR em Tempo Real para Anaplasma phagocytophilum Eletroforese de DNA em gel de agarose Sequenciamento de Nucleotídeos e Caracterização Molecular dos Isolados Cuidados para evitar contaminações Análise Estatística 18 xii

17 4 RESULTADOS Esfregaços sanguíneos Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) Reação de amplificação para Ehrlichia sp. pela PCR baseadas no gene 16S 21 rrna 4.4 Reações de amplificação para Anaplasma platys pela PCR em tempo Real 22 baseada no gene glta e pela nested-pcr baseada no gene 16S rrna 4.5 PCR em Tempo Real para Anaplasma phagocytophilum baseado no gene msp Associação entre os resultados obtidos no esfregaço sanguíneo, RIFI e Nested- 24 PCR para Ehrlichia sp. 4.7 Análise hematológica dos animais positivos para Ehrlichia sp Associação entre os achados hematológicos e os resultados obtidos pelo 28 esfregaço sanguíneo e PCR em tempo real para Anaplasma platys 4.9 Avaliação da Co-positividade para E. canis e A. platys Fatores associados à positividade para Ehrlichia sp. e A. platys Sequenciamento de Nucleotídeos e Caracterização Molecular dos Isolados DISCUSSÃO 35 6 CONCLUSÕES 46 7 BIBLIOGRAFIA 47 xiii

18 1 INTRODUÇÃO A população de gatos domésticos no Brasil cresce a cada ano, inclusive mais rapidamente que a de cães. Isto se deve à tendência atual de moradias verticais, habitações menores e novos estilos de vida compatíveis com as características de felinos domésticos que se adaptam bem a apartamentos, não necessitam passear com o dono e são silenciosos. Acrescenta-se a isso o crescimento do mercado brasileiro de produtos e medicamentos desenvolvidos especialmente para estes animais domésticos, que movimenta milhões de reais por ano e gera renda para várias famílias. Dentre as diversas doenças que acometem os gatos, as hemoparasitoses apresentam grande importância médica-veterinária devido aos sintomas causados pela infecção que, em casos agudos, podem levar a morte. Além da importância médica por se tratarem de zoonoses, a intensa convivência entre estes animais e o ser humano agrava ainda mais esta situação. Com exceção dos hemoplasmas, os hemoparasitas dos felinos domésticos são pouco conhecidos no Brasil. Os agentes da Família Anaplasmataceae já foram relatados parasitando felinos domésticos e selvagens, com destaque para Ehrlichia canis, Anaplasma platys e Anaplasma phagocytophilum. Trata-se de bactérias gram-negativas, pleomórficas e intracelulares obrigatórias que ao adentrarem em leucócitos ou plaquetas formam inclusões características, denominadas de mórulas. Os agentes Anaplasmataceae têm ampla distribuição territorial, havendo relato de infecção em diversos países e em diferentes espécies de vertebrados. Porém, estudos envolvendo a infecção em felinos domésticos ainda são recentes, principalmente no Brasil, havendo apenas relatos esporádicos. Em geral, os gatos acometidos são assintomáticos, constituindo-se num risco maior por não serem identificados como portadores. A erliquiose e a anaplasmose felinas são transmitidas por vetores, com destaque para os carrapatos. Porém, ainda não se sabe ao certo quais os vetores no Brasil e as vias de transmissão da infecção natural, sendo provável que a exposição a artrópodes e a ingestão de roedores sejam as principais causas de infecção dos felinos. Vale ressaltar que a distribuição geográfica dos vetores tem influência direta sobre a prevalência da doença em uma determinada área. O método diagnóstico mais utilizado para identificação da infecção por estes agentes é a detecção direta de mórulas em esfregaços sanguíneos, que, apesar de ser um método simples e prático, apresenta sensibilidade reduzida devido à baixa parasitemia em infecções naturais. Os testes sorológicos, por sua vez, são de grande valia principalmente em estudos epidemiológicos, porém reações cruzadas podem ocorrer dependendo do antígeno utilizado. As técnicas em biologia molecular, como a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), a nested-pcr e a PCR em tempo real, vêm ganhando espaço por apresentarem alta sensibilidade e especificidade e, aliadas ao sequenciamento, permitem a caracterização genética dos agentes. Apesar da importância destes agentes na infecção de felinos, poucos estudos são desenvolvidos no Brasil abordando esta temática. Portanto, tornam-se necessárias investigações a fim de melhor caracterizar os agentes da família Anaplasmataceae e os aspectos envolvidos na sua transmissão, patogênese e manifestação clínica em gatos domésticos no Rio de Janeiro. 1

19 O presente estudo tem como objetivo diagnosticar felinos domésticos no Rio de Janeiro infectados naturalmente por agentes Anaplasmataceae (Ehrlichia spp. e Anaplasma spp.) por meio de métodos sorológico e molecular, bem como avaliar as alterações hematológicas associadas a estas infecções. 2

20 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Infecções por Agentes Anaplasmataceae As espécies pertencentes à família Anaplasmataceae são bactérias gram-negativas, imóveis, intracelulares obrigatórias, cocóides a elipsoidais, residentes em fagossomos que causam doença no homem e animais. São organismos que se mantem na natureza através de interações complexas entre vetores invertebrados e hospedeiros vertebrados (DUMLER et al., 2001; PADDOCK; CHILDS, 2003). Caracterizam-se por espécies filogeneticamente relacionadas, porém genética e antigenicamente diferentes (YU et al., 2006). Em 2001, Dumler et al. reorganizaram os gêneros Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia e Wolbachia, como pertencentes à família Anaplasmataceae e à ordem Rickettsiales. Com isso, algumas espécies foram agrupadas em gêneros diferentes ao que pertenciam anteriormente. Essas mudanças foram baseadas em estudos moleculares que permitiram uma caracterização taxonômica mais precisa desses agentes. Ehrlichia platys e E. bovis passaram a ser denominadas de A. platys e A. bovis; as espécies E. phagocytophila, E. equi e o agente da Erliquiose Granulocítica Humana foram renomeados como espécie A. phagocytophilum, porém permaneceram como três cepas distintas. Cowdria ruminantium passou a ser E. ruminantium; e, E. risticii e E. sennetsu passaram a pertencer ao gênero Neorickettsia como N. risticci e N. sennetsu respectivamente. Depois dessa reorganização, o gênero Anaplasma passou a conter as espécies A. marginale, A. centrale, A. ovis, A. bovis, A. platys e A. phagocytophilum. O gênero Ehrlichia passou a ser composto por E. ruminantium, E. canis, E. chaffeensis, E. muris e E. ewingii. Já o gênero Neorickettsia passou a conter as espécies N. helminthoeca, N. risticii e N. sennetsu, sendo que e apenas W. pipientis permaneceu no gênero Wolbachia. 2.2 Histórico da infecção por agentes Anaplasmataceae em felinos domésticos A primeira descrição de Ehrlichia canis ocorreu em cães em 1935 (DONATIEN; LESTOGUARD, 1935), já o primeiro relato de erliquiose felina ocorreu na França por Charpentier e Groulade (1986) que observaram mórulas em células mononucleares de gatos. Na América Latina, o primeiro relato ocorreu no Brasil, em 1998, no Estado do Rio de Janeiro em um gato febril, com sintomas inespecíficos e mórulas em plaquetas observadas na microscopia (ALMOSNY et al., 1998). Já a primeira detecção molecular de E. canis em gatos na América Latina também foi no Brasil, em animais atendidos na rotina laboratorial do hospital veterinário da Universidade Federal de Viçosa, conforme relatado por Oliveira et al. (2009). A trombocitopenia cíclica infecciosa canina (ICCT) foi primeiramente descrita em 1978, nos Estados Unidos (HARVEY et al., 1978) e sua etiologia foi atribuída a um microrganismo que infectava seletivamente as plaquetas. Os autores confirmaram, através de microscopia eletrônica, que as inclusões plaquetárias tratavam-se de vacúolos contendo organismos do tipo rickettsia, denominando o agente de Ehrlichia platys. Com o advento da biologia molecular, este organismo foi reclassificado como Anaplasma platys (DUMLER et al., 2001). O primeiro relato de inclusões sugestivas de A. platys em gatos no Brasil foi 3

