Identification of Aspergillus Species and Toxigenic Potential of Aspergillus flavus Isolated from Commercial Feed

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1 DOI: Identificação de Espécies de Aspergillus e Potencial Toxígeno de Aspergillus flavus Isolados de Rações Comerciais Verbena Carvalho Alves 1, Francisco das Chagas Cardoso Filho 2, Maria Marlucia Gomes Pereira 3, Amilton Paulo Raposo Costa 3, Maria Christina Sanches Muratori 3 Resumo: As aflatoxinas são micotoxinas produzidas principalmente por fungos das espécies Aspergillus flavus A. parasiticus e A. nomius, que são potencialmente capazes de produzir contaminação direta em uma grande variedade de alimentos. Este trabalho teve como objetivo identificar as espécies do gênero Aspergillus e avaliar o potencial toxigênico das cepas de Aspergillus flavus capazes de produzir aflatoxinas em ração para animais. A pesquisa foi desenvolvida com amostras de ração comercializadas em casas agropecuárias da cidade de Teresina, PI. Em cada um dos três estabelecimentos comerciais sorteados foram coletadas cinco amostras de rações para suínos, cinco para aves e cinco para cães com 500 g, totalizando 45 amostras, para a realização da identificação das espécies de Aspergillus e verificação da capacidade produtora de aflatoxinas pelas cepas de A. flavus. Todas as cepas de A. flavus foram analisadas, quanto à capacidade de produzirem aflatoxina, porém nenhuma das cepas apresentou potencial toxígeno. Conclui-se que foi possível isolar Aspergillus flavus, Aspergillus niger agregados, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamarii, Aspergillus candidus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus e Aspergillus uniseriados nas rações analisadas. Palavras-chave: alimentação animal, fungos, micotoxinas, toxicidade Identification of Aspergillus Species and Toxigenic Potential of Aspergillus flavus Isolated from Commercial Feed Abstract: Aflatoxins are mycotoxins mainly produced by fungi of the Aspergillus flavus species A. parasiticus and A. nomius, which have the potential of producing direct contamination in a great variety of food. The objective of this research was to identify the species of the Aspergillus genus and to evaluate the toxigenic potential of the Aspergillus flavus strains that are capable of producing aflatoxins in animal feed. This research was conducted with commercial feed samples sold in feed stores in the city of Teresina PI. In each of the three randomly selected commercial establishment five feed samples for swine, five for poultry and five for dogs were collected weighting 500g, in a total of 45 samples, for identification of the Aspergillus species and aflatoxin-producing capacity of the A. flavus strains. All of the A. flavus strains were analyzed, regarding their aflatoxin producing capacity. However, none of the strains presented toxigenic potential. It was concluded that it was possible to isolate Aspergillus flavus, Apergillus niger aggregate, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamarii, Aspergillus candidus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus and Aspergillus uniseriated in the analyzed feed. Key words: fungi, mycotoxins, animal food, toxicity 1 Programa de Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição, Universidade Federal do Piauí (nena_carvalho@hotmail.com) 2 Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Universidade Federal do Piauí 3 Departamento de Morfofisiologia Veterinária, Universidade Federal do Piauí

