UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA E MORFOMÉTRICA EM POPULAÇÕES DE Leptodactylus fuscus SCHNEIDER, 1799 E Leptodactylus latrans STEFFEN, 1815 (ANURA, LEPTODACTYLIDAE) EM ÁREAS DE CAATINGA DO ESTADO DE SERGIPE BETEJANE DE OLIVEIRA MESTRADO 2011

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E CONSERVAÇÃO MESTRADO EM ECOLOGIA E CONSERVAÇÃO CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA E MORFOMÉTRICA EM POPULAÇÕES DE Leptodactylus fuscus SCHNEIDER, 1799 E Leptodactylus latrans STEFFEN, 1815 (ANURA, LEPTODACTYLIDAE) EM ÁREAS DE CAATINGA DO ESTADO DE SERGIPE AUTORA: BETEJANE DE OLIVEIRA ORIENTADOR: SILMARA DE MORAES PANTALEÃO CO-ORIENTADOR: RENATO GOMES FARIA SÃO CRISTÓVÃO, SERGIPE MARÇO, 2011

3 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE O48c Oliveira, Betejane de Caracterização citogenética e morfométrica em populações de Leptodactylus fuscus Schneider, 1799 e Leptodactylus latrans Steffen, 1815 (Anura, Leptodactylidae) em áreas de caatinga do Estado de Sergipe / Betejane de Oliveira. - São Cristóvão, f.: il. Dissertação (Mestrado em Ecologia e Conservação) Núcleo de Pós-Graduação em Ecologia e Conservação, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Universidade Federal de Sergipe, Orientadora: Silmara de Moraes Pantaleão. 1. Leptodactylus fuscus. 2. Leptodactylus latrans. 3. Citogenética. 4. Ecologia animal - Sergipe. I. Título. CDU 597.8:591.5(813.7)

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5 Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas usadas, que já tem a forma do nosso corpo, e esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre aos mesmos lugares. É o tempo da travessia: e, se não ousarmos fazê-la, teremos ficado, para sempre, à margem de nós mesmos. Fernando Pessoa Grandes resultados não podem ser seguidos de uma vez, e devemos ficar satisfeitos a avanços na vida assim como caminhamos passo a passo Samuel Smiles ii

6 AGRADECIMENTOS Difícil, neste momento, achar palavras para expressar meus sinceros agradecimentos a todos que de alguma forma me ajudaram, incentivaram e contribuíram para a realização deste trabalho. Quero dizer-lhes que é com muita alegria e gratidão que chego a mais uma etapa da minha vida e que vocês foram fundamentais neste percurso. Meus agradecimentos... A Deus, por toda graça e força que me tem concedido. À minha mãe, pela paciência e amor incondicional. E à minha família, que esteve sempre comigo. À minha orientadora e amiga Prof a Dr a Silmara Pantaleão, pela confiança depositada, orientação, conversas descontraídas e coragem de arriscar comigo neste primeiro trabalho de citogenética e morfometria de anfíbios do nosso Estado. Aos professores Dr. Renato Faria e Dr. Ricardo Scher, pelos momentos de aprendizado. Aos colegas de curso, aqueles que me ajudaram em coletas e mesmo aqueles que não conviveram mais próximos de mim, pelas experiências trocadas em sala e no meio dos corredores. Aos colegas de Laboratório, os quais estiveram comigo diariamente e que acompanharam muitas vezes minhas angústias em meio aos experimentos. Aos colegas Anthony, Daniel, David e também a estagiária Maysa, que permaneceu do início ao fim comigo, pela grande ajuda durante as cansativas coletas e dia inteiro de experimentos. Ao motorista Amaral (UFS), pela grande ajuda nas coletas aventureiras. Ao Sr. Didi e sua família por nos receber em sua casa sempre tão bem. Por fim, mas não menos importante, meu agradecimento de coração a Prof a Dr a Sanae Kasahara, por todo acolhimento em sua cidade e em seu curso de Citogenética e também pela disposição em me auxiliar neste trabalho. Agradeço aos seus alunos Simone e Tiago, pela ajuda prática em laboratório e pelas trocas de experiências. Agradeço a CAPES pelo apoio financeiro através da bolsa concedida. A todos que de alguma forma contribuíram para este maravilhoso trabalho, muito obrigada! iii

