FACULDADE SUDOESTE PAULISTA INSTITUIÇÃO CHADDAD DE ENSINO S/C LTDA CURSO DE BIOMEDICINA CAMILA RAFAELA SIQUEIRA

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1 FACULDADE SUDOESTE PAULISTA INSTITUIÇÃO CHADDAD DE ENSINO S/C LTDA CURSO DE BIOMEDICINA CAMILA RAFAELA SIQUEIRA INFECÇÃO GENITAL CAUSADA PELA BACTÉRIA Chlamydia trachomatis E O DIAGNÓSTICO LABORATORIAL ITAPETININGA SP 2017

2 CAMILA RAFAELA SIQUEIRA INFECÇÃO GENITAL CAUSADA PELA BACTÉRIA Chlamydia trachomatis E O DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Trabalho de conclusão de curso apresentado à Faculdade Sudoeste Paulista de Itapetininga FSP - ao curso de graduação em Biomedicina como requisito parcial para obtenção do título de bacharel em Biomedicina. Orientador: Prof. Dr. Messias Miranda Junior. ITAPETININGA SP 2017

3 CAMILA RAFAELA SIQUEIRA INFECÇÃO GENITAL CAUSADA PELA BACTÉRIA Chlamydia trachomatis E O DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Trabalho de conclusão de curso apresentado à Faculdade Sudoeste Paulista de Itapetininga FSP ao curso de graduação em Biomedicina como requisito parcial para obtenção do título de bacharel. Orientador: Prof. Dr. Messias Miranda Junior. BANCA EXAMINADORA Prof. Orientador: Dr. Messias Miranda Junior Prof. Dr. Thiago de Souza Candido Prof. Dra. Aline Netto Itapetininga, de de 2017.

4 A minha mãe, por sempre estar ao meu lado me dando toda força e apoio que precisei ao longo dessa caminhada.

5 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus e minha mãezinha Nossa Senhora Aparecida, por sempre estarem ao meu lado me guiando, protegendo, dando sabedoria e paz ao longo deste percurso. Agradeço também aos meus pais, em especial minha mãe, e minha avó Maria, que nunca me deixaram desistir, prestando todo apoio necessário, sempre me incentivando e me dizendo que tudo iria dar certo, obrigado por confiarem em mim! Aos meus amigos e colegas de sala, pelo companheirismo ao longo desses anos. Aos meus Mestres, que com toda paciência e sabedoria transmitirão conhecimento, experiência, amor e carinho durante esta jornada, vocês são demais! Em especial ao coordenador, professor, orientador e acima de tudo amigo, Messias Miranda Junior, obrigada por nos mostrar o que realmente é a Biomedicina e nos fazermos sentir apaixonados cada vez mais por ela, são profissionais como você que nos inspiram todos os dias para irmos à busca daquilo que almejamos, mostrando que no final, tudo dá certo. Obrigada!

6 SIQUEIRA, Camila Rafaela. Infecção genital causada pela bactéria Chlamydia trachomatis e o diagnóstico laboratorial. 37 f. Monografia Faculdade Sudoeste Paulista, Itapetininga, RESUMO A infecção sexualmente transmissível (IST) causada pela bactéria Chlamydia trachomatis está se tornando cada vez mais prevalente em todo mundo, estima-se que cerca de 89 milhões de novos casos são detectados ao ano, tornando-se um problema de saúde pública devido ser uma patologia na maioria das vezes assintomática, e quando apresenta sintomas os mesmos são vagos e inespecíficos podendo ser confundidos com outras ISTs. Caso o diagnóstico não seja feito precocemente esta infecção poderá acarretar sérios danos na vida reprodutiva da mulher, como a infertilidade. Dentre as técnicas de diagnóstico laboratorial destacam-se a imunofluorescência direta, imunofluorescência indireta e a reação em cadeira da polimerase (PCR), sendo esta, a mais indicada devido a sua alta sensibilidade e especificidade quando comparada a outros testes. Atualmente, a infecção genital clamidiana não está entre as ISTs de notificação compulsória no Brasil, ao contrário dos Estados Unidos, onde é recomendado que a patologia seja rastreada anualmente em todas as mulheres sexualmente ativas com idade inferior a 35 anos, homens penitenciários com idade inferior a 30 anos e gestantes. Em 2014, segundo o Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) cerca de casos de infecção por Chlamydia trachomatis foram notificadas, sendo a maioria destes casos entre jovens de 15 a 24 anos de idade. Devido ao alto número de casos desta infecção em todo o mundo, e das sequelas geradas principalmente para o sistema reprodutor feminino, o diagnóstico laboratorial é importante quando realizado precocemente, para que então o tratamento adequado seja feito, evitando que a infecção se dissemine. O objetivo do presente trabalho é discorrer sobre as principais técnicas de diagnóstico laboratorial da infecção genital causada pela Chlamydia trachomatis. Palavras-chave: Chlamydia trachomatis. Infecção genital causada pela Chlamydia. DST. Diagnóstico da infecção clamidiana. Prevalência Chlamydia trachomatis.

7 SIQUEIRA, Camila Rafaela. Genital infection caused by the bacterium Chlamydia trachomatis and laboratory diagnosis. 37 f. Monography - Faculdade Sudoeste Paulista, Itapetininga, ABSTRACT The sexually transmitted infection (IST) caused by the bacterium Chlamydia trachomatis is becoming increasingly prevalent worldwide, an estimated 89 million new cases are detected per year, becoming a public health problem because it is a pathology most often asymptomatic, and when it presents symptoms they are vague and nonspecific and can be confused with other STIs. If the diagnosis is not made early this infection can cause serious damage to the reproductive life of the woman, such as infertility. Among the laboratory diagnostic techniques, direct immunofluorescence, indirect immunofluorescence and polymerase chain reaction (PCR) are the most indicated because of their high sensitivity and specificity when compared to other tests. Currently, chlamydial genital infection is not among the compulsory reporting ISTs in Brazil, unlike the United States, where it is recommended that the condition be screened annually in all sexually active women under the age of 35, penitentiary men below the age of 18 to 30 years and pregnant women. In 2014, according to the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), approximately 948,102 cases of Chlamydia trachomatis infection have been reported, the majority of these cases being among young people 15 to 24 years of age. Due to the high number of cases of this infection worldwide, and the sequelae generated mainly for the female reproductive system, the laboratory diagnosis is important when performed early, so that appropriate treatment is done, preventing the infection from spreading. The objective of the present work is to discuss the main techniques of laboratory diagnosis of genital infection caused by Chlamydia trachomatis. Key words: Chlamydia trachomatis. Genital infection caused by Chlamydia. DST. Diagnosis of chlamydial infection. Prevalence Chlamydia trachomatis.