2 Rev. Cient. Prod. Anim., v.16, n.2, p , 2014 Introdução A contaminação dos alimentos por fungos e outros micro-organismos é considerada um dos fatores de risco para a saúde dos animais, pela possível presença de micotoxinas produzidas por eles. Essa contaminação pode ocorrer desde a produção, armazenamento da matéria-prima de origem animal e de grãos, que são amplamente utilizados na fabricação de rações para várias espécies animais, até a industrialização e embalagem do produto final (Brito, 2009). Os fungos têm sido evidenciados como microorganismos de grande importância para a indústria de alimentos. Essa contaminação por fungos pode causar inúmeras perdas econômicas associadas à redução de nutrientes, da palatabilidade e, quando em condições favoráveis, algumas espécies podem produzir micotoxinas, podendo afetar tanto a saúde humana como a animal (Dantigny et al., 2005; Pereira et al., 2005). A evidência desses na ração não significa necessariamente a presença de micotoxinas, entretanto, elevadas contagens fúngicas pode ser indicativo de que exista micotoxinas no alimento (FAO, 2004). Os fungos do gênero Aspergillus habitam uma variedade de ambientes, sendo o solo e alimentos os mais frequentes. As espécies desse gênero podem causar impacto negativo na economia tanto pela produção de toxinas potentes, quanto pela deterioração de alimentos (Klich e Pitt, 1988; Samson et al., 2001; Ribeiro et al., 2003, Pitt e Hocking, 2009). A presença de fungos do gênero Aspergillus em rações representa um perigo potencial, pois pode ocasionar enfermidades nos trabalhadores que diretamente estão em contato com ela, como a aspergilose (Akan et al., 2002), alergias e problemas respiratórios pelo contato e inalação de conídios. As aflatoxinas são micotoxinas produzidas principalmente por fungos das espécies Aspergillus flavus, A. parasiticus e A. nomius, que são potencialmente capazes de produzir contaminação direta em uma grande variedade de alimentos (Reddy et al., 2009; Roigé et al., 2009; Fernández-Cruz et al., 2010). Existem diversos tipos de aflatoxinas, sendo que a aflatoxina B1 é a mais prevalente e biologicamente ativa dentre as aflatoxinas, e é considerado o mais potente hepatotóxico e carcinogênico, alem de ser um imunossupressor natural conhecido por afetar humanos e animais (Creppy, 2002; Williams et al., 2004). Seus efeitos variam com a espécie, idade, sexo e estado nutricional (Cast, 2003), ela possui características nefrotóxicas, mutagênicas, teratogênicas e também causam encefalopatias. Tem sido identificada como fator associado ao câncer hepático, após a ingestão de alimentos contaminados, tanto em animais como no homem (Ferreira et al., 2006). A ocorrência de aflatoxinas em ração é presente em vários estados do Brasil; Minas Gerais (Pereira et al., 2005), São Paulo (Oliveira et al., 2006), Rio de Janeiro (Keller et al., 2007) e Piauí (Cardoso Filho et al., 2013). Os sinais da intoxicação por aflatoxinas dependem principalmente de sua concentração no alimento, do tipo de aflatoxina e do tempo de ingestão (Ogido et al., 2004), são altamente cancerígenas e podem causar toxicidade aguda quando em concentrações elevadas (Khanafari et al., 2007). Além disso, produzem efeitos mutagênicos, teratogênicos e imunossupressores (Murthy et al., 2005). Portanto são motivo de grande preocupação devido aos seus efeitos nocivos sobre a saúde dos seres humanos e animais, também caracterizada pela imunodepressão e por anomalias ósseas, hemorragias e despigmentação (Miazzo et al., 2005). Tendo em vista os aspectos mencionados, este trabalho tem como objetivo identificar as espécies do gênero Aspergillus e avaliar o potencial toxigênico das cepas de A. flavus isoladas de rações comerciais. 132

3 Material e Métodos A pesquisa foi desenvolvida com amostras de ração comercializadas em casas agropecuárias da cidade de Teresina, PI. Para efeito de pesquisa, foram sorteados randomicamente três estabelecimentos comerciais para coleta de cinco amostras de rações para suínos, cinco para aves e cinco para cães com 500 g cada, totalizando 45 amostras, para a realização da identificação das espécies de Aspergillus e avaliação do potencial toxígeno das cepas de A. flavus. As análises foram realizadas no Laboratório de Controle Microbiológico de Alimentos, do Núcleo de Estudos e Pesquisas de Processamento em Alimentos (NUEPPA), da Universidade Federal do Piauí UFPI. Foram pesadas assepticamente 25 g das amostras e transferidas para 225,0 ml de água destilada esterilizada para a obtenção da diluição Em seguida foram preparadas diluições decimais até Após, alíquotas de 0,1 ml de cada uma das diluições, foram inoculadas em placas de Petri em duplicata contendo o agar Dichloran Rose Bengal Cloranfenicol (DRBC), (Pitt e Hocking, 2009). Posteriormente foram incubadas a 25º C por sete dias, em ausência de luz. As contagens fúngicas foram realizadas nas placas que apresentaram entre 10 a 100 UFC/g (Dalcero et al., 1998). Após, as colônias do gênero Aspergillus foram isoladas e repicadas em tubos contendo agar extrato de malte (MEA). A identificação das espécies foi realizada de acordo com a chave taxonômica de Klich (2002); Pitt (1988), respectivamente. As cepas de Aspergillus flavus isoladas foram cultivadas em placas MEA a 25 ºC por sete dias e testadas quanto à produção de aflatoxinas. O micélio foi transferido para um tubo Eppendorf juntamente com 1000 μl de clorofórmio. A mistura foi agitada a 4000 rpm por 20 minutos em temperatura ambiente, o micélio foi removido e o extrato de clorofórmio evaporado sob fluxo de N 2. O resíduo foi redissolvido Rev. Cient. Prod. Anim., v.16, n.2, p , 2014 em 200 μl de clorofórmio. Os extratos foram analisados por cromatografia em camada delgada (CCD) de acordo com Soares e Rodriguez-Amaya (1989), em sílica gel 60 F254, TLC chapas de alumínio (20 x 20 cm, espessura, 250 μm, Merck, Alemanha). O liquido carreador foi o tolueno, acetato de etilo e ácido fórmico (50:40:10). O limite de detecção do método utilizado é de 5 mg/g. Resultados e Discussão Na Tabela 1 se observam as frequências de ocorrência das espécies do gênero Aspergillus spp. Nas amostras de ração analisadas foi possível identificar as seguintes espécies: A. flavus, A. niger agredados, A. uniseriados, A. candidus, A. ochraceus, A. oryzae, A. tamarii e A. terreus (Tabela 1). A espécie predominante foi o A. flavus, esta predominância também foi verificada em ração por Dalcero et al. (1998); Magnoli et al. (1998); Accensi et al. (2004), Cardoso Filho et al. (2013), entretanto para Calvet (2015) as espécies predominantes foram A. terreus e A. ochraceus. Estes relatos são preocupantes pelo potencial micotoxigênico que a espécie A. flavus possui e pelas possíveis consequências para a produção animal. Em um estudo realizado por González-Pereyra et al. (2008) na Argentina com rações para suínos, foi Tabela 1. Densidade relativa (%) de espécies de Aspergillus isoladas das amostras de ração para animais 133

