Effect of flaxseed oil in the diet of male quail (Coturnix coturnix coturnix) on semen characteristics and biometric evaluation of testicles

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1 RPCV (2012) 107 ( ) REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Efeito da inclusão de óleo de linhaça na dieta de codornas macho (Coturnix coturnix coturnix) sobre características seminais e avaliação biométrica dos testículos Effect of flaxseed oil in the diet of male quail (Coturnix coturnix coturnix) on semen characteristics and biometric evaluation of testicles Edenilse Gopinger*, Angelina S. F. Borelli, Eduardo G. Xavier, Denise C. Bongalhardo, Nelson J. L. Dionello, Jerri T. Zanusso, Victor F. B. Roll Universidade Federal de Pelotas, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Departamento de Zootecnia, Caixa postal 354, CEP Pelotas, RS, Brasil Resumo: Foi avaliado o efeito da inclusão do óleo de linhaça em substituição ao óleo de soja, na dieta de codornas (codornizes) macho (Coturnix coturnix coturnix) sobre características seminais e biometria testicular. Foram testadas cinquenta codornas macho, com 45 dias de idade, alojadas em gaiolas individuais, recebendo água e ração ad libitum. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, sendo cada animal uma unidade experimental, com cinco níveis de óleo de linhaça e dez repetições por tratamento. Após 44 dias recebendo ração experimental, iniciou-se o abate dos animais por deslocamento crânio-cervical para avaliação biométrica dos testículos e avaliação das características seminais. Os dados foram submetidos à análise de regressão polinomial. A substituição do óleo de soja pelo óleo de linhaça nos diferentes níveis testados (0, 25, 50, 75, 100%) não influenciou o peso dos testículos e nem as variáveis biométricas (comprimento e largura) dos testículos das codornas. Nas avaliações das características seminais, o aumento do percentual de óleo de linhaça na dieta das aves resultou em aumento da motilidade espermática e em melhores índices de espermatozoides normais. A concentração espermática não foi influenciada pelos níveis de óleo de linhaça. Palavras-chave: Biometria, características seminais, codornas, codornizes Summary: A trial was conducted to evaluate the inclusion of flaxseed oil in replacement of soybean oil in male quails diet (Coturnix coturnix coturnix) on their biometric of testicles and semen characteristics. Fifty male quails (forty-five days old) were individually allotted to cages and had ad libitum access to feed and water. A completely randomized design was used. Each bird was an experimental unit. Five levels of flaxseed oil with ten replications (quails) each were studied. After forty-four days of trial, quails were slaughtered by skull-cervical extrusion technique. Biometric evaluation of testicles and semen characteristics was conducted. Data were analyzed through polynomial regression. The replacement of soybean oil by flaxseed oil in different levels did not influence either testicles weight or biometric variables (length and width) of testicles. Increasing levels of flaxseed oil in the diets increased both sperm motility and normal spermatozoa rates. Sperm concentration was not influenced by flaxseed oil. Keywords: Biometrics, seminal characteristics, quails *Correspondência: edezoo@yahoo.com.br Introdução Atualmente, as condições mundiais privilegiam as atividades que não necessitem de grandes investimentos e mão de obra, que ocupem pouco espaço e, ainda, que forneçam retorno financeiro em curto ou médio prazo (Garcia e Pizzolante, 2004). Nesse contexto, a coturnicultura vem se destacando a cada ano como uma atividade produtiva no mercado agropecuário brasileiro. Dentre outras vantagens na criação, as codornas destacam-se pela boa conversão alimentar, pela maturidade sexual precoce, pela alta produtividade, pelos pequenos investimentos iniciais, pelo fácil manejo e pela resistência às doenças e, principalmente, pelo rápido retorno financeiro. Além disso, tanto a carne quanto os ovos são excelentes fontes de nutrientes (Murakami e Ariki, 1998; Singh e Narayan, 2002), como