7 SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS ABSTRACT RESUMO v vii x xi xii CAPÍTULO 1 - Introdução 13 CONSIDERAÇÕES GERAIS 14 Justificativa 20 Objetivos 23 Material Coletado 24 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 24 CAPÍTULO 2 Análise Citogenética 31 Análise citogenética de populações de Leptodactylus fuscus (Schneider, 1799) e 32 Leptodactylus latrans (Steffen, 1815) (Anura, Leptodactylidae) ABSTRACT 32 RESUMO 33 INTRODUÇÃO 34 MATERIAIS E MÉTODOS 38 Animais 38 Obtenção das metáfases e técnicas empregadas 39 Leitura das lâminas e montagem do cariograma RESULTADOS DISCUSSÃO 48 CONCLUSÃO 51 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 51 CAPÍTULO 3 Análise Morfométrica 59 Análise morfométrica de populações de Leptodactylus fuscus (Schneider, 1799) e 60 Leptodactylus latrans (Steffen, 1815) (Anura, Leptodactylidae) ABSTRACT 60 RESUMO 61 INTRODUÇÃO 62 MATERIAIS E MÉTODOS 65 Animais 65 Análises Morfométricas 67 RESULTADOS 68 DISCUSSÃO 73 CONCLUSÃO 77 CONSIDERAÇÕES FINAIS 78 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 79 APÊNDICE 85 iv

8 LISTA DE ABREVIATURAS 2n: Número diploide ACA: Altura da cabeça ACO: Altura do corpo ACP: Análise dos componentes principais Ag-RON: Técnica de marcações das regiões organizadoras de nucléolo pelo nitrato de prata Banda C: Técnica de marcação de regiões heterocromáticas CAB: Comprimento do antebraço CB: Comprimento do braço CC: Comprimento da cabeça CCX: Comprimento da coxa CM: Comprimento da mão CP: Comprimento do pé CPE: Comprimento da perna CRC: Comprimento rostro-cloacal altura DI: Distância internasal DIO: Distância interocular DNA: Ácido desoxirribonucleico DO: Diâmetro do olho DON: Distância olho-narina DT: Diâmetro do tímpano IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IUCN: União Internacional para a Conservação da Natureza NF: Número Funcional KCl: Cloreto de potássio LAB: Largura do antebraço LB: Largura do braço LC: Largura do corpo LCA: Largura da cabeça LPE: Largura da perna LCX: Largura da coxa v

9 M: Molar MMA: Ministério do Meio Ambiente MZUSP: Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo ph: Potencial Hidrogeniônico RNAr: Ácido Ribonucleico Ribossômico rpm: Rotação por minuto SISBIO: Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade vi

10 LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 1 Figura 1.1: Distribuição geográfica de Leptodactylus fuscus (Reynolds et al., 2004 in IUCN, 2010). Figura 1.2: Leptodactylus latrans (Steffen, 1915), neotipo (MNRJ 30733). A: Vista dorsal da cabeça; B: vista lateral da cabeça; C: mão D: pé (Lavilla et al., 2010). Figura 1.3: Distribuição geográfica de Leptodactylus latrans: América do Sul Cisandina (Heyer et al., 2008 in IUCN, 2010). Figura 1.4: Distribuição do Bioma Caatinga (modificado, MMA, 2010). CAPÍTULO 2 Figura 2.1: Imagens de animais provenientes de Poço Redondo SE: (A) Leptodactylus fuscus; (B) Leptodactylus latrans. CRC de L. fuscus: 44 mm e CRC de L. latrans: 53 mm (Foto: Betejane de Oliveira). Figura 2.2: Área de estudo e sua localização relativa no Brasil e no Estado de Sergipe - municípios de Poço Redondo, Carira e Tobias Barreto. (Modificado, Figura 2.3: Cariogramas com coloração convencional: (A) Leptodactylus fuscus de Poço Redondo e (B) Leptodactylus fuscus de Tobias Barreto, SE. Notar constrição secundária no par cromossômico 8, indicada pela seta. vii

