ESTUDO COMPARATIVO DE MÉTODOS COPROLÓGICOS: TF TESTE, KATO-KATZ, HPJ, WILLIS E BAERMANN-MORAES.

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1 ESTUDO COMPARATIVO DE MÉTODOS COPROLÓGICOS: TF TESTE, KATO-KATZ, HPJ, WILLIS E BAERMANN-MORAES. Luciano Evangelista Moreira 1 *, Daniel de Azevedo Teixeira 1, RESUMO O diagnóstico laboratorial é uma das alternativas mais eficazes na determinação clínica de uma patologia. As parasitoses são amplamente distribuídas em países subdesenvolvidos e o exame coproparasitológico é a forma mais indicada para os diagnósticos destas enfermidades. A realização dos exames coproparasitológicos podem se apresentam por diversas técnicas como: de Baermann Moraes, Willis, Kato-Katz, HPJ. A técnica TF-Test procura agregar alta eficiência, simplicidade e praticidade no manuseio e baixo custo aliada a estes exames. Realizou-se então análise de fezes por diferentes técnicas Baermann Moraes, Willis, Kato-Katz, HPJ e TF- Test, as fezes foram coletadas na comunidade Quilombola Santa Cruz. Os resultados apresentados demonstraram maior eficiência à técnica TF-Test. A alta eficiência da técnica está associado ao fato desta técnica utilizar um número maior de amostras, limpeza do sedimento, sedimentação forçada por centrifugação e, principalmente por abranger diagnóstico de protozoários tão bem quanto os de helmintos. Palavras-chave: Diagnóstico laboratorial, TF-Test, Parasitologia ABSTRACT The laboratorial diagnosis is one of the alternatives most efficient in the clinical determination of a pathology. The parasatisms widely are distributed in underdeveloped countries and the coproparasitológico examination is the indicated form more for the disgnostic of these diseases. The accomplishment of the coproparasitológicos examinations can if they present for diverse techniques as: of Baermann Moraes, Willis, Kato-Katz, HPJ. The TF-Test technique looks for to add high efficiency, simplicity and praticidade in the manuscript and low allied cost to these examinations. Excrement analysis was become fullfilled then for different techniques Baermann Moraes, Willis, Kato-Katz, HPJ and TF-Test, the excrements had been collected in the community Quilombola Santa Cruz. The presented results had demonstrated to greater efficiency to the TF-Test technique. The high efficiency of the technique is associated with the fact of this technique to use a bigger number of samples, cleanness of the sediment, sedimentation forced for centrifugalization and, mainly for enclosing diagnosis of protozoários so well how much of helmintos Keywords: laboratorial diagnosis, TF-Test, Parasitology INTRODUÇÃO Mesmo diante da existência de inúmeros métodos quantitativos e qualitativos de diagnóstico coproparasitológico, muitos ainda recebem críticas por suas limitações, complexidade de técnica, baixa sensibilidade e alto custo de realização, restringindo sua utilização na rotina de laboratórios particulares, públicos e até em trabalhos de pesquisa acadêmica. Um diagnóstico parasitológico deve buscar de maneira apropriado uma alta 1 Professor Adjunto da UNIPAC-TO