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Ciclo de desenvolvimento da Chlamydia trachomatis Figura 2 - Cervicite causada por Chlamydia trachomatis em mulher Figura 3 - Uretrite não gonocócica causada por Chlamydia trachomatis em homem19 Figura 4 - Infecção genital feminina pela Chlamydia trachomatis Figura 5 - Detecção da infecção por Chlamydia trachomatis classificada por sexo e idade a cada indivíduos na Inglaterra no ano de Figura 6 - Detecção da infecção por Chlamydia trachomatis classificada por sexo e idade a cada indivíduos na Austrália no de Figura 7 - Taxas de casos notificados ao CDC de infecção por Chlamydia trachomatis classificado por sexo e idade nos Estados Unidos no ano de Figura 8 - Reação positiva de imunofluorescência direta Figura 9 - Reação negativa de imunofluorescência direta Figura 10 - Técnica de imunofluorescência indireta Figura 11 - Resultado positivo para pesquisa de anticorpos anti-chlamydia Figura 12 - Representação de um ciclo de PCR Figura 13 - Amostras 2,3 e 4 positivas para Chlamydia trachomatis em eletroforese em gel de agarose Figura 14 - Amostras negativas para Chlamydia trachomatis em eletroforese em gel de agarose... 33

9 LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Sorotipos da Chlamydia trachomatis e patologias causadas Quadro 2 - Critérios para leitura e interpretação de resultados

10 LISTA DE SIGLAS IST Infecção sexualmente transmissível OMS Organização Mundial da Saúde DIP Doença inflamatória pélvica MOMP- Proteína principal da membrana externa CE Corpúsculo elementar CR Corpúsculo reticulado CDC Centro de Controle e Prevenção de Doenças PCR Reação em cadeia da polimerase DST Doença sexualmente transmissível

11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO DESENVOLVIMENTO Chlamydia trachomatis Ciclo de desenvolvimento Patogenicidade bacteriana Manifestações clínicas Prevalência Diagnóstico laboratorial Coleta e transporte Cultura celular Imunofluorescência direta Imunofluorescência indireta Reação em cadeia da polimerase PCR Tratamento CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 36

12 12 1 INTRODUÇÃO As Infecções Sexualmente Transmissíveis (ISTs) estão entre um dos problemas de Saúde Pública de suma importância em todo o mundo. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de 340 milhões de novos casos são detectados ao ano. Sua transmissão se dá por meio das relações sexuais sem preservativo, contato direto com sangue contaminado e por transmissão vertical (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). Há mais de 40 tipos de patógenos que são transmitidos através de relação sexual, estes incluem a Chlamydia trachomatis (Clamídia), Neisseria gonorrhoeae (Gonorréia), Vírus da Hepatite B (VHB), Vírus da Hepatite C (VHC), Treponema pallidum (Sífilis), Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), entre outros (FREITAS, 2007). Atualmente, os esforços para o controle das ISTs tem se voltado para o diagnóstico e tratamento no âmbito clínico, porém para se obter maiores resultados faz-se necessário a implementação de atividades preventivas, diagnóstico e tratamento o mais precocemente possível, tornando-se prioridade quando falamos de agravos em saúde pública (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). Desde a década de 80, a infecção por Chlamydia trachomatis, uma bactéria gram-negativa, é considerada uma das ISTs mais frequentes em países desenvolvidos e países em desenvolvimento, acometendo homens e mulheres, e tornando-se uma preocupação para o serviço de saúde pública devido ao seu difícil diagnóstico. Uma vez que é uma infecção silenciosa acomete cerca de 70% a 80% das mulheres portadoras de infecções genitais assintomáticas, o que acarreta sequelas graves em longo prazo, podendo levar a mulher à esterelidade (FREITAS, 2007). Quando sintomática, os sinais são vagos e inespecíficos, podendo levar ao corrimento vaginal mucopurulento, cervicite, uretrite, doença inflamatória pélvica (DIP) e sangramentos após relações sexuais, assemelhando-se a outras infecções vaginais, o que dificulta ainda mais o diagnóstico (MURRAY, 2010). Nos homens, a Chlamydia trachomatis é a causa mais comum de uretrite não gonocócica, porém, quando a infecção é assintomática, os mesmos servem como reservatório da doença, disseminando-a. Diferente das mulheres, os homens raramente sofrem problemas de saúde a longo prazo (APPROBATO, 2012). Outra população acometida são as gestantes, que podem apresentar a endocervicite clamidiana, podendo causar diversos problemas como: parto precoce, morte neonatal, DIP pós