21 observado por Santarém et al. (2005) em uma gata atendida no Hospital Veterinário da Universidade do Oeste Paulista, Presidente Prudente-SP, no Brasil. Anaplasma phagocitophilum inicialmente foi identificado como agente da Erliquiose Granulocítica Humana, atualmente Anaplasmose Granulocítica Humana (AGH), sendo denominado Ehrlichia equi em cavalos e Anaplasma phagocitophilum em ovelhas e outros ruminantes (FOGGIE, 1949; RISTIC; HUXSOLL, 1984; MADEWELL; GRIBBLE, 1982); porém estudos moleculares demonstraram ser o mesmo organismo (DUMLER et al., 2001). O primeiro relato da infecção de A. phagocitophilum em cães foi realizado em 1982 na Califórnia (MADEWELL; GRIBBLE, 1982) e desde então a anaplasmose granulocítica tem sido identificada em várias espécies animais em diversas partes do mundo. No Brasil, o primeiro relato da infecção por este agente foi em cães do município de Seropédica, RJ, a partir de estudos moleculares (SANTOS et al., 2011). Porém, não há relatos de infecção em felinos domésticos no Brasil até o presente momento. 2.3 Importância e distribuição Ehrlichia canis infecta células mononucleares do sangue, formando inclusões citoplasmáticas, denominadas de mórulas, podendo nos gatos ser encontrada em plaquetas, como observado em infecção experimental por Almosny et al. (1998). A erliquiose é amplamente estudada em cães por causar uma doença grave, a erliquiose monocítica canina, relacionada a um quadro de anemia, leucopenia e trombocitopenia (HUXSOLL et al., 1969; HUXSOLL et al., 1970; HARRUS et al., 1999). A ocorrência de erliquiose felina no mundo varia bastante de acordo com a região estudada e a técnica de diagnóstico empregada. Na Espanha, dentre 235 gatos avaliados, 17,4% de gatos errantes e 18,4% dos gatos pets foram positivos em teste sorológico (Reação de Imunofluorescência Indireta - RIFI) para Ehrlichia sp. (ORTUÑO et al., 2005). Por outro lado, em Barcelona, Tabar et al. (2008) encontraram apenas um animal positivo pela PCR para os gêneros Ehrlichia/Anaplasma em 100 felinos estudados. Já na América do Norte não há evidências sorológicas da detecção deste agente, exceto em casos isolados de animais doentes (LITTLE, 2010). No Brasil, em Viçosa-MG, 20% (3/15) dos felinos amostrados foram positivos na PCR, havendo 99% de similaridade com a sequência homóloga comparada e 100% de similaridade com a sequência de E. canis obtida de cães doentes da mesma região, exceto pela sequência EU567024, que apresentou duas bases nucleotídicas diferentes, sugerindo a possibilidade de uma mesma cepa de E. canis infectando cães e gatos no Brasil (OLIVEIRA et al., 2009). Já em São Luís-MA houve apenas 1% (2/200) de gatos positivos pela PCR para Ehrlichia sp. baseada no gene 16S rrna, sendo uma amostra positiva para E. canis e outra positiva para E. chaffeensis na nested-pcr, porém ambas as amostras foram negativas na RIFI (BRAGA et al., 2012). Anaplasma platys é um parasito intracelular obrigatório encontrado exclusivamente em plaquetas onde forma mórulas características de sua infecção (HARVEY et al., 1978). A primeira detecção de inclusões sugestivas de A. platys em gatos ocorreu no Brasil (SANTARÉM et al., 2005). E mais recentemente ocorreu a caracterização molecular do agente por Lima et al. (2010) em um felino doméstico com anorexia, apatia, anúria e constipação, onde observaram-se mórulas em plaquetas durante a leucometria específica. Em 2009, Dahroug detectou pela nested-pcr o DNA de A. platys em uma onça parda de cativeiro ao pesquisar felinos selvagens no Mato Grosso. Ainda no Brasil, Correa et al. (2011) 4

22 observaram 13,18% (12/91) dos gatos positivos utilizando a nested-pcr, demonstrando a susceptibilidade de felinos ao agente e que há necessidade de maiores estudos envolvendo esta rickettsia. E de acordo com a literatura consultada, não há outros relatos da ocorrência de A. platys em felinos domésticos ou selvagens, em outros países do mundo. Anaplasma phagocytophilum, por sua vez, infecta granulócitos, predominantemente neutrófilos, onde também se reproduz formando mórulas. Já houve relatos de infecção no homem, cães, felinos, equinos e ruminantes, além de uma grande variedade de pequenos mamíferos silvestres, apesar dessa diversidade de hospedeiro variar de acordo com a região geográfica (BJOERSDORFF et al., 1999; PUSTERLA et al., 1999). Na Suécia, Bjoersdorff et al. (1999) descreveram o primeiro relato de erliquiose granulocítica felina por A. phagocytophilum confirmado pela PCR e pelo sequenciamento. Não há confirmação de infecção em gatos no Brasil, no entanto, sua ocorrência em gatos domésticos nos Estados Unidos e em países da Europa é reportada (HEIKKILA et al., 2010; LAPPIN et al., 2004; TARELLO, 2005). Nos Estados Unidos, em regiões endêmicas, a soroprevalência chega a 30% (LITTLE, 2010). Na Flórida, dentre 553 gatos errantes, nove foram positivos para A. phagocytophilum pela PCR (LURIA et al., 2004). Em estudo conduzido por Billeter et al. (2007) avaliando gatos domésticos utilizando a RIFI, foi observado que o agente circula nos seguintes estados dos Estados Unidos: Flórida (12/90), Califórnia (3/23), Michigan (3/45) e Rhode Island (2/31); porém não houve detecção no Alabama (n=175) e Wisconsin (n=96) e também não houve positivos quando testados pela PCR. Já na Espanha, Solano-Galllego et al. (2006) observaram 1,8% de soropositividade utilizando a RIFI dentre os 168 animais estudados, porém estes animais foram negativos quando testados pela PCR. Recentemente, Machado et al. (2012) detectaram A. phagocytophilum em aves selvagens no Brasil, sugerindo que estas podem carrear agentes Anaplasmataceae servindo como fonte de infecção a outros animais no Brasil. Além disso, foi relatada a detecção molecular de A. phagocytophilum em cães do município de Seropédica, RJ, demonstrando a real possibilidade da circulação deste agente zoonótico nesta área (SANTOS et al., 2011). Além disso, nosso grupo de pesquisa observou inclusões em plaquetas e neutrófilos características da família Anaplasmataceae em esfregaços sanguíneos de gatos do estado do Rio de Janeiro, associados à presença de trombocitopenia (GUIMARÃES et al., 2012). 2.4 Transmissão, Ciclo Biológico e Mecanismos de defesa Os agentes Anaplasmataceae são transmitidos por vetores, sendo os carrapatos os maiores responsáveis pelas infecções por esses agentes. Rhipicephalus sanguineus é frequentemente associado à transmissão de E. canis, A. platys e E. ewingii (COHN, 2003). Já o gênero Ixodes spp. é responsável pela transmissão de A. phagocytophilum e os carrapatos Amblyomma spp. e Dermacentor spp. são transmissores de E. chaffeensis e E. ewingii (PREZIOSI; COHN, 2002). Na erliquiose canina, a transmissão do agente ocorre quando o carrapato infectado inocula sua secreção salivar contaminada no local da picada ao se alimentar de cães (GROVES et al., 1975). No hospedeiro vertebrado, a infecção inicia-se nos corpos elementares que penetram nos monócitos e linfócitos, multiplicando-se posteriormente por divisão binária formando os corpos iniciais, que após 7 a 12 dias de incubação darão origem as mórulas. As mórulas são as únicas formas identificadas microscopicamente nos hospedeiros vertebrados (McDADE, 1990), reconhecidas por inclusões de aspecto compacto, formadas por agrupados de pequenas estruturas que variam de forma cocóide a elipsoidal 5