2 sensibilidade e especificidade na visualização de estruturas parasitárias intestinais, uma vez que o tratamento específico do paciente fica dependente dessas condições. De acordo com Mendes et al. (2005), em laboratórios de rotina seria importante realizar mais de um método de diagnóstico para detectar as formas parasitárias de protozoários e helmintos, principalmente quando há baixa carga parasitária. Neste contexto fica explicito a necessidade de escolha de mais de um método em função de suspeitas clínicas específicas como, por exemplo, o de Baermann Moraes para larvas de Ancilostomídeos e Strongyloides e Willis para Ancilostomídeos, cistos e oocistos de protozoários (CERQUEIERA et al., 2009). Diante dessa demanda de uma melhor técnica de diagnóstico parasitológico, que possa atender tanto as necessidades dos laboratórios quanto das pesquisas acadêmicas, surgiu no mercado uma técnica de concentração por centrifugação chamada de TF-Test que procura agregar alta eficiência, simplicidade e praticidade no manuseio e baixo custo. Como o TF-teste é anunciado pelo fabricante (empresa Immunoassay Ind. Com. Ltda., São Paulo, Brasil) como uma técnica inovadora que utiliza a concentração e limpeza do material fecal através da centrifugação e dupla filtragem, far-se-á necessário qualificá-la frente a um estudo comparativo com as outras técnicas de diagnóstico parasitológico tradicionais. Assim sendo, a proposta deste trabalho é realizar a comparação da sensibilidade das técnicas tradicionais de diagnóstico parasitológico, Kato-Katz, HPJ, Willis e Baermann- Moraes, com a técnica de TF-Test. MATERIAIS E MÉTODOS O estudo compreendeu a comunidade Quilombola Santa Cruz, localizada na zona rural do município de Ouro Verde de Minas, nordeste de Minas Gerais, à 480 km de Belo Horizonte, cuja população é constituída por 308 indivíduos. Essa população foi selecionada para participar deste estudo comparativo por estar localizada numa região de alta prevalência de enteroparasitoses, principalmente a esquistossomose, e estar inserida no Programa de Controle de Esquistossomose PCE da FUNASA. Este estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Ouro Preto- CEP- UFOP (Parecer nº 2005/58), ao Comitê Nacional de Ética em

3 Pesquisa (CONEP), (Parecer nº 902/2006, Registro: 12827) como uma forma de qualificação da técnica TF-Test que seria usada pelo autor em sua dissertação de mestrado na Terra Indígena KRENAK. FUNAI (parecer nº 73/CGEP/06) Em Abril de 2007 foram distribuídos a todos moradores da comunidade em questão um frasco coletor universal e um kit TF-Test para a coleta de material fecal. As pessoas foram orientadas a coletar as fezes em três dias alternados para o kit TF-Test, sendo que, no último dia, a amostra das fezes também era acondicionada no coletor universal. Os recipientes foram devidamente lacrados, rotulados e recolhidos no sétimo dia após a sua distribuição. Posteriormente, as amostras foram transportadas em isopor para o Laboratório de Parasitologia da Faculdade Presidente Antônio Carlos de Teófilo Otoni, para realização do exame microscópico das amostras. O material fecal dos coletores universal foi utilizado para a realização das técnicas de Kato- Katz (n=270), HPJ (n=270), Willis (n=292) e Baermann-Moraes (n=271) de cada morador. Vale observar que o kit TF-Test contou com a adesão de 100% da população (n=308) do Quilombola Santa Cruz enquanto que 94,8% dos indivíduos (n=292) deste Quilombola acondicionaram as fezes no coletor universal (n=292). Entrementes, o material fecal coletado nos coletores universal não foi suficiente para análise de 292 amostras para todas as técnicas. Como os frascos que compõem o kit TF-Test são dotados de meio conservante que protege o material fecal para a análise até 30 dias, eles foram analisados após a realização do processamento das outras técnicas. Destaca-se que os laudos diagnósticos foram encaminhados para a Secretaria de Saúde de Ouro Verde de Minas a fim de ser providenciado o tratamento dos indivíduos que apresentaram resultado positivo neste estudo comparativo. A seguir são descritos os métodos operacionais seguidos para cada uma das técnicas utilizadas nesse estudo. Método de TF-Test Cada morador da comunidade Quilombola Santa Cruz (n=308) participou desta técnica com três amostras separadas e rotuladas que foram processadas conforme os procedimentos operacionais indicados pelo fabricante do Kit TF-Test : - Agitar o tubo coletor para homogeneização do material fecal coletado;

