AVALIAÇÃO DE INTERFERENTES NA DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINAS EM SOJA (Glycine Max L.)

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1 AVALIAÇÃO DE INTERFERENTES NA DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINAS EM SOJA (Glycine Max L.) B. Silva 1, E. Badiale-Furlong 2 1-Departamento de Ciências dos Alimentos Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias CEP: Florianópolis SC Brasil, Telefone: (48) e- mail: (bibianaengenheira@hotmail.com) 2- Escola de Química e Alimentos Universidade Federal do Rio Grande, Campus Carreiros CEP: Rio Grande RS Brasil. RESUMO A determinação de contaminantes em matrizes complexas como a soja geralmente requer muitas etapas analíticas e o método de QuEChERS é uma alternativa rápida e simples. A validação do método de QuEChERS para determinação de aflatoxinas em soja apontou presença de efeito da matriz. A Análise de Componentes Principais mostrou interferência de carboidratos na determinação de AFB 1, e de proteínas na determinação de AFB 2, AFG 1 e AFG 2. O método de QuEChERS padronizado para redução do efeito matriz pode ser usado com confiabilidade para determinar AFB 1 em soja, por apresentar melhor percentual de recuperação (109%), baixa variabilidade (6,1%) e efeito de matriz aceitável. ABSTRACT Determination of contaminants in complex matrices such as soybean usually requires many analytical steps and the QuEChERS method is a quick and simple alternative. The validation of the QuEChERS method for determination of aflatoxins in soybean showed the presence of matrix effect. Principal Component Analysis showed carbohydrate interference in the determination of AFB 1, and proteins interference in the determination of AFB 2, AFG 1 and AFG 2. The QuEChERS method, after standardized to reduce the matrix effect can be reliably used to determine AFB 1 because presented better percentage of recovery (109%), low variability (6.1%) and acceptable matrix effect. PALAVRAS-CHAVE: aflatoxina B 1; QuEChERS; Análise de componentes principais; efeito de matriz. KEYWORDS: aflatoxin B 1; QuEChERS; Principal Components Analysis; matrix effect. 1. INTRODUÇÃO As aflatoxinas são metabólitos fúngicos do gênero Aspergillus, produzidos sob condições de estresse. Quatro aflatoxinas são produzidas naturalmente por Aspergillus, chamadas B 1, B 2, G 1 e G 2, sendo a primeira a mais frequente em alimentos. A aflatoxina B 1 (AFB 1) também é considerada a mais potente carcinogênica ao fígado humano e animal (ARROYO-MANZANARES et al., 2015). Em culturas como amendoim e milho, a invasão de Aspergillus flavus ocorre antes da colheita, resultando em níveis de aflatoxinas que estão acima dos limites legislados para este contaminante e consequentemente dificuldade em eliminá-la desses produtos. Devido a isso, essas culturas são as mais exploradas pela presença de aflatoxinas. O A. flavus não tem o mesmo comportamento em outras

2 culturas, por isso a ocorrência em culturas específicas como soja pode ser subestimada em relação a outras como o amendoim e o milho, por exemplo (COTTY; JAIME-GARCIA, 2007). A União Europeia (nº 165/2010) (COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES, 2010) estabelece o limite máximo de 2 μg de Kg -1 de aflatoxinas em cereais e produtos de cereais. Este regulamento não inclui a soja e, no Brasil, a legislação estabelece limites de 5 μg de Kg -1, apenas para cereais em geral e leguminosas como o feijão e amendoim, mas não para a soja (ANVISA, 2011). Esta pode ser uma decorrência da pouca exploração da possibilidade de ocorrência destas micotoxinas neste grão. A determinação desses contaminantes traços em matrizes complexas, como a