vitamina B6, niacina, B1, B2 e ainda grandes concentrações de ferro, fósforo, zinco e cobre (Ferreira, 2010). Desta forma, as aves podem ser utilizadas tanto para a produção de ovos quanto para a produção de carne. Os lipídeos são substâncias necessárias para o crescimento e reprodução das aves de produção. Porém, os não ruminantes são incapazes de sintetizar os ácidos graxos linoléico (C18:2ω-6) e linolênico (C18:3ω-3), que são considerados essenciais e, portanto, devem ser fornecidos via dieta (Dolz, 1996). A fonte vegetal mais conhecida e rica em ômega 3 (ω-3) utilizada na dieta de poedeiras é a linhaça (Linum usitatissimum). A composição dos lipídeos da dieta tem efeito sobre a composição dos lipídeos nos tecidos animais (Dalton, 2000), sendo que a semente de linhaça tem sido amplamente utilizada com intuito de modificar a composição lipídica da gema dos ovos (Cherian e Sim, 1991; Aymond e Van Elswyk, 1995). 177

2 Em muitos casos a dieta também é o principal determinante da composição dos ácidos graxos dos espermatozóides (Surai et al., 2000). Kelso et al. (1997) e Blesbois et al. (1997) afirmam que a manipulação da dieta pode ser um meio eficaz de alterar o perfil de ácidos graxos dos espermatozóides das aves, melhorando a fertilidade. Segundo Hammerstedt (1993), existe evidência de que a composição de lipídios da membrana do espermatozóide é o maior determinante sobre a motilidade, a sensibilidade ao calor e, principalmente, a viabilidade. Bongalhardo et al. (2009) avaliaram os efeitos de diferentes lipídios dietéticos sobre os espermatozóides de galos e concluíram que tanto o óleo de peixe, quanto a semente de linhaça, promoveram uma alteração no perfil de ácidos graxos dos espermatozóides. A fertilidade está correlacionada ao número de espermatozóides funcionais no local de fertilização (Robertson et al., 1997). Por outro lado, a fertilidade se correlaciona com peso dos testículos, pois testículos maiores apresentam maior capacidade de produção de testosterona e maior e melhor atividade espermática (Amoroso et al., 2008). Neste sentido, Mather e Wilson (1964) verificaram que em codornas japonesas os estágios de desenvolvimento testicular estão estreitamente correlacionados com o peso testicular. Outros estudos já foram realizados em codornas com o intento de aumentar o peso dos testículos. Por exemplo, Oliveira et al., (2000) realizaram um estudo histológico e morfométrico do testículo de codornas adultas submetidas a três diferentes níveis de proteína na ração (16%, 18%, 20%) e verificaram que os diferentes níveis de proteína não afetaram o peso corporal e o peso absoluto do testículo. O óleo de linhaça vem sendo estudado em diversas pesquisas com poedeiras e frangos de corte, por ser um produto que contém altas proporções de ácido linolênico e, assim sendo, uma excelente fonte de ômega 3 (Zambiasi et al., 2007), enriquecendo os ovos e a carne de frango com esse nutriente. Por outro lado, são escassas as informações sobre os efeitos do óleo de linhaça sobre as características seminais e o desempenho de codornas. Por esta razão essa pesquisa teve como objetivo avaliar o efeito da inclusão do óleo de linhaça, em substituição ao óleo de soja, na dieta de codornas macho, sobre as características seminais, a biometria dos testículos e o desempenho das aves. Material e métodos O experimento foi realizado no Laboratório de Ensino e Experimentação Zootécnica Professor Renato Rodrigues Peixoto (LEEZO) do Departamento de Zootecnia, da Universidade Federal de Pelotas. Foram utilizadas 50 codornas de corte macho (Coturnix coturnix coturnix) com idade de 45 dias e peso médio de 230 g. As aves foram alojadas em gaiolas individuais, com comedouros individuais tipo calha e bebedouros tipo nipple. A água e a ração farelada foram fornecidas à vontade. Os animais permaneceram em ambiente climatizado, com temperatura controlada de 23 ºC±1. A iluminação foi realizada por lâmpadas incandescentes de 60 W e o programa de luz controlado por relógio timer. As aves foram alimentadas com dietas formuladas com diferentes níveis de óleo de linhaça em substituição ao óleo de