11 Figura 2.4: Padrão de distribuição de Banda C em (A) Leptodactylus fuscus de Poço Redondo e (B) Leptodactylus fuscus de Tobias Barreto, SE. Em (B), par cromossômico 4, observa-se variação na quantidade de heterocromatina entre os homólogos. Figura 2.5: Metáfases mostrando a localização das Ag-RONs (seta). (A) Leptodactylus fuscus de Poço Redondo e (B) Leptodactylus fuscus de Tobias Barreto, SE. Notar a presença de RONs no braço curto do par 8 (A.1 e B.1). Figura 2.6: Cariótipos em coloração convencional. (A) L. latrans de Carira, (B) L. latrans de Poço Redondo e (C) L. latrans de Tobias Barreto, SE. Figura 2.7: Padrões de bandamento C em (A) Leptodactylus latrans de Poço Redondo e (B) Leptodactylus latrans de Tobias Barreto, SE. Notar associação entre os homólogos do par 8 em A. Figura 2.8: Metáfases destacando a localização das RONs (setas). (A) Leptodactylus latrans de Poço Redondo e (B) Leptodactylus latrans de Tobias Barreto, SE. Destaque: A.1, RONs no braço curto do par 8; B.1, presença de RONs associadas. CAPÍTULO 3 Figura 3.1: Imagens de animais provenientes da Unidade de Conservação Estadual Monumento Natural Grota do Angico do município de Poço Redondo SE: (A) Leptodactylus latrans; (B) Leptodactylus fuscus. CRC de L. fuscus: 44 mm e CRC de L. latrans: 53 mm (Foto: Betejane de Oliveira). Figura 3.2: Área de estudo e sua localização relativa no Brasil e no Estado de Sergipe - municípios de Poço Redondo, Carira e Tobias Barreto. (Modificado, viii

12 Figura 3.3: Características morfológicas: CC, comprimento da cabeça; ACA, altura da cabeça; LCA, largura da cabeça; DON, distância olho-narina; DIO, distância interocular; DO, diâmetro do olho; DI, distância internasal; DT, Diâmetro do tímpano; CRC, comprimento rostro-cloacal; ACO, altura do corpo; LC, largura do corpo; LB, largura do braço; CB, comprimento do braço; LAB, largura do ante-braço; CAB, comprimento do ante-braço; CM, comprimento da mão; LCX, largura da coxa; CCX, comprimento da coxa; LPE, largura da perna; CPE, comprimento da perna; CP, comprimento do pé (Desenho: Betejane de Oliveira). Figura 3.4: Projeção dos escores individuais resultantes da Análise dos Componentes Principais (ACP) para as variáveis morfométricas de exemplares adultos de Leptodactylus fuscus e Leptodactylus latrans provenientes dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. APÊNDICE CAPÍTULO 1 Figura A 1.1: Lagoas temporárias onde foram realizadas as coletas de L. fuscus e L. latrans. A: Carira, B: Poço Redondo e C: Tobias Barreto, SE. CAPÍTULO 3 Figura A 3.1: Diferenças em relação à massa, utilizando a análise de variância para dois fatores (espécie e área) seguida do Teste de Tukey (p < 0,05), nas espécies L. fuscus (A) e L. latrans (B) dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. Figura A 3.2: Diferenças em relação o CRC, utilizando a análise de variância para dois fatores (espécie e área) seguida do Teste de Tukey (p < 0,05), nas espécies L. fuscus (A) e L. latrans (B) dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. ix