13 13 parto, além de transmissão vertical, sendo a causa mais frequente de conjuntivite de inclusão que se desenvolve até duas semanas após o nascimento, e que se não tratada pode causar pneumonia no recém nascido (LIMA, 2015). Estima-se que 89 milhões de novos casos de infecções clamidianas são detectados anualmente em todo o mundo, sendo de maior prevalência em adultos jovens e sexualmente ativos (FREITAS, 2007). Nos Estados Unidos, o rastreio anual para está patologia em mulheres jovens sexualmente ativas, é recomendado e estima-se que o custo para casos de infecções clamidianas seja cerca de US$ 2,4 bilhões de dólares por ano, e mais de US$ 79 milhões de dólares para tratar infertilidade feminina. As taxas anuais de rastreio para Chlamydia trachomatis passaram de 25% no ano de 2000 para 41% em 2007, evidenciando que o rastreio é custo efetivo (FREITAS, 2007; VIEIRA, 2016). No Brasil, a infecção clamidiana consiste em um problema de saúde pública, devido à ausência de um sistema de notificação compulsória, ausência de um programa de rastreio e de estudos de base populacional, dificultando a visibilidade do problema (FLORES et al., 2011). Cerca de oito milhões de casais possuem problemas de infertilidade, onde a DIP ocasionada por Chlamydia trachomatis é a principal causadora. Devido ao alto custeio, cerca de 90% dos casais brasileiros com problemas de infertilidade ficam sem receber tratamento adequado por parte do serviço público de saúde (FREITAS, 2007; VIEIRA, 2016). Diante do alto número de casos desta infecção em todo o mundo, e das grandes sequelas que a mesma pode acarretar no sistema reprodutor feminino, o diagnóstico laboratorial é importante quando realizado precocemente, com a realização do tratamento adequado evitando que a infecção se dissemine. Porém, este sistema ainda é falho devido a inúmeros fatores, entre eles podemos citar o fato de que a maioria das infecções são assintomáticas ou possuem sintomas vagos e inespecíficos, os testes diagnósticos são relativamente caros e de metodologias complexas, além de os parceiros não serem notificados rotineirãoente. Tudo isso faz com que a identificação e tratamento de pessoas infectadas não sejam realizados corretamente (VIEIRA, 2016). Atualmente, existem várias metodologias para o diagnóstico da infecção clamidial, que incluem testes sorológicos, testes de biologia molecular e exame de cultura microbiológica (MARCHI, 2011). Este trabalho trata-se de uma revisão bibliográfica sendo a pesquisa de natureza básica, qualitativa e exploratória.

14 14 Esta monografia trata-se de uma revisão bibliográfica sendo a pesquisa de natureza básica, qualitativa e exploratória. O objetivo do presente trabalho é demonstrar a importância do diagnóstico laboratorial da infecção genital causada pela bactéria Chlamydia trachomatis, e as principais técnicas diagnósticas utilizadas pelos laboratórios.

15 15 2 DESENVOLVIMENTO 2.1 Chlamydia trachomatis A família Chlamydiaceae é composta pelo gênero Chlamydia e possui três espécies patogênicas ao homem: Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae e Chlamydia psittaci. Sendo as duas últimas responsáveis por infecções respiratórias (MURRAY, 2010). A Chlamydia trachomatis foi considerada um vírus até os anos 60, devido ao seu pequeno tamanho que varia de 0,2 a 1,5 µm e ao seu parasitismo intracelular obrigatório, não possuindo capacidade de gerar ATP para produzir sua própria energia, dependendo totalmente da célula hospedeira para sua reprodução. No entanto, estes organismos apresentam várias propriedades que confirmam sua natureza bacteriana como: membrana interna e externa similar à bactéria gramnegativa, possuem DNA, RNA e ribossomos, sintetizam suas próprias proteínas, ácidos nucléicos e lipídios, além de serem suscetíveis a antibióticos antibacterianos. É responsável pela etiologia de diferentes patologias associadas à biovariedades como tracoma, linfogranuloma venéreo e infecções genitais, sendo dividida em 15 sorotipos de acordo com as diferenças antigênicas presentes na proteína principal da membrana externa (MOMP) (Quadro1). Os sorotipos responsáveis pela infecção urogenital são: D, E, F, G, H, I, J e K (MURRAY, 2010). Quadro 1 - Sorotipos da Chlamydia trachomatis e patologias causadas Fonte: MAIA (2011, p. 26)

16 16 Desta forma a Chlamydia trachomatis é classificada como uma bactéria gramnegativa, imóvel, apresentando duas formas morfologicamente distintas, sendo uma delas altamente infecciosa e metabolicamente inativa denominada de corpúsculos elementares (CEs) e outra forma não infecciosa metabolicamente ativa denominada de corpúsculos reticulados (CRs). Os CEs são adaptados para a vida extracelular, possuem uma forma esférica rodeada por uma membrana citoplasmática e uma membrana externa rígida conferindo maior estabilidade e resistência ao estresse mecânico no ambiente extracelular, medindo cerca de 0,3 µm. Os CRs são adaptados para vida intracelular possuindo diferenças estruturais que conferem maior plasticidade em sua parede celular auxiliando seu pleomorfismo, medindo cerca de 0,5 a 1 µm (FERREIRA, 2010) Ciclo de desenvolvimento A bactéria apresenta um ciclo de vida bifásico e complexo que pode durar de 48 a 72 horas (MURRAY, 2010). O ciclo inicia-se com a aderência do CE a sítios específicos de células susceptíveis a infecção do hospedeiro, como células epiteliais colunares não ciliadas ou cubóides, encontradas, por exemplo, na uretra e endocérvice (MAIA, 2011). Após a aderência, os CEs entram no citoplasma da célula hospedeira por fagocitose e permanecem envoltos por um vacúolo citoplasmático protegendo-os dos mecanismos de defesa celular. Em seguida, os CEs aumentam de tamanho significativamente, para então se reorganizar e se transformar em CRs, que sofrem ciclos de divisões binárias para formar novos corpúsculos. Completado o ciclo, os CRs reorganizam-se em forma de CEs novamente, ocasionam a lise da célula hospedeira e seu extravasamento com alto poder infectante para o meio extracelular (Figura 1). O ciclo é retomado até que uma nova célula seja infectada (FERREIRA, 2013).