soja, constituindo um delineamento experimental inteiramente casualizado, com cinco tratamentos (T1-0%, T2-25%, T3-50%, T4-75% e T5-100% de óleo de linhaça) e com 10 repetições, sendo cada animal uma unidade experimental. As dietas experimentais foram formuladas de modo a atender às exigências nutricionais das aves, sendo isoenergéticas e isoproteicas, diferindo apenas pelos níveis de inclusão de óleo de linhaça em substituição ao de soja (Tabela 1). As aves foram pesadas individualmente no início do experimento (45 dias de idade) e a cada sete dias, até completarem 89 dias de idade, quando foram abatidas. As aves foram sacrificadas por deslocamento da articulação crânio-cervical para realizar a coleta dos testículos e ductos deferentes e para avaliação biométrica dos testículos e características seminais. As avaliações biométricas foram realizadas através da pesagem, em balança digital, do testículo direito e Tabela 1 - Composição das dietas para codornas machos, contendo níveis crescentes de óleo de linhaça Trat.1 Trat.2 Trat.3 Trat.4 Trat.5 Ingredientes kg % kg % kg % kg % kg % Milho 13, , , , ,75 55 F. soja 45% 7,95 31,8 7,95 31,8 7,95 31,8 7,95 31,8 7,95 31,8 Premix* 1,21 4,84 1,21 4,84 1,21 4,84 1,21 4,84 1,21 4,84 Calcário 1,42 5,68 1,42 5,68 1,42 5,68 1,42 5,68 1,42 5,68 Óleo soja 0,665 2,66 0,499 1,996 0,332 1,33 0,166 0, Óleo linhaça - - 0,166 0,664 0,332 1,33 0,499 1,996 0,665 2,66 Total *Níveis de garantia por kg do produto: ácido fólico: 16,7mg; ácido pantotênico: 204,6mg; bacitracina de zinco: 600mg; BHT: 700mg; biotina: 1,4mg; cálcio: 197,5mg; cobalto: 5,1mg; cobre: 244mg; colina: 42g; ferro: 1695mg; flúor (máximo): 400mg; fósforo: 50g; iodo: 29mg; manganês: 1485mg; metionina: 11g; niacina: 840mg; selênio: 3,2mg; sódio: 36g; vitamina A: UI; vitamina B1: 40mg; vitamina B12: 430mcg; vitamina B2: 120mg; vitamina B6: 54mg; vitamina D3: 43200UI; vitamina E: 540mg; vitamina K3: 51,5mg; zinco: 1535mg 178

3 esquerdo, separadamente, e das medições de largura e comprimento realizadas com o auxílio de uma régua. Para as avaliações das características seminais, primeiro procedeu-se a retirada do sêmen dos ductos deferentes em uma placa de Petry, com o auxílio de uma lâmina de bisturi (lado não cortante). Após, 5 µl de sêmen foram retirados da placa, colocados sobre uma lâmina de vidro e misturados com 10 µl de cloreto de sódio 0,9% (NaCl); foi colocada uma lamínula sobre a lâmina e a motilidade do sêmen foi avaliada em microscópio óptico com aumento de 40 vezes, atribuindo valores de 0 a 100% para essa característica. O teste de motilidade foi realizado em duplicata, sempre pelo mesmo indivíduo. Para a análise da morfologia, foram colocados 5 µl de sêmen em uma lâmina de vidro e adicionados 5 µl do corante eosinanigrosina, sendo feita uma extensão do sêmen na lâmina. Após a secagem da amostra, a lâmina foi avaliada em microscópio óptico, no aumento de 40 vezes. Foram contados cem espermatozóides, categorizados entre normais ou com defeito, e o valor foi expresso em porcentagem de espermatozóides normais. Na análise da concentração espermática, 2 µl de sêmen foram misturados com 2 ml de citrato de sódio 2,9%, homogeneizados e a solução levada ao espectrofotômetro para leitura da densidade ótica e posterior conversão para número de espermatozoides/ml de sêmen. Os dados de características seminais e avaliações biométricas foram submetidos à análise de regressão polinomial com nível de significância de 5%. Os dados de motilidade e morfologia não apresentaram distribuição normal e foram transformados (transformação angular), antes de serem submetidos à análise de regressão. Resultados e discussão A análise de regressão revelou que para as variáveis motilidade e a morfologia espermática, a análise de regressão linear permitiu verificar que existe associação positiva significativa (P<0,05) entre os níveis de inclusão de óleo de linhaça e essas características seminais. O aumento dos níveis de óleo de linhaça na dieta provoca um aumento na motilidade dos espermatozoides e no número de espermatozoides normais. Porém, a concentração espermática não foi influenciada pelos níveis de