23 (RISTIC; HUXSOLL, 1984). A ruptura das células hospedeiras libera formas infectantes que dão continuidade exponencial ao processo ao atingir novas células. Uma ou mais mórulas podem estar infectando a mesma célula hospedeira (MARCONDES, 2009). Na infecção por Ehrlichia sp. ocorre diversas recombinações nos genes das suas principais proteínas antigênicas, formando vários epítopos antigênicos distintos, que permitem a esses agentes escapar das defesas do organismo e manter infecções persistentes (REDDY; STRECK, 1999). A evasão do sistema imune é outro mecanismo pelo qual E. canis consegue se perpetuar no seu hospedeiro. Estudos in vitro indicaram uma diminuição na expressão de receptores do Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC) de classe II (HARRUS et al., 2003). O vetor da erliquiose canina é o carrapato Rhipicephalus sanguineus, porém foi provado experimentalmente que o carrapato Dermacentor sp. também pode transmitir E. canis (JOHNSON et al., 1998). A transmissão do cão para o carrapato ocorre principalmente durante as duas a três primeiras semanas pós-infecção. Isto acontece porque na fase aguda da doença há um número maior de leucócitos contaminados na circulação (WOODY e HOSKINS, 1991). Os vetores infectados podem transmitir a doença por ao menos 155 dias após a infecção (NEER; HARRUS, 2006). É digno de nota que os vetores da erliquiose felina não são totalmente conhecidos e também ainda não estão definidas as vias de transmissão da infecção natural, sendo provável que a exposição a artrópodes (carrapatos e pulgas) e ingestão de roedores sejam as principais formas de infecção dos felinos naturalmente infectados (BEAUFILS et al., 1999; LAPPIN, 2001; DAGNONE et al., 2001). Na infecção por A. platys o período de incubação varia de oito a 15 dias. Na fase aguda da doença é possível observar grande quantidade de plaquetas infectadas no sangue. Com a multiplicação intensa do agente, após alguns dias, há queda brusca na contagem de plaquetas, atingindo valores de plaquetas/µl ou menos, tornando-se pequena a chance de observação do parasita. Após o desaparecimento dos microrganismos, a plaquetometria volta ao normal em três ou quatro dias. De sete a 14 dias após o primeiro episódio, ocorre outra parasitemia seguida por trombocitopenia. Estes episódios ocorrem de forma cíclica e tendem a diminuir com o passar do tempo, levando à fase crônica da doença onde há aparições esporádicas do parasita e trombocitopenias moderadas (HIBLER et al., 1986; HARVEY, 1990; SWANGO et al., 1989; WOODY; HOSKINS, 1991). O modo de transmissão de A. platys e o seu reservatório natural em felinos domésticos são desconhecidos, porém acredita-se que o Rhipicephalus sanguineus esteja envolvido em sua transmissão (STILES, 2000). A transmissão de Anaplasma phagocytophilum ocorre por carrapatos do gênero Ixodes (MAGNARELLI et al., 1995; MITCHELL et al., 1996; CHANG et al., 2001; ESKOW et al., 2001), porém no Brasil existe a possibilidade de transmissão pelo carrapato Rhipicephalus sanguineus (SANTOS et al., 2011). A. phagocytophilum pode alternar entre duas formas, pequenas células densamente coradas, as quais se ligam a alvos na célula do hospedeiro, e células reticulares que se multiplicam intracelularmente e então se transformam em células densamente coradas que são liberadas quando a célula do hospedeiro se rompe (LAI et al., 2009; POPOV et al., 1998). A. phagocytophilum, após entrada na célula, impede a fusão do fagolisossomo e causa bloqueio nos mecanismos oxidativos da respiração celular que são responsáveis pela eliminação dos organismos invasores (MOTT e RIKIHISA, 2000; WANG et al., 2002), garantindo a sobrevivência do agente e prejudicando a capacidade do hospedeiro de responder 6

24 a infecção. Vale ressaltar que em gatos o modo de transmissão e os vetores ainda não foram totalmente esclarecidos. Uma única espécie de carrapato pode albergar mais de um agente, visto que um animal infectado pode estar infestado por carrapatos de mais de uma espécie e diferentes instares. Assim, é possível co-infecção, o que dificulta o diagnóstico e o tratamento no animal doente (BREITSCHWERDT et al., 1998). 2.5 Sinais clínicos, determinações laboratoriais e achados patológicos Os sinais clínicos e determinações laboratoriais de felídeos infectados por E. canis são variáveis e compreendem febre, apatia, anorexia, palidez de mucosas, linfadenomegalia, esplenomegalia, anemia, trombocitopenia, leucopenia, aumento da atividade sérica das transaminases e fosfatase alcalina e hiperglobulinemia (ALMOSNY et al., 1998; ALMOSNY; MASSARD, 1999; STUBBS et al., 2000). Almosny e Massard (2002) observaram sinais de caquexia, emaciação, diarreia e distúrbio congestivo hemorrágico notável nos pulmões como achados anátomo-patológicos em felinos jovens inoculados experimentalmente com E. canis. Em estudos com cães, foi observado que animais tratados no estágio agudo da doença, onde há presença da sintomatologia exacerbada, respondem bem ao tratamento, porém a eliminação do agente pode ser difícil e o animal torna-se cronicamente infectado, servindo de reservatório. O período de incubação da erliquiose em cães é de aproximadamente uma a três semanas (HARRUS et al., 1997b), após esse período, a doença evolui para os estágios agudo, subclínico e, em certos casos, crônico (HARRUS et al., 1997a). Ehrlichia canis possui predileção por células encontradas na microvascularização dos pulmões, rins e meninges (HOSKINS, 1991; HARRUS et al., 1997a, b), sendo a epistaxis causada por hemorragias características dos pulmões ou da mucosa nasal (RIKIHISA, 1991). Os animais infectados com A. platys são na maioria assintomáticos. As manifestações clínicas de cães experimentalmente infectados variam, sendo mais frequentemente observadas depressão, anorexia, letargia, emaciação, linfadenomegalia, palidez de mucosas e febre (HARRUS et al., 1997a). Os principais achados laboratoriais da infecção por A. platys são trombocitopenia, anemia (DAGNONE et al., 2003), macroplaquetas, monocitose e hipoalbuminemia (HARRUS et al., 1997a, KAKOMA et al., 2000). A severa trombocitopenia causada pelo agente se deve a diminuição da sobrevida das plaquetas como consequência da multiplicação intensa deste organismo. No caso da cronicidade da doença, a remoção das plaquetas pode ocorrer por uma resposta imunomediada (STILES, 2000; WOODY; HOSKINS, 1991); outra hipótese para a trombocitopenia é a agregação plaquetária (GAUNT et al., 1990) Em gatos, os sintomas associados ainda não foram bem elucidados. A infecção por A. phagocytophilum em gatos é caracterizada por febre, mialgias, dores articulares, linfadenomegalia, claudicação, doença periodontal, conjuntivite e sinais neurológicos (LITTLE, 2010). Em estudo com cães, foi observado que a maioria dos animais naturalmente infectados permanece saudável, como indicado por evidências sorológicas de exposição em áreas endêmicas, na ausência de um histórico de doença clínica (BEALL et al., 2008; FOLEY et al., 2001). Porém, no caso de doença com manifestação clínica os achados são hiperestesia, mialgia, artralgias, rigidez de pescoço, claudicação, incoordenação, neutrofilia com desvio a esquerda, linfopenia, além de outros sinais clínico-laboratoriais comuns à erliquiose canina (BJOERSDORFF et al., 1999; TARELLO, 2005). 2.6 Importância em saúde pública 7