17 17 Figura 1 - Ciclo de desenvolvimento da Chlamydia trachomatis Fonte: APPROBATO, 2012, p Patogenicidade bacteriana A parede externa da Chlamydia trachomatis possui muitas proteínas antigênicas, porém, as principais são o antígeno LPS (lipopolissacarídico) e o antígeno MOMP. Os mesmos possuem a capacidade de ativação dos mecanismos imunológicos humorais e celulares, bem como a produção de imunoglobulinas das classes IgA, IgM e IgG, interleucinas, interferons e fator de necrose tumoral. Primariamente, a resposta imune inata induz uma reação inflamatória caracterizada por infiltrado de polimorfonucleares, neutrófilos e macrófagos, principalmente na superfície epitelial. Posteriormente, observam-se linfócitos T e B e macrófagos, induzindo uma resposta imune adaptativa com produção de imunoglobulina IgA. Quando essa resposta imunológica é de pequena intensidade e a longo prazo, a bactéria que primariamente infectou o trato genital inferior, irá migrar para o trato genital superior, levando a sérios danos. A produção do interferon γ (IFN-γ) ocorre quando os CEs infectam a célula do hospedeiro, ativando a resposta imunológica, e levando a inibição do crescimento e bloqueio da replicação dos CRs, atuando em conjunto com citocinas pró-inflamatórias, que ativam células fagocitárias, com o objetivo de limitar a infecção. Porém, quando exposta ao IFN-γ a Chlamydia trachomatis para de se replicar e permanece na forma latente, e, quando o sistema

18 imune diminui a produção de IFN-γ, os CRs começam a se replicar novamente, dando continuidade ao ciclo e reativando a doença (FLORES et al., 2011) Manifestações clínicas Os sinais e sintomas da infecção genital clamidiana costumam aparecer cerca de 1 a 3 semanas após a exposição (SERRAS, 2010). Essas manifestações clínicas são resultado da destruição celular que ocorre durante a multiplicação e resposta inflamatória do hospedeiro (FREITAS, 2007). A bactéria possui afinidade pelas células epiteliais colunares, sendo a endocérvice feminina o principal alvo e onde a infecção se inicia, posteriormente ascendendo o restante do trato genital. Nos homens a infecção inicia-se na uretra (MICHELON et al., 2005). No local da mucosa onde a infecção ocorre há uma inflamação intensa, caracterizada por vermelhidão e edema, resultando em cervicite mucopurulenta em mulheres (Figura 2), e uretrite não gonocócica em homens (Figura 3) (FREITAS, 2007). Os sintomas da cervicite são corrimento vaginal, ectopia ectocervical, edemas e pequenas hemorragias na mucosa após mínimos traumas (SERRAS, 2010). Figura 2 - Cervicite causada por Chlamydia trachomatis em mulher Fonte: SERRAS, 2010, p. 26

19 19 Figura 3 - Uretrite não gonocócica causada por Chlamydia trachomatis em homem Fonte: SERRAS, 2010, p. 29 Infecções crônicas das células da mucosa genital podem migrar para o útero infectando as células trofoblásticas (MURRAY, 2010). A doença inflamatória pélvica (DIP) é uma das complicações mais graves devido à infecção por clamídia não tratada. É um processo inflamatório que pode atingir as estruturas do trato genital superior como, útero, tubas uterinas, ovário e estruturas anexas, podendo levar a endometrite, salpingite, abscesso tubo ovariano e peritonite (Figura 4). Os sintomas sugestivos da DIP são: dor abdominal baixa, febre, sangramento não habitual, disúria, dispaureunia, início de dor associada à menstruação, náuseas e vômitos (ROMANELLI et.al, 2011). A evolução da doença pode levar a sequelas como gravidez ectópica, infertilidade, e dores pélvicas crônicas (BENZAKEN et al., 2008). Figura 4 - Infecção genital feminina pela Chlamydia trachomatis Fonte: FREITAS, 2007, p. 51

20 Prevalência A infecção clamidiana é a segunda IST que mais acomete mulheres de 15 a 49 anos de idade nos países em desenvolvimento e anualmente estima-se que ocorram 50 milhões de novos casos (VIEIRA, 2016). No Brasil, esta doença não está entre as IST s de notificação compulsória, não há dados detalhados acerca da prevalência desta infecção, e estima-se que há uma incidência de 2,1% a 31,5% de infecções genitais, sendo cerca de casos diagnosticados ao ano (FREITAS, 2007). O fato de haver poucos dados desta patologia em âmbito nacional se deve a inúmeros fatores, como a prevalência de infecções assintomáticas, dificultando a identificação em mulheres, e principalmente, a escassez de locais do serviço público que oferecem de maneira sistemática a pesquisa deste patógeno em consultas ginecológicas e pré-natal. Nas clínicas particulares, só se pesquisa a bactéria em casos sintomáticos ou quando os parceiros sexuais apresentam a infecção (MEDEIROS, 2006). Já nos Estados Unidos, a infecção por clamídia é mais comum, sendo a IST de notificação compulsória mais prevalente, sendo maior quando comparadas a outras ISTs, como a sífilis e a gonorréia, onde 3 a 4 milhões de casos novos são diagnosticados por ano (MEDEIROS, 2006). Destes casos, cerca de 5% a 14% de jovens com idades de 16 a 20 anos e 3% a 12% de mulheres de 20 a 24 anos são infectadas por Chlamydia trachomatis (FREITAS, 2007). Algumas medidas devem ser tomadas para prevenir a infecção como, mudanças comportamentais que irão reduzir o risco de contrair outras IST s, identificar e tratar o parceiro, caso o mesmo apresente a infecção, diminuir o número de parceiros sexuais além de usar preservativo em todas as relações, sendo estas medidas essenciais para se evitar a infecção (IGANSI, 2005). Nos Estados Unidos o CDC afirma que para prevenção e controle das DST s devem ser adotadas cinco estratégias básicas, sendo: educação e aconselhamento sobre como evitar DST s para indivíduos que apresentam comportamento de risco, rastreamento para identificação dos portadores assintomáticos e sintomáticos que não procuram o serviço de saúde, diagnóstico e tratamento correto de indivíduos infectados, aconselhamento e tratamento dos parceiros sexuais caso apresentem a