13 Figura A 3.3: Resultado da análise de variância para os fatores (espécie e área) adotando o primeiro componente principal (PC1) com o Teste de Tukey (p < 0,05), nas espécies L. fuscus e L. latrans dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 3 Tabela 3.1: Relação das espécies, localidade, sexo e número de exemplares analisados. Tabela 3.2: Estatística descritiva das variáveis morfométricas de indivíduos de L. fuscus e L. latrans dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. Medidas lineares são dadas em milímetros e a massa em gramas. Tabela 3.3: Diferenças em relação à Massa e CRC, utilizando a análise de variância para dois fatores (espécie e área) seguida do Teste de Tukey (p < 0,05), para as espécies L. fuscus e L. latrans dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. Tabela 3.4: Escores dos cinco primeiros Componentes Principais para caracteres morfométricos de L. fuscus e L. latrans dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. Tabela 3.5: Resultado da análise de variância para os fatores (espécie e área) adotando o primeiro componente principal (PC1) com o Teste de Tukey (p < 0,05), para as espécies L. fuscus e L. latrans dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. Tabela 3.6: Resultado da análise de variância para os fatores (espécie e área) adotando o segundo componente principal (PC2) com o Teste de Tukey (p < 0,05), para as espécies L. fuscus e L. latrans dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. x

14 ABSTRACT The genus Leptodactylus has wide distribution and it can be found in many physiographic and climatic zones. This fact has raised questions about the taxonomy of this genus because many species that are considered of great geographic distribution has shown to be two or more closely related. The species Leptodactylus fuscus and Leptodactylus latrans, both widely spread, are found in the state of Sergipe in the Caatinga biome and little is known about the ecology, biology and diversity between and within populations that occupy this exclusively Brazilian biome. Therefore, the present study aimed to characterize the species L. fuscus and L. latrans, which occur in different fragments of Caatinga from the state of Sergipe, using cytogenetic and morphometric data. The karyotypes of populations from the municipalities of Carira, Poço Redondo and Tobias Barreto were analyzed by conventional staining techniques, C-band and Ag-RON. The species showed similar cytogenetic patterns, without evidence of species-specific markers; however some variations in morphology and bands were observed when compared to the karyotypes described in the literature. In morphometric analysis, 21 different characters were analyzed in the two species in each location, showing that populations of L. fuscus presented no significant differences between them; however variations were found in samples of L. latrans, mainly on the size of the specimens. The analyzed data showed that there were no cytogenetic and morphometric differences within the L. fuscus populations and that the morphometric variations observed in L. latrans may be due to environmental effects. Keywords: Cytogenetic, morphometry, Leptodactylus fuscus, Leptodactylus latrans, Caatinga. xi

15 RESUMO GERAL O gênero Leptodactylus tem ampla distribuição geográfica e está presente nas mais diversas zonas climáticas e fisiográficas. Esse fato tem levantado questionamentos de caráter taxonômico, pois muitas espécies consideradas de grande distribuição geográfica têm mostrado tratar-se de duas ou mais espécies estreitamente relacionadas. As espécies Leptodactylus fuscus e Leptodactylus latrans, ambas de ampla distribuição, são encontradas no Estado de Sergipe no bioma Caatinga e pouco se conhece sobre a ecologia, biologia e diversidade inter e intrapopulacional em populações que ocupam este bioma exclusivamente brasileiro. Nesse sentido, o presente estudo teve como objetivos caracterizar através de dados citogenéticos e morfométricos as espécies L. fuscus e L. latrans de ocorrência em diferentes fragmentos de Caatinga do Estado de Sergipe. Os cariótipos das populações dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto foram analisados, por meio de técnicas de coloração convencional, Banda C e Ag-RON. Os exemplares estudados apresentaram padrões citogenéticos bastante similares, sem evidências de marcadores espécie-específicos; porém, algumas variações de morfologia e bandas foram observadas quando comparadas aos cariótipos já descritos na literatura. Nas análises morfométricas, 21 caracteres foram analisados nas duas espécies, em cada uma das localidades, mostrando que as populações de L. fuscus não apresentaram diferenças significativas entre elas; contudo variações foram encontradas nas amostras de L. latrans, principalmente quanto ao tamanho dos espécimes coletados. Os dados analisados conjuntamente mostram que populações de L. fuscus não diferem citogenética e morfometricamente entre si e as variações morfométricas observadas em L. latrans podem ser devidas aos efeitos ambientais. Palavras-chave: Citogenética, morfometria, Leptodactylus fuscus, Leptodactylus latrans, Caatinga. xii