soja, geralmente requer etapas extensas de extração, limpeza e concentração antes da identificação (ANASTASSIADES et al., 2003). Atualmente, os principais objetivos dos procedimentos analíticos são a miniaturização, automação e simplificação das etapas analíticas. Atendendo a esta demanda o método QuEChERS vem sendo utilizado para a extração de aflatoxinas em algumas matrizes de alimentos, porém não foi explorado para a soja (KOESUKWIWAT; SANGUANKAEW; LEEPIPATPIBOON, 2014; SIRHAN; TAN; WONG, 2011). Cabe salientar que qualquer método de extração, especialmente de compostos da ordem de traço, pode ser afetado pelos componentes da matriz avaliada. Eles podem contribuir positivamente ou negativamente para a recuperação, por exemplo, das aflatoxinas, pois podem representar efeito supressivo na fluorescência do analito. Assim, o objetivo deste trabalho é avaliar a interferência dos componentes da soja na determinação de aflatoxinas pelo método de QuEChERS. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Extração de aflatoxinas Em tubo de centrífuga, 10 g de amostra foram adicionados de 20 ml de água e 20 ml de acetonitrila acidificada com 1% de ácido acético. A mistura foi homogeneizada em agitador orbital durante 20 minutos a 200 rpm seguido por adição de 4 g de MgSO 4 e 1 g de NaCl e agitação em vórtex durante 2 min. O extrato foi centrifugado por 10 min a 9070 g e 10 C. Para limpeza, 0,3 g de MgSO 4 e 0,2 de terra diatomácea foram adicionados a 10 ml de sobrenadante e agitados em vórtex durante 30 s. Após centrifugação durante 5 min a 9070 g e 10 C, 3 ml de sobrenadante foram secos a 65 C (ANASTASSIADES et al., 2003; HACKBART et al., 2014). 2.2 Condições cromatográficas Foi utilizado cromatógrafo líquido e detector de fluorescência Shimadzu (CTO-20AC, Quioto, Japão) com excitação a 362 nm e emissão a 440 nm, de acordo com o método de Calori-Domingues et al. (2010) modificado. O cromatógrafo foi acoplado a uma unidade de derivação fotoquímica póscoluna (Romer Labs, Campinas, Brasil) para conferir maior sensibilidade à determinação de AFB 1 e AFG 1 pela irradiação de luz UV a 254 nm. Foi utilizada uma coluna cromatográfica Kromasil C18 (5 μm, 15 cm x 4,6 mm). A fase móvel foi composta por água ultrapura, metanol e acetonitrila na razão 60:25:15 (v/v/v) com fluxo de 1 ml min -1, temperatura da coluna de 40 C e 15 min de eluição. Antes da injeção, os extratos foram centrifugados a 1400 g e filtrados através de membrana de nylon 45 μm (Sartorius, Göttingen, Alemanha). 2.3 Validação de método O limite de detecção (LOD) instrumental foi determinado pela injeção de soluções de aflatoxinas em concentrações decrescentes, considerando a proporção de 3:1 entre a área do pico do analito e o ruído da linha de base. O limite de quantificação (LOQ) instrumental foi estimado pela área de pico de

3 analito com proporção de 10:1. O LOD e LOQ do método de extração foram estimados considerando o procedimento de preparação da amostra (BRUCE; MINKKINEN; RIEKKOLA, 1998). A linearidade foi avaliada pela preparação da curva de calibração com padrões de aflatoxinas dissolvidos em água ultrapura:acetonitrila (9:1) e injetados no sistema HPLC-FL em triplicata, cuja relação com a área promoveu a estimativa da faixa de linearidade e coeficiente de determinação. O primeiro ponto da curva foi a concentração correspondente ao LOQ para garantir a confiabilidade das estimativas a partir da curva padrão (EURACHEM, 2014). O efeito de matriz foi avaliado pela preparação de curva de padrões das aflatoxinas em extrato de soja, nas mesmas concentrações das curvas no solvente, e medido de acordo com a Equação 1 (MATUSZEWSKI; CONSTANZER; CHAVEZ-ENG, 2003): Eq.1 onde Af é a área da amostra fortificada e A p é a área do padrão. A exatidão foi avaliada pela recuperação aparente das aflatoxinas a partir de amostras em branco e fortificadas em três níveis de concentração correspondentes a 3, 5 e 8 vezes o valor do LOQ, em triplicata. A repetibilidade foi verificada por três determinações sucessivas em triplicata de cada nível utilizado para estimar a recuperação de aflatoxinas e os resultados foram expressos como coeficiente de variação (CV) entre as nove réplicas (INMETRO, 2007). 