21 21 DST ou não e vacinação quando disponível de indivíduos que estão sob risco de contrair uma DST (APPROBATO, 2012). Programas de rastreio anuais para identificação de Chlamydia trachomatis em indivíduos assintomáticos sexualmente ativos já estão sendo implementados em muitos países. A Suíça foi o primeiro país a adotar esta prática em 1982, em seguida a Inglaterra criou o programa National Chlamydia Screening Programm onde o foco são jovens de 15 a 24 anos por ser o grupo de maior prevalência da infecção (Figura 5). Já na Austrália o método foi adotado em 1997, onde o governo financia um programa-teste chamado de Australian Chlamydia Control Effectiveness Pilot para diagnóstico de infecção clamidiana cujo objetivo é avaliar a relação custo-eficácia do rastreio anual de jovens de 16 a 29 anos (Figura 6) (VIEIRA, 2016). Figura 5 - Detecção da infecção por Chlamydia trachomatis classificada por sexo e idade a cada indivíduos na Inglaterra no ano de 2014 Fonte: VIEIRA, 2016, p. 48

22 22 Figura 6 - Detecção da infecção por Chlamydia trachomatis classificada por sexo e idade a cada indivíduos na Austrália no de 2011 Fonte: VIEIRA, 2016, p. 49 Canadá e Escócia também passaram a utilizar estes programas, apresentando resultados satisfatórios com diminuição do desenvolvimento de DIP, além da grande economia para saúde pública de custos relacionados com a infecção e suas sequelas. Nos Estados Unidos o CDC recomenda que todas as mulheres sexualmente ativas com idade inferior a 35 anos e homens penitenciários com idade abaixo de 30 anos sejam rastreados anualmente, em 2014 cerca de casos de infecção por Chlamydia trachomatis foram notificadas, sendo a maioria destes casos entre jovens de 15 a 24 anos de idade (Figura 7). Devido ao fato de mulheres jovens serem mais acometidas por esta infecção, destaca-se a importância destes programas na prevenção da infertilidade, uma vez que quando realizado o diagnóstico precocemente aumentam as chances de cura sem sequelas na terapêutica (VIEIRA, 2016).

23 23 Figura 7 - Taxas de casos notificados ao CDC de infecção por Chlamydia trachomatis classificado por sexo e idade nos Estados Unidos no ano de 2015 Fonte: (CDC, 2017-Adaptado) Disponível em: < Acesso em: 19 de setembro de Diagnóstico laboratorial A escolha do método de diagnóstico deve levar em conta a prevalência da infecção na população para que se use uma metodologia a qual a especificidade e a sensibilidade sejam compatíveis, bem como realizar uma abordagem sindrômica, a fim de que os sinais clínicos da doença sejam observados. No Brasil, não existe uma recomendação para se realizar testes laboratoriais para o rastreio de Chlamydia trachomatis, desse modo, muitas mulheres assintomáticas não são diagnosticadas, transmitindo então a infecção para seus parceiros (FLORES et al., 2011). Os métodos mais utilizados de diagnóstico são métodos diretos, para pesquisa da presença de antígenos e métodos indiretos, para se quantificar a presença de anticorpos. Contudo, independente da escolha da metodologia a coleta do material biológico, o meio de armazenamento e transporte, o processamento, a leitura e a interpretação dos exames, devem ser sempre de qualidade para se garantir a eficácia na realização do teste (FLORES et al., 2011) Coleta e transporte Uma vez que a Chlamydia trachomatis é uma bactéria intracelular obrigatória, a coleta para obtenção de células deve ser um procedimento minucioso, devendo conter uma boa quantidade das mesmas na amostra coletada, para se evitar

24 24 resultados falsos negativos. Atualmente, utiliza-se swabs endocervicais e ou uretrais, além de amostras de urina. Devido às clamídias serem bactérias relativamente estáveis, as amostras podem ser mantidas refrigeradas até a sua análise e transportadas em meios específicos (BECKER, 2005) Cultura celular Considerada durante muitos anos uma técnica padrão ouro para a identificação clamidial, a cultura é um método realizado com base na detecção do organismo vivo, onde as amostras são coletadas a partir da região endocervical, contendo células epiteliais colunares ou cubóides, as quais tem maior probabilidade de estarem ativamente infectadas. As bactérias são isoladas em monocamadas sobre microplacas, utilizando principalmente células da linhagem McCoy (IGANSI, 2005). Após a inoculação das bactérias, o cultivo é realizado em três dias de incubação e devido à presença de inclusões citoplasmáticas formadas, coradas por iodo, Giemsa, ou anticorpos monoclonais fluorescentes, indicarão a positividade do teste (FERREIRA, 2013). Entretanto, para que a qualidade do teste seja verdadeirãoente positiva alguns fatores devem ser observados como o tempo da coleta do material e do processamento da amostra, devendo ser mantido sobre refrigeração de 4 a 8ºC quando a mesma for processada em até 24 horas após a coleta. Quando ultrapassado esse tempo, o material deve ser refrigerado a -70ºC até que seu processamento seja realizado (FERREIRA, 2013). As vantagens do teste de cultura incluem: especificidade próxima de 100% devido à visualização direta das inclusões citoplasmáticas, possui um potencial mínimo de contaminação, preservando o microorganismo para testes de sensibilidade a antimicrobianos e genotipagem, é utilizada para fins médico legais em casos de suspeita de estupro e abuso sexual, pelo CDC (Centro de Controle e Prevenção de Doenças), devido a resultados falsos positivos apresentados pelos testes não cultiváveis (BECKER, 2005). Dentre as desvantagens estão o tempo para obtenção de resultados, detecção somente de bactérias vivas, situações inadequadas de coleta, transporte e armazenamento, prejudicando a viabilidade da amostra, sendo a sensibilidade de apenas até 70% (FERREIRA, 2013). Atualmente, tem-se a necessidade de infra estrutura laboratorial adequada, devido à cultura