16 Capítulo 1 Introdução 13

17 CONSIDERAÇÕES GERAIS No mundo são conhecidas 6771 espécies de anfíbios, dentre elas 5966 são da ordem Anura, representando assim o maior grupo desse reino (Frost, 2011). O Brasil é o país com maior riqueza de espécies de anfíbios, seguido por Colômbia e Equador. No território brasileiro já foram identificadas 875 espécies de anfíbios, sendo que 847 são Anuros, 1 Caudata e 27 Gymnophionas (SBH, 2011). De acordo com Frost (2011), a classe Amphibia está dividida em três ordens (Anura, Caudata e Gymnophiona) e, aproximadamente, sessenta e uma famílias. A ordem Anura é a mais abundante, com 49 famílias e 5966 espécies, encontradas em todo o globo, com exceção na Antártida e em algumas ilhas oceânicas. A Caudata tem nove famílias e 619 espécies e a Gymnophiona subdivide-se apenas em três famílias, com 186 espécies. Devido ao grande número de espécies e à variação morfológica dos animais, incluindo variação no padrão de coloração, dentre outras características, as relações filogenéticas em anfíbios não estão bem estabelecidas e têm sido objeto de estudo de várias pesquisas, provocando diversas mudanças taxonômicas dentro dos grupos (Angulo et al., 2003; Heyer, 2005; Frost et al., 2006; Grant et al., 2006; Hedges et al., 2008; Guayasamin et al., 2009). Diversas tentativas de agrupamento já foram realizadas com relação aos leptodactylídeos (Lynch, 1971; Heyer, 1975, Frost, 1985), porém, ainda há controvérsias quanto à classificação de algumas espécies. Inicialmente a família Leptodactylidae foi dividida em quatro subfamílias (Ceratophryinae, Hylodinae, Leptodactylinae e Telmatobiinae) e considerada como um grupo parafilético, já que a mesma não apresentava sinapomorfias evidentes (Frost, 1985; Ford & Cannatella, 1993), além de ser classificada como uma das famílias com maior diversidade entre os anuros, pois continha 1243 espécies, em sua maioria alocada na subfamília Eleutherodactylinae. Em 2006, surge a primeira hipótese evolutiva para toda a classe Amphibia, proposta por Frost et al., baseada principalmente em dados moleculares. De acordo com a última atualização do catálogo on-line das espécies de anfíbios de Frost (2011), a família Leptodactylidae não é mais dividida em subfamília, compreende 14

18 quatro gêneros (Hydrolaetare, Leptodactylus, Paratelmatobius e Scythrophrys) e 100 espécies, com distribuição principalmente na região Neotropical. Os representantes são, em geral, de pequeno e médio porte, insetívoros, terrestres ou semi-aquáticos e de atividade noturna. O gênero Leptodactylus (Fitzinger, 1826) compreende 89 espécies distribuídas no Sul da América do Norte, América do Sul e nas Índias Ocidentais; há também espécies endêmicas de ilhas situadas entre o Caribe e o Atlântico, incluindo as Antilhas e Bahamas (Frost, 2011). As espécies de Leptodactylus foram divididas inicialmente com base na morfometria e no comportamento, em cinco grupos de espécies: L. fuscus, L. melanonotus, L. ocellatus, L. pentadactylus e L. marmoratus (Heyer, 1969). Nos últimos anos, houve um aumento significativo nos estudos sobre a anurofauna (Silva et al., 2005; Lucas et al., 2008), muitas espécies novas foram descritas e várias dessas espécies ainda não foram incluídas nos grupos de espécies tradicionais. Em relação a Leptodactylus, hipóteses filogenéticas sugeriram a necessidade de se testar o monofiletismo do gênero, assim como, confirmar grupos de espécies já conhecidos. Algumas análises mostraram que Leptodactylus era parafilético no que se refere aos gêneros Adenomera, Lithodytes e Vanzolinius (Heyer 1998). Larson & De Sá (1998) descreveram 26 caracteres em 22 espécies de Leptodactylus, nove pertencentes ao grupo L. fuscus, e confirmaram o parafiletismo do gênero sendo, então, proposto o remanejamento de algumas espécies dentro de cada agrupamento. Frost et al. (2006), porém, ratificaram o monofiletismo de gênero considerando Adenomera (Steindachner, 1867) como um sinônimo de Lithodytes (Fitzinger, 1843) e como subgênero de Leptodactylus. A divisão das espécies de Leptodactylus nos agrupamentos reconhecidos por Heyer (1969) foi mantida, porém, com várias espécies, principalmente aquelas dos antigos gêneros Adenomera, Lithodytes e Vanzolinius, não sendo alocadas em nenhum dos grupos estabelecidos (Frost et al., 2006; Kwet, 2001). Espécies do grupo L. fuscus foram caracterizadas historicamente pelas seguintes sinapomorfias: machos com fronteiras bem definidas na maxila e focinho, apenas um saco vocal interno, ausência de espinhos córneos nos dedos, braços igualmente desenvolvidos em ambos os sexos; óvulos branco-amarelados, construção de câmaras subterrâneas e 15