25 Gatos domésticos podem ser reservatórios para erliquias que infectam outros animais, inclusive humanos (STUBBS et al., 2000). Ehrlichia canis foi descrita como uma zoonose capaz de causar doença grave em humanos, com casos de óbito principalmente em crianças, imunocomprometidos e idosos (PEREZ et al., 2006). Quadros clínicos diversos são relatados em pessoas com sorologia positiva para E. canis ou infectadas por microrganismo semelhante à E. canis, como febre, mialgia, fraqueza e confusão mental (DORAN et al., 1989; FISHBEIN et al., 1987; GOLDEN et al., et al., 1989; MAEDA et al., 1987). A. platys tem potencial zoonótico, tendo sido observado inclusões sugestivas em plaquetas de humanos (ARRAGA, 1999). Recentemente, houve a detecção molecular de A. platys em co-infecção com Bartonella henselae e Candidatus Mycoplasma haematoparvum em uma médica veterinária, causando dores de cabeça, doença repentina incluindo status epilético e outras anomalias neurológicas e neurocognitivas (MAGGI et al., 2013), reforçando a importância deste agente em saúde pública. A detecção de A. phagocytophilum é de significativa importância em saúde pública, já que sabidamente é uma zoonose. A Anaplasmose Granulocítica Humana (AGH) é caracterizada por uma doença febril semelhante à gripe que ocorre após a picada por carrapatos (BAKKEN et al., 1996), sendo geralmente leve e auto-limitante. Também pode causar fadiga, dores articulares, dor de cabeça, mialgia e febre (STEERE et al., 1983; AGUERO-ROSENFELD et al., 1996; BAKKEN et al., 1996; PETROVEC et al., 1997). Como achados da AGH pode-se relatar depleção linfoide esplênica, agregados de macrófagos e apoptose no fígado, hiperplasia paracortical e células hemofagocíticas dentro dos tecidos do sistema fagocíticomononuclear (LEPIDI et al., 2000). Manifestações neurológicas já foram descritas em pessoas com AGH, quando o organismo foi detectado no fluido cerebrospinal (LEE et al., 2000). Análises laboratoriais de sangue periférico normalmente não revelam alterações hematológicas. No entanto, pode ser observada uma leve leucopenia associada a trombocitopenia ou às vezes um desvio neutrofílico à esquerda, como também um leve a moderado aumento na atividade das transaminases hepáticas (BAKKEN; DUMLER, 2008; BAKKEN et al., 1996a; DUMLER et al., 2007). A forma grave da doença tende a ocorrer em humanos de idade avançada, ou naqueles com doença imunossupressora concomitante ou terapia medicamentosa. Nos Estados Unidos, o quadro de prevalência de doenças transmitidas por carrapatos apresenta a AGH e a Erliquiose Monocítica Humana (EMH), causada por E. chaffeensis, respectivamente, como a terceira e a quarta doenças transmitidas por carrapatos mais comuns no país, atrás somente da Doença de Lyme e da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas (DUMLER, 2005). No Brasil houve relatos de casos suspeitos de EMH em Minas Gerais, onde se observaram títulos de anticorpos para E. chaffeensis em dois pacientes com sintomatologia clínica (CALIC et al., 2005) e em 1,2% (9/771) pacientes com doença febril atendidos em hospitais de Juiz de Fora, MG (COSTA et al., 2006). 2.7 Diagnóstico Detecção direta por esfregaço sanguíneo O diagnóstico laboratorial dos agentes da família Anaplasmataceae é realizado rotineiramente pela identificação direta de mórulas em esfregaços sanguíneos. Apesar de ser uma técnica rápida e prática, na maioria dos casos de infecção natural, não é totalmente confiável, já que a parasitemia é variável e, geralmente, um pequeno número de células são infectadas (NAKAGHI et al., 2008). 8

26 Deve-se levar em conta também a possibilidade de outros diagnósticos diferenciais, como inclusões virais, Leishmania donovani, Hepatozoon canis, B. canis e B. gibsoni fagocitadas e/ou sobrepostas serem confundidas com inclusões de agentes Anaplasmataceae (NEITZ; THOMAS, 1938). Além disso, precipitados de corantes e artefatos sobre os leucócitos podem ser confundidos com estruturas características desses agentes (DAGNONE et al., 2001). Como alternativa para aumentar a sensibilidade do diagnóstico microscópico, a literatura propõe a confecção do esfregaço sanguíneo a partir da primeira gota de sangue periférico, com a justificativa de que essa gota contém muito mais mononucleares do que as gotas seguintes (NEITZ; THOMAS, 1938). Além do esfregaço sanguíneo convencional e de capa leucocitária, o uso do diagnóstico citológico de linfonodos pode levar a um diagnóstico definitivo na fase aguda da doença (MYLONAKIS et al., 2003). Nos cães, sabe-se que é importante pesquisar mais atentamente as inclusões granulocíticas e adotar algum outro método de diagnóstico que não seja apenas a detecção por esfregaço sanguíneo, pois E. ewingii apresenta inclusões semelhantes as de A. phagocytophilum. Assim, em gatos tal sugestão também se torna válida (GOLDMAN et al., 1998) Isolamento em cultura de células O isolamento de E. canis em culturas de células demonstrou ser o método mais sensível e definitivo para o diagnóstico inicial da erliquiose, porém requer muito tempo para a obtenção de resultados positivos, cerca de 14 a 34 dias. Também necessita de estrutura física, profissional experiente e equipamentos adequados, inviabilizando seu uso como método de diagnóstico de rotina (IQBAL et al., 1994). Porém, o cultivo celular ainda é considerado a modalidade mais sensível de diagnóstico para detecção de infecção aguda em pacientes humanos (AGUERO-ROSENFELD et al., 2002). Para o isolamento de E. canis já foi descrita inoculação em células do tipo macrófagos de linhagem de camundongos BALB/C (KEYSARY et al., 2001), células originárias de histiocitoma canino DH82 (AGUIAR et al., 2007), uma linhagem de células microvasculares de endotélio humano (DAWSON et al., 1993), monócito primário canino (HELMET et al., 1980) e macrófago peritoneal canino (STEPHENSON; OSTERMAN, 1977). Todas as cepas de A. phagocytophilum podem ser cultivadas in vitro na linhagem de células HL-60 humana. Este método é usado em pesquisas, mas não está comercialmente disponível, não sendo utilizado para fins de diagnóstico (GREENE, 2006) Testes sorológicos Há uma grande diversidade de testes sorológicos que podem ser utilizados no diagnóstico das infecções por agentes Anaplasmataceae. Estes são uma alternativa viável e de grande aplicação nos estudos de levantamento epidemiológico. Mas reações cruzadas podem ocorrer, já que as espécies de erliquias dividem antígenos em comum. A sorologia pode fornecer resultados negativos durante a primeira semana de infecção, uma limitação destes testes que não detectam a infecção em sua fase aguda (WALKER; DUMLER, 1996; WANER et al., 2001; PADDOCK; CHILDS, 2003) e também não diferencia um quadro de infecção atual de um quadro de exposição sem infecção propriamente dita ou de uma infecção prévia (SHAW et al., 2001). Deve-se também levar em 9

27 consideração a variação entre laboratórios em relação à interpretação de títulos sorológicos e ao antígeno utilizado (SHAW et al., 2001). O teste padrão ouro das sorologias é a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para a detecção de anticorpos Imunoglobulina G (IgG) anti-e. canis. Anticorpos IgG apresentam títulos consistentes havendo um aumento de quatro vezes na fase aguda, além de permanecerem circulantes por vários meses após eliminação do agente (BARTSCH; GREENE, 1996). Já os anticorpos Imunoglobulina M (IgM) não são considerados um indicador confiável de exposição, devido sua produção inconsistente durante a infecção (MCBRIDE et al., 2003). A RIFI é considerada um bom método de diagnóstico, pois detecta anticorpos séricos em animais portadores ou com infecção crônica que mantém parasitemia baixa ou não detectável ao microscópio óptico (AGUIAR et al., 2007). Aliado a isso, é um método prático, simples e sensível e, comparada aos demais métodos de diagnóstico, não requer equipamentos caros, se tornando mais acessível para diagnóstico na rotina clínica e laboratorial. Porém, necessita de profissional experiente para a leitura das lâminas, o que torna o resultado subjetivo. Uma alternativa bastante utilizada atualmente são os kits comerciais de Ensaio Imunoenzimático Indireto (ELISA), pois fornecem um diagnóstico rápido e de baixo custo. Porém, esses testes são meramente qualitativos, oferecendo apenas resultados positivos e negativos, sem titulação. Não se observa diferença significativa entre RIFI e testes ELISA comerciais (HARRUS et al. 2002). Em um estudo comparando o dot-blot ELISA com a RIFI, foi observado que o dot-blot ELISA é tão sensível e específico para a detecção de anticorpos IgG anti-e. canis quanto a RIFI, tanto em infecções naturais quanto em experimentais (NAKAGHI et al., 2004). Além de apresentar as vantagens da rapidez, não requer equipamentos caros, apresenta facilidade da leitura dos resultados, e proporciona um registro permanente (CADMAN et al., 1994; NAKAGHI et al., 2004). O Western Immunoblotting é um teste com sensibilidade próxima a da RIFI, que identifica o agente através das digitais do seu perfil proteico imunogênico. Apresenta a vantagem de ter uma leitura objetiva, já que não sofre influência da subjetividade do operador. Também é mais específica, sendo utilizada para caracterizar e distinguir os diferentes organismos resolvendo os problemas de reação cruzada. Contudo, é uma técnica mais custosa e trabalhosa, que necessita de mais tempo e de tecnologia mais avançada que a RIFI, não sendo indicada para o diagnóstico na rotina clínica (ANDEREG; PASSOS, 1999; HARRUS et al., 2011). Não há relatos de reação cruzada entre A. platys e E. canis utilizando a RIFI, entretanto pode ocorrer reação sorológica cruzada entre A. platys e A. phagocytophilum (GREENE, 2006). Reatividade sorológica cruzada entre A. phagocytophilum e E. canis também foi relatada, mas parece ser menos frequente (POITOUT et al., 2005; PLIER et al., 2009; BREITSCHWERDT et al., 1998) Detecção molecular As técnicas em biologia molecular ganham cada vez mais destaque, permitindo a detecção e a caracterização de novos patógenos (SANTOS et al., 2011). A Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) é uma técnica amplamente aplicada em diversas áreas do diagnóstico molecular. É uma tecnologia flexível, que permite análise de uma grande variedade de amostras detectando uma sequência de interesse presente em uma amostra complexa de DNA (MOLINA; TOBO, 2004). 10