4 - Abrir o tubo coletor cuidadosamente, simulando o movimento de rosca, para não derramar o líquido; - Encaixar os tubos coletores na estante; - Acrescentar uma gota de detergente neutro e incolor em cada tubo coletor; - Acrescentar 3 ml de acetato de etila p. a. por tubo; - Vedar os tubos coletores inseridos na estante, agitando-os para homogeneizar o material, com o auxílio da régua homogeneizadora; - Encaixar os 3 tubos coletores no conjunto de filtros e centrifugação; - Colocar o conjunto processador na caçapa da centrífuga (100 ml - universal),com os tubos coletores virados para cima. - Centrifugar o sistema a 1500 rpm por 1 minuto; - Desencaixar cuidadosamente o tubo de centrifugação do conjunto processador, simulando rosca; - Descartar o sobrenadante em recipiente apropriado, segundo normas de biossegurança, inclinando cuidadosamente o tubo na horizontal; - Encaixar o tubo de centrifugação na estante; - Acrescentar ao sedimento cerca de 10 gotas de solução fisiológica; - Homogeneizar delicadamente; - Transportar de uma a três gotas do material homogeneizado para a lâmina de microscopia, utilizando canudo, pipeta Pasteur ou plástica descartável; - Acrescentar uma gota de lugol 2%; - Cobrir o material com lamínula; - Examinar o material preparado em microscópio com aumentos de 100 X e 400 X (empresa Immunoassay Ind. Com. Ltda., São Paulo, Brasil) Método de Kato-Katz O material fecal encaminhado nos coletores universal possibilitou a realização de 270 análises por meio da técnica de Kato-Katz que consiste em uma simplificação do método de Kato, introduzida por Katz e Col., e cuja padronização é descrita a seguir: Sobre uma pequena amostra de fezes colocada sobre papel absorvente deposita-se uma tela de nylon que comprimida com auxílio da espátula fará com que parte das fezes passe através de suas malhas. Estas são recolhidas com a espátula e comprimidas no orifício de

5 uma placa perfurada, que já deverá estar sobre uma lâmina, até que este se encontre cheio. Retirar o excesso de fezes com a lateral da espátula. Levantar a placa perfurada, inclinando, inicialmente, uma das extremidades e retirá-la de modo a permanecer sobre a lâmina de vidro um cilindro de amostra fecal. Sobre este cilindro é colocada uma lâmina de celofane, previamente embebida e solução de DIAFIX. A lâmina é em seguida invertida sobre uma superfície lisa e pressionada de modo a espalhar uniformemente o material entre a lâmina e a lamínula evitando o extravasamento das fezes. Aguarda-se 30 minutos para clarificação do esfregaço fecal e examina-se ao microscópio em objetivas de 10 X e 40 X (KATZ,1972). Método de HPJ (HOFFMAN; PONS; JANER) Foram realizados 270 exames parasitológicos por meio da técnica de Hoffman, Pons e Janer (HPJ) que é conhecida no Brasil como Lutz. Foi seguido o seguinte procedimento: Foi retirado do material fecal de 2 a 4 g, homogeneizadas com água e passadas para um cálice de sedimentação de 100 ml, através de uma gaze dobrada em quatro partes, e seu volume completado com água de torneira. Esta suspensão foi deixada em repouso para que ocorresse uma sedimentação espontânea das estruturas parasitárias e só então, depois de passado 4 a 6 horas, foi examinada ao microscópio em objetivas de 10 X e 40 X (REY, 2002). Método de Willis Todos os moradores que entregaram seu material fecal nos coletores universal (n=292) foram contemplados com a realização do exame parasitológico por meio da técnica de flutuação de Willis que segue a seguinte padronização: Colocar 10g de fezes num frasco de borrel, diluir as mesmas em solução saturada de cloreto de sódio completar o volume até a borda do frasco, colocar na boca do frasco uma lâmina, que deverá estar em contato com o líquido, deixar em repouso por 5 minutos, retirar rapidamente a lâmina voltando para cima a parte molhada, cobrir com lamínula, levar ao microscópio e examinar com objetiva de 10 X e/ou 40 X (pode-se corar pelo lugol) (REY, 2002). Método de Baermann-Moraes O procedimento operacional descrito abaixo foi realizado para 271 amostras.