19 oviposição em ninhos de espuma (Gallardo, 1964). Todavia, essas análises não foram conclusivas, o grupo foi mal representado e assim a sua filogenia não foi resolvida. Em 2008, Ponssa em seu trabalho concluiu que o grupo L. fuscus é monofilético, sendo mais estritamente relacionado com L. pentadactylus do que aos demais grupos de espécies do gênero. Leptodactylus fuscus, conhecida popularmente como rã-assobiadeira, apresenta porte médio para o gênero, focinho longo e obtuso em vista dorsal; alguns espécimes podem apresentar uma linha dorsal clara e a íris é sempre bronze (Bastos et al., 2003). É uma espécie terrestre e noturna, encontrada em campos abertos, savanas, pastagens, áreas pantanosas, florestas degradadas e hábitats urbanos (Reynolds et al., 2004) Sua distribuição é ampla na América do Sul e Central (Figura 1.1), sendo encontrada desde o Panamá até a Argentina (Frost, 2011). Figura 1.1: Distribuição geográfica de Leptodactylus fuscus (Reynolds et al., 2004 in IUCN, 2010). Nas espécies de anuros denominadas por Linnaeus (1758) há frequentemente breve descrição seguida de uma distribuição geográfica ambígua, além de palavras sinônimas 16

20 citadas por outros autores. No caso de Rana ocellata, uma das espécies neotropicais incluídas por Linneus na décima edição de seu Systema Naturae (Linnaeus, 1758), existe uma longa história de equívocos e erros de identificação. Uma das tentativas de resolver esses problemas foi realizado Lavilla et al. (2010) que, em uma revisão sobre nomenclatura, concluíram que a espécie Rana ocellata Linnaeus, 1758 referia-se à Osteopilus brunneus Gosse, 1851 da Jamaica, enquanto que o táxon conhecido como Leptodactylus ocellatus correspondia a Rana latrans Steffen, A Comissão Interacional de Nomenclatura Zoológica (ICZN, processo 3323) conservou o nome Leptodactylus ocellatus pela designação do neotipo Rana ocellata Linnaeus, Assim, foi revalidada uma nova combinação para a espécie, denominanda Leptodactylus latrans Steffen, Para a espécie Osteopilus ocellatus Linnaeus, 1758, uma nova combinação foi realizada e a classificaram como sinônimo de Osteopilus brunneus Gosse, Figura 1.2: Leptodactylus latrans (Steffen, 1915), neotipo (MNRJ 30733). A: Vista dorsal da cabeça; B: vista lateral da cabeça; C: mão D: pé (Lavilla et al., 2010). 17