28 A nested-pcr é altamente sensível, pois é capaz de detectar 0,2 pg de DNA purificado de E. canis, enquanto que uma só amplificação de DNA permite detectar apenas valores acima de 20 pg (WEN et al., 1997), sendo portanto uma alternativa mais sensível para detecção deste e outros agentes Anaplasmataceae. Outra variante da técnica de PCR é a PCR multiplex, a qual é desenhada para detectar múltiplas sequências-alvo numa mesma amostra, na mesma reação, pelo uso de mais de um par de oligonucleotídeos iniciadores (primers). Apresenta como vantagens a economia de tempo, reagentes, uso do termociclador, custo geral e ainda, pode facilitar estudos epidemiológicos moleculares que necessitem da triagem de um grande número de potenciais vetores e populações de reservatório (COURTNEY et al., 2004). A PCR em tempo real (qpcr) é uma técnica capaz de fornecer resultados quantitativos, permite o acompanhamento da reação e a obtenção dos resultados de forma mais precisa e rápida em comparação à PCR convencional que apresenta resultados qualitativos (NOVAIS; PIRES-ALVES, 2004). Além disso, é desnecessário o processamento pós-pcr como a eletroforese em gel de agarose. Através da avaliação do CycleThreshold (C T ) se consegue avaliar o ciclo exato onde a reação atinge o limitar de detecção e, com isso, comparar todas as amostras, sendo o sistema de detecção baseado na quantificação da fluorescência gerada durante a reação (NOVAIS; PIRES-ALVES, 2004). A qpcr é menos propensa a contaminações do que a PCR convencional e se houver algum tipo de contaminação esta é facilmente detectável através da análise das curvas de melting (PEREIRA, 2012). Dois sistemas de quantificação são utilizados de forma ampla e rotineira na técnica de qpcr, o SYBR Green e o Taq Man. O SYBR Green é um método de detecção menos específico. Este corante se liga entre a fita dupla de DNA e, com a excitação da luz emitida pelo sistema óptico do termociclador, emite uma fluorescência verde. As vantagens de sua utilização são o baixo custo, a facilidade no uso e sensibilidade. A desvantagem é a ocorrência de ligação em todo DNA fita dupla que surge durante a reação, incluindo os dímeros dos iniciadores e outros produtos inespecíficos, podendo resultar em uma superestimação da concentração do fragmento alvo. A fluorescência é realçada quando as moléculas do SYBR Green estão ligadas na fita dupla do DNA, já as não-ligadas apresentam fluorescência fraca, produzindo um sinal mínimo que é subtraído durante a análise de computador (NOVAIS; PIRES-ALVES, 2004). A sonda Taq Man é um fragmento molde de DNA marcado usado para hibridizar outra molécula de DNA utilizada para detectar sequências específicas nos fragmentos de DNA amplificados na PCR. Esta sonda apresenta em uma extremidade um fluoróforo, e na outra extremidade um quencher (molécula que aceita energia do fluoróforo na forma de luz e a dissipa na forma de luz ou calor). Os produtos da reação são detectados pela fluorescência gerada após a atividade exonuclease 5'-3' da Taq DNA Polimerase (NOVAIS; PIRES- ALVES, 2004). É um método de detecção específica porque, além da ligação do par de primers, é necessário que a sonda hibridize no fragmento a ser amplificado. A Análise de melting em Alta Resolução (HMR) é uma técnica que utiliza a qpcr desenvolvida inicialmente para genotipagem, avaliando polimorfismo em um nucleotídeo único (WITTWER et al., 2003). Essa técnica pode ser útil na diferenciação entre diferentes cepas e espécies dos agentes Anaplasmataceae. Para a detecção de agentes Anaplasmataceae na PCR e seus derivados o gene 16s rrna é amplamente utilizado no seu diagnóstico, identificação e genotipagem (OLSEN; WOESE, 1993; PEREZ et al., 2006). É um gene conservado encontrado em todas as espécies de bactérias. Produtos de PCR destegene têm sido utilizados para análise de sequências das 11

29 espécies de Ehrlichia, no sentido de comparar as variações de cepas geograficamente dispersas (PEREIRA, 2012). A identificação molecular de hemoparasitas seguida por sequenciamento de vários genes específicos tem sido utilizada para o diagnóstico dos agentes Anaplasmataceae, auxiliando na compreensão da doença e na identificação de reservatórios para espécies com potencial mórbido para seres humanos e animais domésticos. Os estudos abordando a detecção de DNA dos membros da família Anaplasmataceae em felinos domésticos ainda são escassos, havendo poucos relatos na América do Norte, Europa e Ásia (YIN-CHIACHUN et al., 2003; LAPPIN et al., 2004) e recentemente no Brasil (OLIVEIRA et al., 2009; LIMA et al., 2010; CORREA et al. 2011; BRAGA et al., 2012). O uso de técnicas específicas de diagnósticos, aliadas ao conhecimento dos agentes rickettsiais ocorrentes no Brasil permitirá avaliar se há ou não distinção entre os agentes que acometem humanos e animais domésticos. 2.8 Tratamento e profilaxia Assim como na erliquiose canina, os fármacos de escolha para o tratamento de infecção por agentes Anaplasmataceae em felinos são a tetraciclina e a doxixiclina (ALMOSNY et al., 1998; ALMOSNY; MASSARD, 1999; BJOERSDORFF et al., 1999; LAPPIN et al., 2004; TARELLO et al., 2005). Animais com infecção crônica possuem prognóstico ruim, podendo apresentar melhora gradual ou nenhuma melhora após o tratamento, sendo que nos casos mais severos o tratamento prolongado é necessário (GREENE; HARVEY, 1990). Terapia suporte como fluidos, transfusão sanguínea, vitaminas, corticoides ou esteroides anabólicos podem ser utilizados (COHN, 2003). A profilaxia deve tomar como base o controle efetivo dos carrapatos. No caso de transporte de animais de áreas endêmicas para áreas livres, estes devem ser testados e, se necessário, tratados anteriormente (HUXSOLL et al., 1970). Para que o animal sirva como doador de sangue, o ideal é que passe por triagem com testes sorológicos ou moleculares (REINE, 2004). 12

30 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Animais O estudo foi realizado na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), sendo coletadas 216 amostras de gatos domésticos oriundos de atendimento em Clínicas Veterinárias da Região Metropolitana do Rio de Janeiro, sendo provenientes dos municípios de Duque de Caxias (n=14), Rio de Janeiro (n=99), Nova Iguaçu (n=39), Belford Roxo (n=8), São João de Meriti (n=21) e Mesquita (n=35) (Figura 1), de acordo com a disponibilidade e consentimento dos proprietários. O presente estudo foi aprovado pelo comitê de Ética na Pesquisa da UFRRJ, sob o processo / No momento da coleta de sangue foram observados dados relacionados ao hospedeiro (sexo, idade, raça, etc) utilizados posteriormente para avaliar possíveis associações com a positividade. Em seguida, houve uma divisão dos municípios em dois grupos: (1) Rio de Janeiro, composto por todos os animais da cidade do Rio de Janeiro, e (2) Baixada Fluminense, composto pelos gatos oriundos dos municípios de Belford Roxo, Duque de Caxias, Mesquita, Nova Iguaçu e São João do Meriti. De acordo com a Secretaria de Estado de Desenvolvimento da Baixada e da Região Metropolitana (SEDEBREM), a Baixada Fluminense é formada por 13 municípios, sendo: Belford Roxo, Duque de Caxias, Guapimirim, Itaguaí, Japeri, Magé, Mesquita, Nilópolis, Nova Iguaçu, Paracambi, Queimados, São João de Meriti e Seropédica, que juntos representam cerca de 33% do contingente populacional e 61% da área total da Região Metropolitana do Rio de Janeiro e 25% da população do Estado (IBGE, 2000). Já a capital, Rio de Janeiro, tem uma população de habitantes com 39,5% da população do Estado e 1200,278 km², correspondendo a 3% do território total do Estado, fazendo desta, a cidade com maior densidade demográfica do Estado (IBGE, 2010). 13