25 exigir cuidados de conservação, esta técnica frequentemente restringe-se somente a laboratórios de referência (SEADI et al., 2002) Imunofluorescência direta Técnica utilizada para pesquisa direta de antígenos clamidiais, onde o material coletado da cérvice é fixado em lâmina de vidro. O teste baseia-se na reação entre o antígeno MOMP presente na bactéria e o anticorpo monoclonal anti- MOMP, marcado com fluorocromo (FERREIRA, 2013). Os CEs quando presentes na amostra irão fazer com que os anticorpos se liguem às moléculas de MOMP presentes na membrana dos mesmos, emitindo então fluorescência de cor verde maçã, que poderá ser observada em microscópio de fluorescência. (SERRAS, 2010) Procedimentos do teste Primeiramente, inicia-se o procedimento de diagnóstico com a leitura de lâmina-controle atentando-se ao padrão de cor e tamanho dos CEs. Em seguida, a amostra deve ser retirada do recipiente de conservação, deixando-a em temperatura ambiente na câmara úmida. Depois, deposita-se uma gota do anticorpo monoclonal anti-momp, deixando por 15 minutos em incubação. Lava-se abundantemente a lâmina com água destilada para retirada do excesso de anticorpos não fixados, deixando-a secar naturalmente, para então depositar uma gota do meio de fixação, cobrindo a lâmina com lamínula (Figura 8 e 9). E, por fim, a lamina deve ser observada em microscópio de fluorescência na objetiva de 400x e 1000x em imersão para confirmação do diagnóstico (MEDEIROS, 2006).

26 26 Figura 8 - Reação positiva de imunofluorescência direta Fonte: MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1997, p. 29 Figura 9 - Reação negativa de imunofluorescência direta Fonte: MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1997, p Interpretação de resultado Para que o teste seja considerado positivo, faz-se necessário a observação de no mínimo cinco CEs em ampliação de 1000x. Os mesmos apresentam-se com formas arredondadas, contornos regulares e cor fluorescente de verde maçã (Tabela 2) (MEDEIROS, 2006).

27 27 Quadro 2 - Critérios para leitura e interpretação de resultados Fonte: MINISTÉRIO DA SAÚDE (1997, p. 32) Dentre as vantagens do teste estão a sensibilidade de cerca de 85% e especificidade de 95%, não sendo necessário a realização de um outro teste confirmatório e a obtenção de resultados relativamente rápidos. As desvantagens são a necessidade de experiência profissional para análise dos CEs, distinguindo-os do material inerte fluorescente e a necessidade de microscópio de fluorescência (SERRAS, 2010) Imunofluorescência indireta Teste sorológico utilizado para detecção de anticorpos contra o antígeno LPS presentes nos CEs ou CRs da bactéria Chlamydia trachomatis, baseia-se em uma pesquisa qualitativa e semiquantitativa de imunoglobulinas IgG, IgA e IgM (SERRAS, 2010), utilizando lâminas onde estão aderidos os antígenos clamidiais L2 que reagem com todos os sorotipos de Chlamydia trachomatis, sobre a qual será acrescentado o soro diluído do paciente (FERREIRA, 2010). É uma metodologia onde a detecção desses anticorpos, tem sido associada à esterelidade, como um teste de rastreamento do fator tubário, sendo, portanto desaconselhável para pesquisa de infecções superficiais como a cervicite, uma vez que infecções prévias por clamídia podem apresentar níveis séricos de anticorpos elevados ou não, tornando difícil a distinção de um processo infeccioso, e também pode haver possibilidade de reações cruzadas com outras espécies de clamídia (FREITAS, 2007). Estima-se que mais de 70% das mulheres com lesões tubárias apresentam anticorpos circulantes contra a Chlamydia trachomatis (APPROBATO, 2012), estudos evidenciaram que 80% das mulheres com doença tubária e 25% das

28 mulheres inférteis com trompas normais, apresentam títulos >32 UI/M1 para anticorpos IgG plasmáticos (FREITAS, 2007) Procedimentos do teste Em um suporte de reação coloca-se 25µl das seguintes reações: diluições do soro do paciente, controle negativo e controle positivo, em contato com o antígeno L2 fixado na lâmina durante aproximadamente 30 minutos em temperatura ambiente. Após isso, realiza-se incubação da lâmina e lavagem, para que possa ser aplicado 20µl de anticorpo anti-imunoglobulina humana marcado com fluoresceína IgM ou IgG (Figura 10). Incuba-se novamente a lâmina durante 30 minutos, e é realizado uma segunda lavagem. É coberta a lâmina com óleo de imersão e lamínula observando-a em microscópio de fluorescência na objetiva de 40x (SERRAS, 2010). Figura 10 - Técnica de imunofluorescência indireta Fonte: MAIA, 2011, p Interpretação de resultado Caso haja presença de anticorpos anti-chlamydia trachomatis no soro do paciente, estes quando colocados em contato com as células infectadas pela bactéria presentes na lâmina, se ligam aos antígenos. A reação antígeno-anticorpo poderá ser observada em microscópio de fluorescência, através da fluorescência

29 29 verde emitida pelos CEs presentes nas células fixadas na lâmina (Figura 11) (SERRAS, 2010). Esta técnica nos permite detectar as três classes de imunoglobulinas utilizando a diluição 1:8 do soro a ser testado como triagem para os diferentes anticorpos pesquisados, a caracterização das classes IgM, IgA e IgG e os valores obtidos irão variar de acordo com o grau de invasividade do antígeno e a resposta imunológica do hospedeiro. Nas infecções superficiais não são encontrados anticorpos séricos, porém em processo agudo títulos de IgA e IgM com diluições entre 1:8 e 1:16 são detectados. Na presença da infecção, os níveis de anticorpos IgG e IgA aumentam e os de IgM decaem rapidamente, títulos de IgG superiores a 1:64 e de IgA superiores a 1:32 em mulheres infectadas são sugestivos de processo inflamatório em desenvolvimento (FERREIRA, 2013). Figura 11 - Resultado positivo para pesquisa de anticorpos anti-chlamydia Fonte: MAGALHÃES, 2010, p. 93 Dentre as vantagens estão, o teste adequado para triagem de um grande número de amostras de soro, por ser uma metodologia simples e detectar anticorpos contra diferentes sorotipos, sendo recomendada para estudos epidemiológicos e infecções sistêmicas, como salpingite, infertilidade entre outros, devido os títulos de IgG serem relativamente altos. Desvantagens são, não permite distinção entre as cepas que infectam o olho e o trato genital, não sendo recomendada para diagnosticar infecção urogenital (FERREIRA, 2010).