21 Leptodactylus latrans é considerada uma rã de grande porte, de coloração olivácea e com ocelos negros dispostos irregularmente pelo dorso. Sua distribuição geográfica abrange toda a América do Sul Cisandina (Figura 1.3), o que pode ser explicado pelo alto poder de resistência que essa espécie possui a ambientes antropizados (Rangel & Ferreira, 2007). É frequentemente encontrada em lagoas, lagos ou áreas alagadas, onde a desova é depositada em grandes ninhos de espuma. É uma espécie carnívora e sua dieta consiste de insetos, aracnídeos, miriápodes e anelídeos (AmphibiaWeb, 2011). Figura 1.3: Distribuição geográfica de Leptodactylus latrans: América do Sul Cisandina (Heyer et al., 2008 in IUCN, 2010). Com os avanços dos estudos da sistemática de anfíbios, muitas espécies, principalmente aquelas que foram consideradas como tendo ampla distribuição geográfica, revelaram-se compostas de duas ou mais espécies relacionadas, tratando-se, portanto, de um complexo de espécies (Wynn & Heyer, 2001). Recentemente, alguns estudos em anfíbios têm combinado análise citogenética e molecular, fornecendo uma maior informação sobre os organismos estudados (Silva et al., 2004, 2006; Camargo et al., 2006). 18

22 Estudos citogenéticos têm contribuído muito para o entendimento da evolução e filogenia de vários grupos de organismos. A análise das variações cromossômicas possibilita a realização de uma citotaxonomia, especialmente, em casos de espécies crípticas e de complexo de espécies, pois pode ocorrer a descoberta de espécies novas a partir do conhecimento do cariótipo (Kasahara, 2009). Embora, o uso de ferramentas genéticas seja comum na atualidade, ainda não existe uma grande relação entre os grupos de pesquisa envolvidos com Sistemática e aqueles que se dedicam a áreas da Ecologia, Etologia, Fisiologia e Morfologia (Brooks & McLennan, 1991). Cada espécie possui um conjunto cromossômico peculiar em termos de quantidade e morfologia dos cromossomos. A descrição das características desse conjunto é denominada de cariótipo. Para se fazer comparações citogenéticas entre espécies distintas ou analisar a variação entre indivíduos da mesma espécie é fundamental que se faça uma caracterização clara e precisa do cariótipo da espécie de interesse (Guerra, 1988). A análise do cariótipo normalmente é realizada com a montagem de um cariograma, a partir de cromossomos em metáfase mitótica, colocando-os lado a lado, de acordo com a sua morfologia, sempre em ordem decrescente e com os braços curtos voltados para cima. O número de braços cromossômicos de uma espécie é definido como número fundamental (NF) (Kasahara, 2009). Já os métodos morfométricos podem ser utilizados para a percepção de diferenças sutis entre populações (Reyment et al., 1981). A morfometria é definida como o estudo da forma e sua relação com o tamanho. Diversas disciplinas têm utilizado em seus estudos a morfometria como ferramenta. Os taxonomistas empregam estudos morfométricos para mensurar as diferenças existentes entre espécies. Os ecólogos relacionam a forma e o tamanho de um organismo com aspectos como alimentação, uso do microhábitat, dentre outros, sempre enfatizando que a morfometria de um indivíduo é o resultado final de sua evolução. Já os geneticistas, especialmente os quantitativos, se interessam em medir a herdabilidade de caracteres morfométricos (Peres-Neto, 1995). A morfometria multivariada é importante na percepção de diferenças, assim como no estudo das variações de caracteres quantitativos (Cavalcanti & Lopes, 1993). O desenvolvimento de métodos de análise multivariada e a disponibilidade de pacotes 19