2.4 Análise estatística Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Análise de Componentes Principais (ACP) e correlações de Pearson foram executadas com o software Past (folk.uio.no/ohammer/past), para acessar as correlações entre os componentes da soja e a recuperação de aflatoxinas. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO O método de QuEChERS é conduzido em duas etapas: extração e limpeza. A primeira, uma extração líquido-líquido seguida de partição por salting-out e a segunda, uma etapa de extração em fase sólida dispersiva (do inglês d-spe: dispersive solid-phase extraction). Dentre os fatores que afetam o método de QuEChERS estão a composição da amostra, e a avaliação do seu efeito na confiabilidade do método pode ser feita considerando a recuperação (ANASTASSIADES et al., 2003). Na Tabela 1 estão apresentados os parâmetros de validação do método aplicado a determinação de aflatoxinas em matriz de soja. Os coeficientes de determinação foram considerados adequados, pois se encontram próximos aos recomendados pelo Inmetro (2010) de no mínimo 0,99. As curvas de matriz possuem ampla faixa de linearidade, compreendendo desde concentrações baixas (0,1 ng ml -1 ) até aquelas acima do máximo permitido pela legislação brasileira para aflatoxinas em alimentos (15 ng ml -1 ), com exceção da AFG 1 que apresenta detecção menos sensível dentre as demais. Como aflatoxinas são compostos traços e a soja é um grão com teores de carboidratos e proteínas em torno de 30 a 40% e lipídeos em torno de 20 a 30%, foi avaliado o efeito de matriz para verificar a influência destes compostos na recuperação delas pela etapa de limpeza de extratos. A porcentagem de efeito de matriz indicou influência de componentes da soja na determinação das aflatoxinas analisadas, com supressão do sinal para AFB 1, AFB 2 e AFG 2 (efeito de matriz < 100%) e intensificação de sinal para AFG 1 (efeito de matriz > 100%). Para corrigir esse efeito, as recuperações foram estimadas com as curvas reproduzidas na matriz (Tabela 1).

4 A recuperação foi satisfatória nos três níveis apenas para AFB 1, enquanto a curva de matriz mostrou superestimação das concentrações de AFG 2 e AFB 2. A determinação de AFG 1 mostrou pouca seletividade, pois a porcentagem de efeito de matriz indica intensificação de sinal e a porcentagem de recuperação indica interferência negativa da matriz. A avaliação do efeito da matriz é importante na verificação de componentes traços e no caso da soja, a hipótese é de que a grande quantidade de macro componentes pode afetar o processo de extração das aflatoxinas, como pode ser verificado pelos percentuais de recuperação. Tabela 1. Parâmetros de validação do método de determinação de aflatoxinas em soja. AFB 1 AFB 2 AFG 1 AFG 2 Tempo de retenção 6,6 7,8 8,7 10,5 Faixa de linearidade (ng ml -1 ) 0,1 8,0 0,1 8,0 5,0 15,0 0,1 15,0 Coeficiente angular Coeficiente linear R 2a 0,9852 0,9889 0,8236 0,9894 LODi b (ng ml -1 ) 0,05 0,03 0,10 0,05 LOQi c (ng ml -1 ) 0,10 0,07 0,30 0,10 LOD d (ng g -1 ) 0,03 0,02 0,06 0,03 LOQ e (ng g -1 ) 0,06 0,05 0,20 0,06 Efeito de matriz (%) 44 a a a a 109 Recuperação f (%) 109,0 (6,1) 