31 Figura 1. Localização geográfica dos municípios do estado do Rio de Janeiro de obtenção das amostras de sangue de gatos domésticos. 3.2 Coleta de Sangue De cada animal foram coletadas amostras de sangue em tubos com anticoagulante ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), através de venopunção cefálica ou jugular. O sangue foi mantido refrigerado durante o transporte até o Laboratório de Patologia Clínica da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. As amostras de sangue foram empregadas nas análises hematológicas e, posteriormente, alíquotas de plasma foram separadas por centrifugação e armazenadas a - 20 C até o momento da realização do diagnóstico imunológico. O restante das amostras de sangue foi armazenado a -80 C para utilização nas análises de biologia molecular. 3.3 Análise Hematológica A contagem global de leucócitos (Lt), hemácias (He) e plaquetas, as determinações dos teores de hemoglobina (Hb), volume globular (VG) e índices hematimétricos: Volume Corpuscular Médio (VCM) e Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média (CHCM) foram realizados utilizando o contador automático de células Poch 100 (Roche), de acordo com as recomendações do fabricante. A contagem diferencial de leucócitos (leucometria específica) e a análise da morfologia eritrocitária foram realizadas através de esfregaços de sangue total corados com corante rápido Panótico, analisados por microscópio óptico, objetiva de 100x, segundo Jain (1993). A pesquisa dos agentes foi realizada sob microscopia de luz (x100) nas lâminas coradas, observando em média 20 campos. 3.4 Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) A detecção de anticorpos IgG anti-ehrlichia sp. foi realizada com antígeno obtido a partir de cultura de células DH82 (derivadas de histiocitoma canino) infectadas com a amostra Jaboticabal de E. canis, isolada a partir de um cão, fêmea, da raça Weimaraner, em fase aguda da doença (AGUIAR et al., 2007). O suprimento de antígeno e os soros controles positivo e negativo foram gentilmente fornecidos pela professora Drª. Rosangela Zacarias Machado, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista (UNESP/FCAV), colaboradora do presente estudo. A RIFI foi realizada segundo protocolo previamente descrito por André et al. (2010). As amostras de plasma dos felinos domésticos, bem como dos soros controles foram diluídas a 1:64 em solução fisiológica (NaCl o,9%). Em seguida, 10µL do plasma diluído foi transferido para cada poço das lâminas contendo antígeno de E. canis. As lâminas foram incubadas a 37ºC por 30 minutos, em câmara úmida. Em seguida, passaram por três lavagens de cinco minutos em solução salina de fosfato tamponada, PBS 10X ph 7,2, secas e a cada uma adicionados 10µL de conjugado (anti-igg de gato, marcado pelo isoticianato de fluoresceína), diluído 1:32 em solução de PBS 1X ph7,2 com Azul de Evans, conforme orientação do fabricante (Sigma-Alodrich ). As lâminas foram incubadas novamente por mais 30 minutos, em câmara úmida a 37ºC. Após nova lavagem e secagem, as lâminas foram avaliadas à microscopia de luz ultravioleta (HUND WETZLAR). A positividade da reação 14

32 implicou na observação de fluorescência nas mórulas, comparativamente a amostras de soro controles positivo e negativo. 3.5 Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) Extração de DNA de sangue total As amostras de sangue colhidas em solução de EDTA foram submetidas ao processo de extração de DNA total com o kit ReliaPrep Blood gdna Miniprep System (Promega ), de acordo com as recomendações do fabricante. Para monitoramento de DNA contaminante durante o processo de extração de DNA total foi utilizado como controle negativo 200 μl de água ultra-pura esterilizada (Invitrogen ) em cada bateria de amostras processadas. Todas as amostras de DNA total tiveram suas concentrações determinadas pelo espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific ), separadas em alíquotas e armazenadas à -80ºC até a realização dos ensaios moleculares Reações de amplificação para Ehrlichia sp. baseadas no gene 16S rrna A detecção molecular de Ehrlichia sp. baseada no gene 16S rrna foi realizada segundo protocolo descrito por Murphy et al. (1998), com pequenas modificações. Nas reações de PCR foram utilizados 5µL (aproximadamente 30ng/µL) de DNA da amostra, além de 1,25 UTaq DNA Polimerase (Life Technologies ), Tampão da PCR (PCR buffer 10 X 100nM Tris-HCl, ph 9,0, 500 mmkcl), 0,2 mm de deoxinucleotídeos (datp, dttp, dctp e dgtp) (Life Technologies ), 1,5 mm de Cloreto de Magnésio (Life Technologies ), 0,5 µm de cada oligonucleotídeo iniciador (Life Technologies ) e água ultra-pura esterilizada (Life Technologies ) p.s.p. 25µL. Nas reações de nested-pcr, foram utilizados 1µL do produto amplificado da primeira reação de PCR, em um mix contendo os reagentes nas mesmas concentrações da primeira reação. Os oligonucleotídeos iniciadores e as condições de termociclagem de cada reação estão representados na tabela 1. Amostras de DNA controle positivo de E. canis, obtidos a partir de células DH82 infectadas com a amostra Jaboticabal de E. canis, foram gentilmente cedidas pela professora Rosângela Zacarias Machado. Tabela 1. Descrição dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados e das condições de termociclagem para as reações de PCR e nested PCR, utilizadas para detecção molecular de Ehrlichia sp. e E. canis baseadas no gene 16S rrna. Agente Seqüência do oligonucleotídeo Condições de Termociclagem (MURPHY et al., 1998) Ehrlichia sp. - ECC - ECB 5 - GAACGAACGCTGGCGGCAAGC CGTATTACCGCGGCTGCTGGCA -3-94ºC por 3 minutos - 30 ciclos: 94ºC por 1 minuto, 65ºC por 2 minutos e 72ºC por 2 minutos - 72ºC por 5 minutos Nested E. canis - ECAN-5 -HE3 5 -CAA TTATTTATAGCCTCTGGCTATAGGA-3 5 -TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT-3-3 ciclos: 94ºC por 1 minuto, 55ºC por 2 minutos e 72ºC por 1,5 minutos - 37 ciclos: 92ºC por 1 minuto, 55ºC por 2 minutos e 72ºC por 1,5 minutos 15

33 3.5.3 PCR em Tempo Real para Anaplasma platys A reação para detecção molecular de A. platys pela PCR em tempo real foi realizada segundo protocolo desenvolvido no Laboratório de Hemoparasitos e Vetores da UFRRJ, sendo parte integrante do projeto intitulado Agentes etiológicos da Família Anaplasmataceae em cães e carrapatos e sua Importância para Saúde Pública, financiado pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) sob número de Processo E-26/ /2011. As amostras de DNA total foram submetidas à amplificação do gene glta de A. platys através do sistema TaqMan real-time PCR. As reações foram realizadas em volume final de 12µL contendo: 1X de TaqMan Universal PCR Master Mix, 10.8pmol dos primers 84f e 84r, 3pmol da sonda marcada na extremidade 5 com o Reporterdye FAM (6-carboxifluoresceina) e na extremidade 3 com o Quencher TAMRA (6-carboxi-tetrametil-rodamina), 3µL de amostra de DNA e água ultra pura em quantidade suficiente para completar 12µL de volume final. As reações foram realizadas no aparelho Step One Plus TM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) com as seguintes condições de termociclagem: 52 C por 2 min, 95 C por 10 min, e 45 ciclos a 95 C por 15s, seguidos de 60 C por 1 min. As amostras com C T inferior a 40 ciclos foram consideradas positivas Reações de amplificação para Anaplasma platys baseadas no gene 16S rrna As amostras positivas na PCR em Tempo Real para A. platys foram submetidas a nested-pcr, para posterior sequenciamento conforme protocolo descrito por Martin et al. (2005). Nas reações de PCR para Anaplasma sp. foram utilizados 5 µl de DNA amostra, em concentração média de 20ng/µl. Os oligonucleotídeos iniciadores e as condições de termociclagem utilizados na PCR estão representados na tabela 2. Na reação foram utilizados 1,25 U Taq DNA Polimerase (Life Technologies ), Tampão da PCR (PCR buffer 10 X 100nM Tris-HCl, ph 9,0, 500 mmkcl), 0,2 mm de deoxinucleotídeos (datp, dttp, dctp e dgtp) (Life Technologies ), 3 mm de Cloreto de Magnésio (Life Technologies ), 12,5 pmol de cada oligonucleotídeo iniciador (Life Technologies ) e água ultra-pura esterilizada (Life Technologies ) p.s.p. 25µL. Nas reações de nested-pcr foram utilizados 1µL do produto amplificado na primeira reação de PCR, em um mix contendo os reagentes nas mesmas concentrações da primeira reação. Amostras de DNA controle positivo de A. platys foram gentilmente cedidas pelo professor Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares, Universidade Federal de Goiás. 16