30 Reação em cadeia da polimerase PCR As técnicas de amplificação de ácidos nucléicos são consideradas o método mais indicado e promissor para o diagnóstico de infecção por clamídia, em virtude de sua alta sensibilidade e especificidade, sendo possível detectar com rapidez, pequenas quantidades de ácidos nucléicos em vários materiais biológicos como urina, secreções e swabs de raspados cervicais, endocervicais e uretrais, podendo ser utilizado como teste confirmatório de resultados obtidos através de métodos diretos e indiretos. Para que possa ser realizada a coleta de material endocervical, o excesso de muco deve ser removido com um swab, após isso, deve-se introduzir o swab de coleta no canal endocervical girando-o por 3 a 5 segundos e retirar sem que o mesmo encoste na parede vaginal, colocando-o em seu respectivo tubo devidamente identificado e armazená-lo sob refrigeração por até 5 dias. Já para coleta de urina deve haver a retenção da mesma nas 2 horas anteriores a coleta, desprezando cerca de 10 a 50 ml do primeiro jato. As amostras devem ser coletadas em tubo estéril, sem conservantes e encaminhadas ao laboratório à temperatura ambiente onde são armazenadas em temperatura de 2º a 4ºC por no máximo 4 dias após a coleta (FERREIRA, 2013). A amplificação de DNA ou RNA consiste na obtenção de milhares de cópias de um segmento de DNA a partir de iniciadores (primers) constituídos de oligonucleotídios complementares a uma sequência de DNA alvo, estes iniciadores irão definir a região do DNA da bactéria a ser amplificado (FERREIRA, 2010). A sensibilidade da técnica de amplificação de ácidos nucléicos é em torno de 20% maior que a da cultura de células (FREITAS, 2007), sendo considerada, portanto o novo padrão-ouro do diagnóstico laboratorial de infecção por Chlamydia trachomatis (FERREIRA, 2010). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), baseia no processo de amplificação de uma sequência de nucleotídeos do plasmídio clamidial, que é considerado o gene alvo para o diagnóstico de Chlamydia trachomatis presente em múltiplas cópias em cada CE da bactéria, sendo considerado portanto a PCR plasmidial mais sensível por ser capaz de detectar de 7 a 10 cópias de DNA, seguido da PCR dirigida ao gene codificador da proteína externa MOMP que detecta apenas uma cópia de DNA. A técnica de PCR é capaz de detectar menos de um CE na amostra clínica (FREITAS, 2007).

31 Procedimentos do teste Para realização da técnica de PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, tampão salino contendo a polimerase, oligonucleotídios iniciadores, os quatro desoxinucleotídeos constituintes do DNA e o cofator Mg²+. A sequência de DNA clamidial a ser extraída para análise é exposta a tratamento com detergente ou através de aquecimento até ocorrer à lise do microorganismo, este DNA extraído é colocado em um tubo contendo todos os reativos para realização da PCR. A reação ocorre em um termociclador, onde são usadas elevadas temperaturas (92º a 96ºC) de modo a desnaturar a dupla hélice separando as moléculas em duas cadeias simples, depois disso, ocorre o anelamento, a temperatura é reduzida para 35º a 60ºC para que possa ocorrer a ligação dos primers CTP1 e CTP2 às suas sequências complementares de DNA. A temperatura é elevada a 72ºC fazendo com que a enzima Taq DNA polimerase promova a adição de bases através da extensão a partir de cada extremidade 3 dos primers, compondo assim uma nova molécula de DNA que servirá como molde para outros ciclos (Figura 12) (FREITAS, 2007). Figura 12 - Representação de um ciclo de PCR Fonte: (HERINGER, 2014) Disponível em: < Acesso em: 13 de novembro de 2017

32 32 Este processo pode ser repetido várias vezes (cerca de 25 a 30 ciclos), em cada ciclo aumenta-se duas vezes a concentração de DNA existente, obtendo-se ao final mais de um milhão de cópias de DNA (APPROBATO, 2012) Interpretação de resultado As novas cadeias de DNA originadas da PCR podem ser observadas através de eletroforese em gel de agarose a 1,5% contendo brometo de etídeo a uma concentração de 0,5µg/ml, em tampão tris borato com ácido etilenodiaminatetracético (TBE 1X ph 8,3) (SERRAS, 2010). É importante incluir em cada técnica realizada um controle positivo, sendo constituído por DNA de Chlamydia trachomatis serovar L2 extraído de culturas de células McCoy, e um controle negativo composto por água bi-destilada e deionizada. Os produtos da amplificação são aplicados no gel onde se mistura 10µl do mesmo e 3µl de solução saturada de sacarose corada com azul de bromofenol, em seguida o gel é submetido a um campo elétrico de 100V e 50A durante aproximadamente uma hora e meia até que os diferentes fragmentos de DNA possam migrar de acordo com o seu tamanho. Terminada a corrida eletroforética, o gel é exposto à luz ultravioleta para que os fragmentos da amplificação possam ser observados (Figura 13 e 14) (MAGALHÃES, 2010). Figura 13 - Amostras 2,3 e 4 positivas para Chlamydia trachomatis em eletroforese em gel de agarose Fonte: SERRAS, 2010, p. 72

33 33 Figura 14 - Amostras negativas para Chlamydia trachomatis em eletroforese em gel de agarose Fonte: MAGALHÃES, 2010, p. 89 As vantagens da técnica de PCR são a sensibilidade de 77% a 93% e especificidade de 95% a 99%, possibilidade de utilizar a urina como material biológico para detecção de DNA clamidial simplificando a coleta, detecção com rapidez, e necessidade de pequenas quantidades de ácidos nucléicos para detectar apenas uma partícula de plasmídio clamidial, permanecendo o resultado positivo até uma semana após um tratamento bem sucedido com uso de antibiótico. Devido à possibilidade de permanência de material genético no hospedeiro, outra importante vantagem é a possibilidade de se empregar a genotipagem que pode ser realizada por Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ou através de sequênciamento de nucleotídeos direto da amostra por amplificação do gene omp1 (APPROBATO, 2012). Dentre as desvantagens temos o alto custo para realização da metodologia e os problemas relacionados à inibição em amostras de urina, onde a mesma pode estar associada à presença de cristais, outras bactérias e pela presença do hormônio gonadotrofina coriônica humana β (hormônio indicativo de gravidez) (MAGALHÃES, 2010). 2.4 Tratamento O tratamento para infecções clamidianas deve ser feito de imediato para indivíduos com testes positivos para infecção, evitando assim que complicações graves sejam adquiridas, bem como para que não haja a transmissão da mesma para os parceiros, evitando assim a reinfecção da doença (SERRAS, 2010).