óleo de linhaça presentes nas dietas (Tabela 2). Estudos realizados por Al-Daraji et al. (2010), testando óleo de girassol, óleo de linhaça, óleo de milho e óleo de peixe sobre as características de fertilidade de codornas machos, concluíram que os animais alimentados com óleo de peixe e óleo de linhaça também obtiveram melhores índices de motilidade e morfologia, além de maior concentração espermática. A melhora na motilidade pode ser explicada pelo fato de que os ácidos graxos do óleo de linhaça (ômega 3) são mais insaturados do que os ácidos graxos do óleo de soja (ômega 6). Esses ácidos graxos fornecidos pela dieta ao animal são incorporados às membranas dos espermatozoides, mudando assim seu perfil lipídico. Segundo Bongalhardo et al. (2009), a cauda do espermatozoide é a região que possui maior quantidade de ácidos graxos poliinsaturados da série 3, e uma maior incorporação desses ácidos, provenientes da dieta, pode ter promovido uma maior motilidade. Na análise das variáveis morfométricas, não foram encontradas associações significativas entre os níveis de inclusão de óleo de linhaça com o peso, o comprimento e a largura dos testículos (Tabela 3). A avaliação do peso dos testículos foi feita com intuito de estimar indiretamente a capacidade reprodutiva das aves, uma vez que testículos maiores apresentam maior capacidade de produção de testosterona e melhor atividade espermática (Amoroso et al., 2008). Hala (2011) verificou que ratos alimentados durante 4 semanas com óleo de linhaça ficaram protegidos contra lesões induzidas por valproato de sódio, aumentando o peso de testículos comparados ao controle. Entretanto, no presente trabalho, as doses estudadas de óleo de linhaça não foram capazes de alterar as medidas biométricas do testículo. Um efeito que pode influenciar o peso dos testículos é a estação do ano. Artoni et al., (1999) analisaram a histologia do testículo de codornas japonesas adultas e verificaram uma evidente variação no peso testicular, Tabela 2 - Motilidade, morfologia e concentração espermática no sêmen de codornas machos submetidas a dietas com diferen-tes níveis de óleo de linhaça OL (%) MO (%) MF (%) CO (x10 9 esp/ml) 0 67,5 95,4 1, ,0 95,9 1, ,0 96,5 1, ,0 96,5 1, ,0 97,5 1,48 P 0,0157 0,0387 0,5411 CV (%) 36,00 32,65 38,08 OL: Óleo de linhaça; MO: Motilidade (%); MF: Morfologia (%); CO: concentração espermática (x10 9 esp/ml); p: nível de significância a 5% pela equação de regressão simples ajustada; motilidade = 0,56-0,00173x; morfologia = 0, , x; CV: coeficiente de variação (%). 179

4 no diâmetro dos túbulos seminíferos, na espessura e na composição do epitélio germinativo, sendo que o maior peso testicular foi detectado no final do outono e no verão (períodos de dias longos). O peso testicular alcançou valor máximo em setembro (período de dias curtos), quando a atividade espermatogênica é muito importante. Como podem ser observadas na Tabela 3, as características biométricas mostram que os testículos esquerdos apresentam-se maiores do que os direitos, independente do tratamento. Amoroso et al. (2008) confirmam que a forma dos testículos é análoga. Sendo assim, nas aves o testículo esquerdo é maior do que o direito. Em codornas, o peso dos testículos equivale a 2,26% do seu peso vivo. Conclusão A substituição do óleo de soja pelo óleo de linhaça na dieta não influencia o desempenho zootécnico, nem o peso, o comprimento e a largura dos testículos em codornas machos. O aumento do teor de óleo de linhaça na dieta das aves resulta em aumento da motilidade espermática e no número de espermatozoides normais, sem alterar a concentração espermática. Bibliografia Al-Daraji HJ, Al-Mashadani HA, Al-Hayani WK, Al- Hassani AS, Mirza HA (2010). Effect of n-3 and n-6 fatty acid supplemented diets on semen quality in japanese quail (Coturnix coturnix japonica). International Journal of Poultry Science 9, Amoroso L, Artoni SMB, Moraes VMB, Perecin D, Franzo VS, Amoroso P (2008). Influência da espermatogênese e dos níveis de testosterona no aspecto reprodutivo de codornas. Revista Brasileira de Zootecnia, 37, Artoni SMB, Orsi AM, Carvalho TL, Vicentini