4 Rev. Cient. Prod. Anim., v.16, n.2, p , 2014 encontrado A. flavus, A. niger e A. parasiticus como os mais isolados. Fraga et al. (2007) analisaram amostras de milho e de rações para diferentes estágios de criação de frangos de corte no estado do Rio de Janeiro e encontraram as espécies A. flavus e A. candidus na ração inicial. Já nas amostras de ração de terminação os mais freqüentes foram novamente A. flavus, A. niger, A. sydowii e A. versicolor. Todas as cepas de A. flavus foram analisadas, quanto à capacidade de produzirem aflatoxina, porém nenhuma das cepas demonstrou capacidade toxígena. A importância dessa verificação é que caso fossem produtoras seria um grande risco a saúde desses animais por levarem a uma diminuição da velocidade do crescimento e na eficiência alimentar, causados pela redução do metabolismo proteico e absorção de gorduras e a supressão da resposta imune (Keller, 2007), além de possuir características tóxicas aos animais e ao homem. Em trabalho realizado por Cardoso Filho et al., (2013), analisando 36 amostras de rações para peixe, também não foi detectada a produção de aflatoxinas. Por outro lado, Copetti (2005) analisando rações para cães e gatos, verificou que 20% (2/10) dos isolados de Aspergillus flavus eram produtores de aflatoxina B1. A presença de Aspergillus flavus e de outras espécies produtoras de micotoxinas em rações tem sido evidenciada com frequência, o que torna imprescindível os cuidados no armazenamento da ração e dos ingredientes utilizados para sua formulação. Conclusões Foi possível isolar Aspergillus flavus, Aspergillus niger agregados, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamarii, Aspergillus candidus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus e Aspergillus uniseriados nas rações analisadas. Dentre as cepas isoladas de A. flavus, nenhuma das cepas demonstrou capacidade toxígena. Referências Bibliográficas ACCENSI, F., ABARCA,M. L.; CABAÑES,F. J. Occurrence of Aspergillus species in mixed feeds and component raw materials and their ability to produce ochratoxin A. Food Microbiology, v. 21, p , AKAN, M.; HAZIROGLU, R.; ILHAN, Z.; SAREYYÜPOGLU, B.; TUNCA, R. A case of 9 aspergillosis in a broiler breeder flock. Avian Diseases, v.42, n.2, p , abr/jun, BRITO, C. B. M. de. Efeito de diferentes níveis de umidade com e sem utilização de antifúngico em dietas para cães f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Disponível em: < c3sl.ufpr.br/dspace/bitstream/handle/1884/18027/ dissertacao_completa_cleusa.pdf?sequence=1> Acesso em: 26 set CALVET, R. M., PEREIRA,M.M.G., COSTA, A.P.R., TORRES, A.M., MURTORI, M.C.S. Toxigenic mycobiota and mycotoxins in shrimp feed.cienc. Rural [online] CARDOSO FILHO, F.C.C. CALVET, R.M., ROSA, C.A.R. PEREIRA, M.M.G., COSTA, A.P.R. e MURATORI, M.C.S. Monitoramento de fungos toxigênicos e aflatoxinas em rações utilizadas na piscicultura. Ciência Animal Brasileira. Goiânia, v.14, n.3, p , jul./set CAST. Council for Agricultural Science and Technology. Mycotoxins: risks in plant, animal and human systems. Task Force Report, n.139, Ames, Iowa, USA, COPETTI, M. V. Avaliação micológica de rações comerciais para cães e gatos e potencial micotoxigênico de espécies selecionadas f. 134

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