34 34 Atualmente, os esquemas terapêuticos utilizados para infecções urogenitais irão diferir das infecções não complicadas para aquelas com complicações e também de mulheres grávidas. Os antibióticos recomendados para pacientes com queixas de corrimento uretral são a azitromicina em dose única e a doxiciclina, 2 vezes ao dia, durante 7 dias, em mulheres grávidas é utilizado amoxicilina e azitromicina (MAIA, 2011). Estudos demonstraram que tanto a azitromicina quanto a doxiciclina possuem taxas de cura microbiológica igualmente eficaz, de 97% e 98% respectivamente. Os parceiros sexuais devem ser tratados da mesma maneira, apresentando ou não sintomas de infecção por clamídia, para minimizar o risco de reinfecção o paciente deve manter abstinência sexual de sete dias após a terapia de dose única ou até o término da terapia (APPROBATO, 2012).

35 35 3 CONCLUSÃO A infecção genital causada pela bactéria Chlamydia trachomatis, é uma infecção sexualmente transmissível que acomete homens e mulheres. Caracterizada por seu difícil diagnóstico precoce, uma vez que na maioria dos casos, a mesma apresenta-se de maneira silenciosa e quando os sintomas se manifestam, eles costumam ser muito parecidos com outras ISTs. Portanto, é uma patologia que está se tornando um problema de saúde pública, devido sua elevada prevalência em todo o mundo e quando não diagnosticada e tratada a tempo, pode causar grandes sequelas. Dentre os agravamentos ocasionados pela infecção clamidiana, a doença inflamatória pélvica (DIP) é a mais grave, sendo uma patologia caracterizada por uma inflamação das estruturas do sistema reprodutor feminino, que pode levar a mulher à infertilidade. Atualmente, existe uma gama de métodos diagnósticos laboratoriais, dentre eles, destaca-se o teste de Reação em cadeira da polimerase PCR, sendo o mais promissor e indicado por sua alta sensibilidade e especificidade quando comparado a outros testes, além da possibilidade de se utilizar diversos materiais biológicos, como a urina. Porém pelo fato do elevado custo das metodologias empregadas, sua complexidade e necessidade de profissionais capacitados para realização das mesmas, não é rotineiro a pesquisa desta bactéria. No Brasil, só se pesquisa o patógeno quando o paciente apresenta sintomas, que muitas vezes são inespecíficos podendo ser confundidos com outras IST s, além de não haver dados sobre a prevalência desta infecção. Portanto faz-se necessário uma maior divulgação por parte do sistema de saúde pública sobre a mesma, evidenciando a importância do diagnóstico precoce para prevenção principalmente da infertilidade feminina e outras sequelas que possam ser causadas, para que assim dados acerca da prevalência em âmbito nacional sejam coletados contribuindo para que futuramente um programa de rastreio seja implementado tanto na rede pública como na rede privada.

36 36 REFERÊNCIAS APPROBATO, C. Fabiana. Prevalência da Chlamydia trachomatis pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em mulheres inférteis. 2012, Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) Universidade Federal de Góias, Goiânia, BECKER, Daniela. Detecção de Chlamydia trachomatis em amostras cervicais por reação em cadeia da polimerase. 2005, 92 f.. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Centro de Biotecnologia, Porto Alegre, BENZAKEN, S. Adele, et al. Prevalência da infecção por Chlamydia trachomatis e fatores associados em diferentes populações de ambos os sexos na cidade de Manaus. Revista DST J Bras Doenças Sex Transm. Rio de Janeiro, v. 20, n. 1, p 18-23, BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Programa Nacional de DST e Aids. Manual de bolso controle das doenças sexualmente transmissíveis (DST). Brasília: Ministério da Saúde, p. BRASIL. Secretaria de Estado da Saúde. Diretoria de Vigilância Epidemiológica do Estado de Santa Catarina. Doenças sexualmente transmissíveis DST. Florianópolis: SEA/DGAO, p. BRASIL. Ministério da Saúde. Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids. Diagnóstico laboratorial da clamídia. Brasília: Ministério da Saúde, p. CDC. Centro de Controle e Prevenção de Doenças: Vigilância de Doenças de Transmissão Sexual, Disponível em: < Acesso em: 19 de setembro de FERREIRA, Walter A. et al. Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Autoimunes. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan Ltda, 3ª Edição, FERREIRA, Walter A. et al. Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Autoimunes. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan Ltda, 2ª Edição, FERREIRA, N. O. R. Glenda. Soroepidemiologia de Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae etreponema pallidum nas aldeias indígenas, Bakajá, Apyterewa, Xingu e Mrotdidjãm, Altamira, Pará, Brasil f.. Dissertação (Mestrado em Biologia de agentes infecciosos e parasitários) Universidade Federal do Pará, Programa de Pós-Graduação em Biologia de agentes infecciosos e parasitários do Instituto de Ciências Biológicas, Belém, Pará, FLORES, C. Bianca, et al. Chlamydia trachomatis e infecções genitais femininas. Revista Science in Health. São Paulo, v. 2, n. 1, p 55-63, FREITAS, L. S. Norma. Detecção de Chlamydia trachomatis pela técnica de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) em mulheres atendidas na clínica de infertilidade do Hospital Dona Francisca Mendes, Manaus Amazonas f.. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) Universidade Federal do Amazonas, Programa Multi-Institucional de Pós-Graduação em Biotecnologia, Manaus, Amazonas, HERINGER, Otto. Como copiar o código em laboratório? : Alguns fundamentos básicos, Introdução a biologia sintética. Disponível em:

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