132,8 (2,5) 80,1 (12,2) 144,4 (9,5) a Coeficiente de determinação da equação da curva de matriz; b LOD do instrumento; c LOQ do instrumento; d LOD do método; e LOQ do método; f Média de nove réplicas mais coeficiente de variação. Para estimar quais componentes da matriz exerceram maior efeito na recuperação de aflatoxinas, foi realizada a Análise de Componentes Principais (ACP) conforme apresentado na Figura 1, correlacionando a composição de carboidratos, lipídeos e proteínas com o percentual de recuperação da amostra de soja (Tabela 1). A ACP permite a geração de novas variáveis, denominadas componentes principais, para explicar a variabilidade dos resultados, além de evidenciar a influência entre as diferentes variáveis estudadas, através da correlação de Pearson (R). A amostra de soja utilizada, denominada Vtop, cultivada no estado do Rio Grande do Sul apresentou teores de carboidratos de 30%, lipídeos 28% e proteínas 37%. A componente 1 (PC 1) da ACP explicou 89,1% da variabilidade dos resultados e a componente 2 (PC 2), 10,4%. Foram calculadas as correlações de Pearson, e o percentual de proteínas apresentou alta correlação negativa com a recuperação de AFB 2 (R = - 0,96), AFG 1 (R = - 0,97) e AFG 2 (R = - 0,98), o que indica que a mistura de sais e adsorventes utilizada na etapa de limpeza não promoveu a precipitação das proteínas, aumentando os efeitos desse interferente na recuperação destas aflatoxinas. A recuperação de AFB 1 apresentou correlação negativa com o percentual de carboidratos (R = - 0,98), como pode ser visto pelo gráfico da ACP em que estas variáveis se encontram em quadrantes opostos, indicando que quanto maior o teor de carboidratos, menor é o percentual de recuperação. Segundo Anastassiades et al. (2003) quanto maior a quantidade de NaCl utilizada na etapa de partição do método de QuEChERS, menos compostos polares são co-extraídos, como por exemplo açucares, proteínas e ácidos orgânicos. Os resultados da ACP indicaram que maiores quantidades de NaCl devem ser utilizadas, para remover com mais eficácia interferentes polares na recuperação de aflatoxinas, mas considerando a elevada concentração de proteínas na soja isto não pôde ser minimizado neste estudo.

5 O gráfico da ACP mostra relação inversa, com correlações altas e negativas entre os percentuais de recuperação da AFB 1 (percentual de 109%) e as demais aflatoxinas; AFB 2 (R = - 0,89), AFG 1 (R = - 0,89) e AFG 2 (R = - 0,92). Baseado no percentual seguro de recuperação obtido pela validação do método de QuEChERS, apenas a determinação de AFB 1 pode ser realizada com confiabilidade em amostras de soja. Figura 1. Efeito de componentes da matriz na recuperação de aflatoxinas em soja. 4. CONCLUSÃO O método de QuEChERS pode ser usado para determinar AFB 1 por ser um método simples e rápido, apresentando percentual de recuperação de 109% e limite de quantificação de 0,06 ng g -1. A ACP permitiu elucidar as interferências principais (carboidratos e proteínas) na determinação da aflatoxinas pelo método QuEChERS em amostras de soja. Conhecendo os interferentes da soja na determinação de aflatoxinas pelo método de QuEChERS, torna-se possível modificá-lo futuramente para extrair as demais aflatoxinas com maior confiabilidade nesta matriz. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Anastassiades, M.; Lehotay, S. J. (2003). Fast and Easy Multiresidue Method Employing Acetonitrile. Journal of AOAC International, v. 86, n. 2, p Anvisa. Resolução RDC N 7, de 18 de fevereiro de Limites máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos. Diário Oficial da União Seção 1. Disponível em:

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