CA, Stefanini MA (1999). Seasonal morphology of the domestic quail (Coturnix coturnix japonica) testis. Anatomy Histology Embryology, 28(4), Aymond WM e Van Elswyk ME (1995). Yolk thiobarbituric acid reactive substances and n-3 fatty acids in response to whole and ground flaxseed. Poultry Science, 74, Blesbois E, Lessire M, Grasseau I, Hallouis HM, Hermier D (1997). Effect of dietary fat on the fatty acid composition and fertilizing ability of fowl semen. Biol Reprod, 56, Bongalhardo DC, Leeson S, Buhr MM (2009). Dietary lipids differentially affect membranes from different areas of rooster sperm. Poultry Science, 88, Cherian G e Sim JS (1991). Effect of feeding full fat flax and canola seeds to laying hens on the fatty embryos, and newly hatched chicks. Poultry Science, 70, Dalton MN (2000). Effect of dietary fats on reproductive performance, egg quality, fatty acid composition of tissues in Japanese quail (Coturnix coturnix japonica). M.Sc. Thesis, Faculty of the Virginia Polytechnic Institute and State University, USA. Dolz S (1996). Utilización de grasas y subproductos lipídicos en monogástricos. In: XII Curso de Especializacion, Madrid: FEDNA. Ferreira D (2010). Desempenho produtivo de codornas europeias (Coturnix coturnix) recebendo níveis crescentes de farelo de palma forrageira, Monografia. UFCG-PB. Garcia EA e Pizzollante CC (2004). Nutrição de codornas para postura. In: II Simpósio Internacional e I Congresso Brasileiro de Coturnicultura, Lavras: Anais, Hala MAW (2011). Protective effect of Nigella sativa, linseed and celery oils against testicular toxicity induced by sodium valproate in male rats. Journal of American Science, 7, Hammerstedt RH (1993). Maintenance of bioenergetic balance in sperm and preservation of lipid peroxidation: a review of the effect on design of storage preservation systems. Reproduction, Fertility and Development Collingwood, 5(6), Kelso KA, Cerolini S, Speake BK, Cavalchini LG, Noble RC (1997). Effects of dietary supplementation with a-linolenic acid on the phospholipid fatty acid composition and quality of spermatozoa in cockerel from 24 to 72 weeks of age. Journal of Reproduction and Fertility, 110 (1), Mather FB e Wilson WO (1964). Post-natal testicular development in Japanese Quail (Coturnix coturnix japonica). Poultry Science, 43, Murakami AE e Ariki J (1998). Produção de codornas japonesas. São Paulo: Funesp. 79p. Oliveira D, Artoni SMB, Moraes VB, Stefanini JA, Oliveira JA, Perecin D (2000). Efeitos dos diferentes níveis de proteína sobre a espermatogênese de codorna (Coturnix coturnix japonica). ARS - Veterinária - Revista de Medicina Veterinária e Zootecnia, 16(2), Tabela 3 - Biometria dos testículos de codornas machos alimentadas com óleo de linhaça OL (%) PTD PTE CTD CTE LTD LTE 0 2,85 3,90 2,55 2,53 1,70 1, ,50 2,88 2,77 2,45 1,45 1, ,75 3,55 2,51 2,46 1,51 1, ,75 3,35 2,80 2,68 1,58 1, ,70 3,40 2,64 2,54 1,63 1,73 P* 0,38 0,51 0,58 0,41 0,92 0,74 CV (%) 25,39 26,61 12,38 11,44 11,13 10,40 OL: óleo de linhaça; PTD: peso testículo direito (g) ; PTE: peso testículo esquerdo (g) ; CTD: comprimento testículo direito (cm); CTE: comprimento testículo esquerdo (cm); LTD: largura testículo direito (cm); LTE: largura testículo esquerdo (cm). P*:nível de significância a 5% pela equação de regressão simples ajustada; CV: coeficiente de variação (%) 180

5 Robertson L, Brown HL, Staines HJ, Wishart GJ (1997). Characterization and application of an avian in vitro spermatozoa- egg interaction assay using the inner perivitelline layer from laid chicken eggs. Journal of Reproduction and Fertility, 110, Singh RV e Narayan R (2002). Produção de codornas nos trópicos. In: Simpósio Internacional de Coturnicultura, Lavras: Anais, Lavras: Universidade Federal de Lavras, Surai PF, Noble RC, Sparks NH, Speake BK (2000). Effect of long-term supplementation with arachidonic or docosahexaenoic acids on sperm production in the broiler chicken. J Reprod Fertil, 120(2), Zambiazi RC, Przybylski R, Zambiazi MW, Mendonça CB (2007). Fatty acid composition of vegetable oils and fats. Boletim do Centro de Pesquisa e Processamento de Alimentos, 25(1),