34 Tabela 2. Descrição dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados e das condições de termociclagem para as reações para as reações de PCR e nested-pcr, utilizadas para detecção molecular de Anaplasma spp. e Anaplasma platys baseadas no gene 16S rrna. Agente Seqüência do oligonucleotídeo Condições de Termociclagem (MARTIN et al., 2005) Anaplasma spp ciclos: 94ºC por 1 minuto, 45ºC - 8F R 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG CCATGGCGTGACGGGCAGTGTG-3 por 1 minuto e 72ºC por 100 segundos + 1 segundo/ciclo - 72ºC por 5 minutos Nested Anaplasma platys - PLATYS -EHR16R 5 - AAGTGCAACGGATTTTTGTC-3 5 -TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT-3-94ºC por 1 minuto - 40 ciclos: 94ºC por 30 segundos, 55ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos - 72ºC por 5 minutos PCR em Tempo Real para Anaplasma phagocytophilum As amostras de DNA total foram submetidas à amplificação de 122pb do gene msp2 de A. phagocytophilum através do sistema TaqMan real-time PCR, segundo protocolo descrito por Santos et al. (2011). As reações foram realizadas em volume final de 12µL contendo: 1X de TaqMan Universal PCR Master Mix, 10pmol dos primers903f e 1024r, 3pmol da sonda 939p- (5 -TTAAGGACAACATGC TTGTAGCTATGGAAGGCA-3 ) (DRAZENOVICH et al., 2006) marcada na extremidade 5 com o Reporterdye FAM (6- carboxi-fluoresceina) e na extremidade 3 com o Quencher TAMRA (6-carboxi-tetrametilrodamina), 3µL de amostra de DNA. As reações foram realizadas no aparelho Step One Plus TM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) com as seguintes condições de termociclagem: 50 C por 2 min, 95 C por 10 min, e 40 ciclos a 95 C por 15s, seguidos de 60 C por 1 min. As amostras com C T inferior a 40 ciclos foram consideradas positivas Eletroforese de DNA em gel de agarose Os produtos amplificados na PCR (item e 3.5.4) foram submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,5%, a 90 V/50 ma durante 90 minutos. Para a determinação dos produtos amplificados foi utilizado marcador de peso molecular de 100pb (Life Technologies ). Os resultados foram visualizados e analisados através de transiluminador de luz ultravioleta acoplado ao analisador de imagem (L-pixtouch da Loccus Biotecnologia). 3.6 Sequenciamento de Nucleotídeos e Caracterização Molecular dos Isolados Os produtos da amplificação das reações de PCR foram purificados com kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), de acordo com as recomendações do fabricante. O sequenciamento foi realizado através do método automatizado baseado no método da terminação da cadeia por dideoxinucleotídeo (SANGER et al., 1977), utilizando-se os mesmos oligonucleotídeos iniciadores empregados na reação de PCR. O protocolo da reação de sequenciamento foi realizado com algumas modificações a partir daquele descrito 17

35 pelo fabricante do Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Utilizaram-se 3,5μL do Tampão 2,5x (200mM Tris-HCl ph 9,0; 5mM MgCl2); 0,5μL de Big Dye e 5 pmoles de cada oligonucleotídeo, 2,5μL de água ultra-pura e 1,5μL de DNA (sendo este ajustado de acordo com sua concentração, mensurada em aparelho espectrofotômetro (Nanodrop, Thermoscientific). O sequenciamento foi conduzido no sequenciador ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems), no Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (Unesp Jaboticabal). As sequências de nucleotídeos obtidas no sequenciamento foram submetidas a alinhamento e análise no Laboratório de Bioinformática do Laboratório de Biologia Molecular (FCAV- UNESP Jaboticabal). A triagem foi feita pelo programa Phred (EWING et al., 1998), que avalia os eletroferogramas gerados nos sequenciamentos, observando-se a qualidade dos picos correspondentes à cada base sequenciada e conferindo um valor de probabilidade de erro a cada uma das amostras. Foram consideradas as bases com qualidade acima de 20. O programa CAP3 ( foi utilizado para realizar o alinhamento da sequência consenso. O programa BLAST foi utilizado para analisar as sequências de nucleotídeos (BLASTn), objetivando-se procurar e comparar sequências similares em banco de dados internacionais (GenBank) (BENSON et al., 2002) com aquelas obtidas. 3.7 Cuidados para evitar contaminações Para verificar eventual contaminação dos reagentes e enzimas, um tubo contendo todos os componentes da PCR, com exceção da amostra de DNA, foi incluído em cada reação. A amostra de DNA foi substituída por uma quantidade equivalente de água ultrapura esterilizada (Invitrogen ), caracterizando o controle negativo. Também em cada reação foi adicionado um tubo contendo DNA sabidamente positivo para validar a reação. Foram utilizadas ponteiras com filtro em todas as fases do experimento, e os procedimentos de extração de DNA, e as reações de PCR foram realizadas em salas separadas. O preparo das reações e a pipetagem das amostras contendo DNA foram realizados em capela de fluxo laminar distintas, esterilizadas com luz ultravioleta imediatamente antes de cada reação. Todas as reações de PCR foram realizadas em sistema fechado. 3.8 Análise Estatística Os valores de positividade para Ehrlichia sp. e Anaplasma platys obtidos através dos diferentes métodos de diagnóstico nos felinos do estudo foram avaliados em função das variáveis obtidas através do questionário epidemiológico: sexo, raça e idade e comparados através do teste Qui-quadrado ou exato de Fisher em nível de 5% de significância. Os valores dos parâmetros hematológicos do grupo de felinos positivos e negativos para Ehrlichia sp. e Anaplasma platys do estudo foram submetidos a análise de variância e comparados através do teste F, em nível de 5% de significância, quando estes apresentaram distribuição normal. Quando os dados não apresentaram distribuição normal, foi utilizado o teste Mann-Whitney em nível de 5% de significância, para efeito de comparação destes parâmetros entre o grupo de animais positivos e negativos para este agentes. A frequência das alterações hematológicas no grupo de animais positivos e negativos foi comparada através do teste exato de Fisher ou Qui-quadrado em nível de 5% de significância. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa BioEstat 4.0 (AYRES, 2000). 18

36 4 RESULTADOS 4.1 Esfregaços sanguíneos Dentre os 216 gatos domésticos amostrados no presente estudo, 18 animais (8,3%) apresentaram nos esfregaços sanguíneos inclusões sugestivas de agentes Anaplasmataceae em leucócitos e/ou plaquetas (Figuras 2 e 3). A frequência de inclusões observadas somente em plaquetas (n=16) foi superior a observada em leucócitos (n=1, sendo em monócito) e, apenas um animal apresentou inclusões em leucócitos e plaquetas simultaneamente (sendo em plaqueta e neutrófilo). As frequências de animais positivos na detecção direta, em relação ao total de animais provenientes de cada município e nas diferentes regiões estudadas estão representadas na Tabela 3. Figura 2. Esfregaço sanguíneo demonstrando uma inclusão em plaqueta sugestiva de agentes Anaplasmataceae (Corante rápido, 1000x). Figura 3. Esfregaço sanguíneo demonstrando uma inclusão em monócito sugestiva de agentes Anaplasmataceae (Corante rápido, 1000x) 19