6 Colocar 8 a 10 g de fezes em um parasitofiltro sobre um funil de vidro, contendo um tubo de borracha conectado à extremidade inferior de sua harte, obliterar o tubo de borracha com uma pinça de Hoffmann e adicionar ao funil, água aquecida (45 C) em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes. Deixar 1 hora em repouso, findo esse tempo, colher 5 a 7 ml da água, em um tubo de centrífuga, abrindo-se a pinça, centrifugar a rpm por 1 minuto, coletar o sedimento e examinar ao microscópio em objetivas de 10 X e 40 X (REY,2002). RESULTADOS E DISCUSSÃO A adesão da comunidade Quilombola ao experimento pela técnica de TF-Test chegou à totalidade (n=308) por si tratar de uma novidade para a comunidade que estava acostumada a fazer a coleta de material fecal em um recipiente pequeno distribuído pela FUNASA em seu Programa de Controle da Esquistossomose (PCE). Inclusive esse recipiente fora utilizado na pesquisa para coleta do material para as demais técnicas por 292 indivíduos sendo que somente em 270 frascos o material fecal era suficiente para fazer todas as técnicas. Os resultados do estudo comparativo da taxa de positividade de acordo com o método parasitológico, realizado no Quilombola Santa Cruz, localizado no município de Ouro Verde de Minas, são apresentados na Tabela 1. Tabela 1- Estudo comparativo da taxa de positividade de acordo com o método parasitológico, Quilombola Santa Cruz, Ouro Verde de Minas, (Minas Gerais, 2007). Teste parasitológico TF- Test Kato- Katz HPJ Willis Baermann- Moraes Tamanho da amostra 30 % 27 % 27 % 29 % 271 % Entamoeba 19 6, ,9 2 0, 3 1,1 histolitica dispar 7 Entamoeba coli 57 18, , 4 1, 25 9,2

7 5 8 4 Iodamoeba buschlii , ,6 3 1, 11 4,1 Endolimax nana , ,7 2 0, 4 1,5 Giardia lamblia 7 Taenia sp 1 0, Hymenolepis nana , 72 26, 31 11, 1 0, 10 3,7 Schistosoma mansoni ,1 18 6,7 18 6,7 6 2, 15 5,5 Ascaris lumbricoides ,8 3 1,1 13 4,8 8 2, 5 1,9 Ancilostomídeos , ,8 1 0, 14 5,2 Strongyloides stercoralis 3 Trichuris trichiura 1 0, ,7 1 0,4 1 0,4 3 1, - - Enterobius vermicularis 0 Total , , , , ,2 A técnica TF-Test foi o método que apresentou o maior percentual de positividade para todos os parasitos, com exceção para o Schistosoma mansoni que foi superado pelo teste Kato-Katz, com uma diferença de 3,6%. Porém, os pacientes que apresentaram resultados positivos no TF-Test para o Schistosoma mansoni (n=71) estavam inseridos nos resultados positivos para o mesmo parasito pela técnica de Kato-Katz (n=72). A diferença de positividade observada para o Strongyloides stercoralis pelo método HPJ (0,2%) e Baermann-Moraes (0,6%) não é significativa. O Kato-Katz, técnica muito utilizada pela Fundação Nacional de Saúde - FUNASA no Programa de Controle de Esquistossomose, apesar de mais sensível, não é indicada para a

8 detecção de larvas de helmintos e protozoários intestinais (REY, 2002). Chaves (1979), em um estudo comparativo de métodos coprológicos, observou que o Kato-Katz apresentou sensibilidade (positividade) 2 a 4 vezes superior aos métodos de Lutz e Faust modificado para diagnóstico de ancilostomídeo, Trichuris trichiura e Schistosoma mansoni, sendo equivalente ao Lutz no diagnóstico de Ascaris lumbricoides. O TF-Test, além de detectar os protozoários, apresentou neste estudo uma positividade para outros parasitos muito superior do que aqueles identificados pelo método Kato-Katz. Por sua vez, o HPJ, que é uma técnica muito utilizada em laboratórios de análises clínicas por abranger o diagnóstico de protozoários e helmintos, apresentou resultados de positividade inferior para todos os parasitos quando comparado com o método TF-Test. Vale destacar que o HPJ tem a desvantagem de apresentar grande quantidade de detritos fecais no sedimento final a ser analisado. Estes detritos decorrem do procedimento técnico de filtragem, o que dificulta com frequência a visualização de parasitos na lâmina, podendo fornecer resultados falso-negativos para o diagnóstico de protozoários intestinais (DE CARLI, 2001; GARCIA, 2001). A técnica de Willis é a mais indicada para diagnóstico de estruturas leves, como cistos de protozoários e ovos de ancilostomídeos (REY, 2002). Entretanto, no estudo comparativo entre as técnicas, os casos positivos apresentados pelo método TF-Test foram superiores aos da técnica de Willis em relação a todos os protozoários e helmintos que foram diagnosticados. Cerqueira (2009), em um estudo comparativo não encontrou diferença significativa de positividade entres as técnicas HPJ (59,28%) e Willis (51,55%). Por último, a técnica Baermann-Moraes, que é a mais indicada no diagnóstico de larvas de Strongyloides stercoralis em função do tropismo das larvas por água tépida (REY, 2002), apresentou uma sensibilidade um pouco maior que a do TF-Test, porém esta diferença não foi significativa, não justificando o seu uso em função da sua baixa positividade em relação aos demais parasitos. CONCLUSÃO

9 Os dados obtidos demonstram que a técnica de TF-Test é de fato melhor que as técnicas convencionais utilizadas (Kato-Katz, HPJ, Willis e Baermann-Moraes), por apresentar positividades de diagnóstico maiores que as técnicas convencionais. Esta supremacia está relacionada ao fato desta técnica utilizar um número maior de amostras, limpeza do sedimento, sedimentação forçada por centrifugação e, principalmente por abranger diagnóstico de protozoários tão bem quanto os de helmintos. A alta sensibilidade e os aspectos práticos demonstram que a técnica de TF-Test é apropriada para diagnóstico individual e inquéritos populacionais. REFERÊNCIAS CERQUEIRA et al, ANALISE COMPARATIVA DA SENSIBILIDADE DA TÉCNICA DE WILLIS, NO DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO DA ANCILOSTOMIASE, REV. DIALOGO E CIÊNCIA, DISPONÍVEL EM:dialogos.ftc.br/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid=86&Itemid =15, ACESSADO EM 25 DE FEVEREIRO DE CHAVES, Adelú; ALCANTARA, Olinda Siqueira de; CARVALHO, Omar dos Santos and SANTOS, José Soares dos. Estudo comparativo dos métodos coprológicos de Lutz, Kato- Katz e Faust modificado. Rev. Saúde Pública [online]. 1979, v. 13, n. 4, pp ISSN doi: /S DE CARLI, G.A. - Parasitologia Clínica - Seleção de Métodos e Técnicas de Laboratório para o Diagnóstico das Parasitoses Humanas. 2a ed. São Paulo, Editora Atheneu, GARCIA, L.C. - Diagnostic Medical Parasitology. 4th edition, A.S.M. Press, Washington D.C., U.S.A., HOFFMAN, W. A. et al. The sedimentation-concentration method in schistosomiasis mansoni. Puerto Rico J. publ. Hlth trop. Med., 9:283-98, KATO, K. & MIURA, M. Comparative examinations. Jap. J. Parasit., 3:35, KATZ, N. et al. A simple device for quantitative stool thick-smear technique in schistosomiasis mansoni. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 14: , REY, L. - Bases da Parasitologia Médica. Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro (RJ), 2002.