37 Tabela 3. Frequência de felinos domésticos com inclusões em plaquetas e/ou leucócitos sugestivas de agentes Anaplasmataceae observadas em esfregaços sanguíneos corados por corante Rápido Panótico domiciliados nos municípios da região metropolitana do Rio de Janeiro e nas regiões Baixada fluminense e Rio de Janeiro. Esfregaço sanguíneo Região Município Positivos Negativos Total Belford Roxo 0 (0,0%) 8 (100,0%) 8 Duque de Caxias 1 (7,1%) 13 (92,9%) 14 Baixada Fluminenseª Mesquita 0 (0,0%) 35 (100,0%) 35 Nova Iguaçu 4 (10,3%) 35 (89,7%) 39 São João de Meriti 3 (14,3%) 18 (85,7%) 21 8 (38,1%) 109 (93,2%) 117 Rio de Janeiroª Rio de Janeiro 10 (10,1%) 89 (89,9%) 99 ªValores seguidos de mesma letra não diferem significativamente através do teste Quiquadrado a 5% de significância (p<0,05). 4.2 Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) A detecção de anticorpos IgG anti-e. canis pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) demonstrou que 57 (26,4%) felinos domésticos foram soropositivos (Figura 4) no presente estudo. Destes, um animal era procedente do município de Belford Roxo, três a Duque de Caxias, 12 a Mesquita, 11 a Nova Iguaçu, 25 ao Rio de Janeiro e cinco a São João de Meriti. As frequências de animais soropositivos para a RIFI em relação ao total de animais proveniente de cada município e nas diferentes regiões estudadas estão representadas na Tabela 4. Figura 4. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para diagnóstico de E. canis, sendo (a) controle positivo; (b) controle negativo e (c) amostra positiva de felino doméstico da Região Metropolitana do Rio de Janeiro 20

38 Tabela 4. Frequência de felinos domésticos positivos pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Ehrlichia canis domiciliados nos municípios da região metropolitana do Rio de Janeiro e nas regiões Baixada fluminense e Rio de Janeiro. RIFI Região Município Positivos Negativos Total Belford Roxo 1 (12,5%) 7 (87,5%) 8 Duque de Caxias 3 (21,4%) 11 (78,6%) 14 Baixada Fluminenseª Mesquita 12 (34,3%) 23 (65,7%) 35 Nova Iguaçu 11 (28,2%) 28 (71,8%) 39 São João de Meriti 5 (23,8%) 16 (76,2%) (27,3%) 85 (72,7%) 117 Rio de Janeiroª Rio de Janeiro 25 (25,2%) 74 (74,8%) 99 ªValores seguidos de mesma letra não diferem significativamente através do teste Quiquadrado a 5% de significância (p<0,05). 4.3 Reação de amplificação para Ehrlichia sp. pela PCR baseadas no gene 16S rrna A detecção molecular de Ehrlichia sp. pela nested-pcr, baseada no gene 16s rrna, demonstrou a presença de bandas gênero-específicas em 37 (17,1%) gatos domésticos (Figura 5). A distribuição de animais positivos por município foi: a) Belford Roxo (n=2); b) Duque de Caxias (n=3); c) Mesquita (n=7); d) Nova Iguaçu (n=7); e) Rio de Janeiro (n=12); f) São João de Meriti (n=6). A frequência de positivos na nested-pcr em relação ao total de animais proveniente de cada município e nas diferentes regiões estudadas estão representadas na Tabela 5. PM pb Figura 5. Fotografia de eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros visualizados na foto são relativos à nested-pcr para Ehrlichia sp. obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores ECAN/HE3. Canaleta PM: peso molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen ); Canaleta 1: Controle negativo; Canaleta 2: 21

39 Controle positivo; demais Canaletas amostras de felinos domésticos da Região Metropolitana do Rio de Janeiro testadas, sendo as Canaletas 5 e 8 de animais positivos. Tabela 5. Frequência de felinos domésticos positivos pela nested-pcr para Ehrlichia sp. domiciliados nos municípios da região metropolitana do Rio de Janeiro e nas regiões Baixada fluminense e Rio de Janeiro. nested-pcr Região Município Positivos Negativos Total Belford Roxo 2 (25,0%) 6 (75,0%) 8 Duque de Caxias 3 (21,4%) 11 (78,6%) 14 Baixada Fluminenseª Mesquita 7 (20,0%) 28 (80,0%) 35 Nova Iguaçu 7 (19,9%) 32 (82,1%) 39 São João de Meriti 6 (28,6%) 15 (71,4%) (21,4%) 92 (78,6%) 117 Rio de Janeiroª Rio de Janeiro 12 (12,1%) 87 (87.9%) 99 ªValores seguidos de mesma letra não diferem significativamente através do teste Quiquadrado a 5% de significância (p<0,05). 4.4 Reações de amplificação para Anaplasma platys pela PCR em tempo Real baseada no gene glta e pela nested-pcr baseada no gene 16S rrna Apenas oito (3,7%) animais foram positivos na PCR em tempo real para A. platys. O valor médio de C T observado nos controles positivos foi de 22 ciclos e das amostras positivas de 34 ciclos (Figura 6). Do total de amostras positivas, uma amostra pertencia ao município de Belford Roxo, cinco pertenciam ao município do Rio de Janeiro e duas a São João de Meriti. As frequências de positivos na PCR em tempo real em relação ao total de animais proveniente de cada município e nas diferentes regiões estudadas estão representadas na Tabela 6. As amostras positivas na PCR em tempo real foram submetidas à nested-pcr para amplificação de um fragmento de 676 pares de base espécie-específico para A. platys. Dentre estes, apenas dois (0,9%) gatos foram positivos na nested-pcr (Figura 7). Estas amostras foram purificadas e submetidas ao sequenciamento para posterior caracterização. 22

40 Controles positivos Amostras positivas Figura 6. Curva de amplificação do gene glta de Anaplasma platys em gatos domésticos da Região Metropolitana do Rio de Janeiro obtidas pela PCR em tempo real utilizando o sistema TaqMan. As linhas vermelhas representam os controles positivos e as linhas azuis e rosa representam três amostras positivas. PM pb Figura 7. Fotografia de eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com Brometo de Etídeo. Os amplímeros visualizados na foto são relativos à nested-pcr para Anaplasma platys obtidos com os oligonucleotídeos iniciadores PLATYS e EHR16sR. Canaleta PM: peso molecular em escala de 100 pares de bases (Invitrogen ); Canaleta 1: Controle positivo; Canateta 2: Controle negativo; Canaleta 3: Gato 105 e Canaleta 4 : Gato

41 Tabela 6. Frequência de felinos domésticos positivos pela PCR em tempo real para Anaplasma platys domiciliados nos municípios da região metropolitana do Rio de Janeiro e nas regiões Baixada fluminense e Rio de Janeiro. PCR em tempo real Região Município Positivos Negativos Total Belford Roxo 1 (12,5%) 7 (87,5%) 8 Duque de Caxias 0 (0,0%) 14 (100,0%) 14 Baixada Fluminenseª Mesquita 0 (0,0%) 35(100,0%) 35 Nova Iguaçu 0 (0,0%) 39(100,0%) 39 São João de Meriti 2 (9,5%) 19 (90,5%) 21 3 (2,6%) 114 (97,4%) 117 Rio de Janeiroª Rio de Janeiro 5 (5,1%) 94 (94,9%) 99 ªValores seguidos de mesma letra não diferem significativamente através do teste Quiquadrado a 5% de significância (p<0,05). 4.5 PCR em Tempo Real para Anaplasma phagocytophilum baseado no gene msp2 Não foi observado animais positivos na PCR em tempo real para A. phagocytophilum utilizando a técnica TaqMan-PCR, sendo o valor médio de C T observado nos controles positivos de 19 ciclos, como demonstrado na Figura 8. Controles positivos Figura 8. Curva de amplificação do gene msp2 de Anaplasma phagocytophilum em gatos domésticos da Região Metropolitana do Rio de Janeiro obtidas pela PCR em tempo real utilizando o sistema TaqMan. A linha vermelha representa os controles positivos. 4.6 Associação entre os resultados obtidos no esfregaço sanguíneo, RIFI e Nested- PCR para Ehrlichia sp. Os resultados obtidos para as diversas técnicas de diagnóstico de Ehrlichia sp. utilizados no presente estudo estão representados na Tabela 7. Dentre os 216 animais avaliados no presente estudo, 5,6% (n=12) foram positivos para RIFI e nested-pcr, 3,7% (n=8) para nested-pcr e esfregaço sanguíneo, 1,9% (n=4) para RIFI e esfregaço sanguíneo e 24