23 estatísticos têm auxiliado na avaliação da diferença integrada do organismo e comparações de formas e estruturas, as quais são indispensáveis ao estudo da sistemática (Neff & Marcus 1980; Reyment, 1985). Dentre as técnicas multivariadas mais aplicadas a ecologia e sistemática estão as análises de componentes principais e a análise das funções discriminantes (Peres-Neto, 1995). O presente estudo foi estruturado na forma de três capítulos, sendo o primeiro composto por considerações gerais, justificativa, objetivos e uma breve explanação do material coletado no trabalho. O segundo capítulo foi intitulado Análises citogenéticas de populações de Leptodactylus fuscus Schneider, 1799 e Leptodactylus latrans Steffen, 1815 (Amphibia, Anura, Leptodactylidae) e se refere à caracterização cromossômica das espécies Leptodactylus fuscus e Leptodactylus latrans, utilizando-se técnicas de coloração convencional, Banda C e Ag-RON. Já o terceiro capítulo foi intitulado Análise morfométrica de populações de Leptodactylus fuscus (Schneider, 1799) e Leptodactylus latrans Steffen, 1815 (Amphibia, Anura, Leptodactylidae) e diz respeito a variáveis morfométricas das espécies Leptodactylus fuscus e Leptodactylus latrans. Justificativa Segundo Ab Saber (1977), a Caatinga ocupa uma área total de km 2, formada por diversas composições florísticas adaptadas ao clima semi-árido e considerada um bioma multidiverso, apresentando um aspecto de mosaico de ambientes. Porém, de acordo com a delimitação do IBGE (2004), sua área abrange km 2 e está situada entre os paralelos 3 e 17 S e meridianos 35 e 45 W, cobrindo 9,92% do território nacional, estendendo-se por todos os Estados do Nordeste e parte de Minas Gerais. Embora seja o único bioma exclusivamente brasileiro (Figura 1.4), é o menos conhecido (Lewinshon & Prado, 2002). Mesmo ainda pouco estudada, já se sabe que a biota da Caatinga não é pobre em espécies nem endemismos; ao contrário, é mais diversa que qualquer outro bioma no mundo, o qual esteja exposto às mesmas condições de clima e de solo (Silva, 2003). 20

24 Figura 1.4: Distribuição do Bioma Caatinga (modificado, MMA, 2010). Vários estudos vêm sendo realizados sobre a herpetofauna da Caatinga, porém, em relação aos demais grupos esses dados ainda são incipientes. Segundo Rodrigues (2005) já foram registradas 47 espécies de lagartos, 10 de anfisbenídeos, 52 de serpentes, 4 de quelônios, 3 de jacarés, 48 de anuros e 3 cobras-cegas neste bioma. No Estado de Sergipe, como nos demais, há uma carência efetiva de informações sobre a anurofauna, incluindo as mais básicas como, por exemplo, dieta, recursos espaciais mais utilizados, período reprodutivo. Sergipe tem sido tradicionalmente, mal amostrado em relação à herpetofauna (Rodrigues, 2005). A localidade mais bem representada nas coleções do Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo (MZUSP) é o município de Areia Branca (Coordenadas 1046 S e 3719 O), com apenas três serpentes, sete lagartos e 21

25 13 anfíbios. Essa lacuna precisa ser preenchida, uma vez que dados que possam contribuir para esclarecer a sistemática desse grupo são de grande importância para tomada de decisões conservacionistas sobre a Caatinga e sua anurofauna. Os anfíbios não são limitados a um único hábitat, mas deslocam-se entre eles ou vivem nas fronteiras entre dois ambientes. Dessa forma, os vários hábitats existentes em uma escala regional são muito importantes, devendo ser preservados (Primack & Rodrigues, 2001). Os anuros dependem tanto do ambiente aquático (reprodução) quanto do ambiente terrestre (forrageio, migração, dispersão). São ectotérmicos e possuem pele permeável; logo, são sensíveis às condições ambientais que podem afetar sua distribuição e uso de hábitat (Duellman & Trueb, 1986). Segundo Cushman (2006), a perda e a fragmentação de hábitats estão entre as maiores ameaças para as populações de anfíbios. Com a acelerada ação antrópica sobre o ambiente, como no caso dos desmatamentos, é provável que haja alterações nas taxocenoses e eliminação de populações de anuros que, muitas vezes, não foram ainda estudadas (Young et al., 2000). O declínio de populações de anfíbios brasileiros é pouco documentado e compreendido, principalmente, por falta de conhecimento sobre a biologia das espécies e ausência de monitoramento em longo prazo (Silvano & Segalla, 2005). Há necessidade de maiores estudos sobre a herpetofauna, visto que muitas espécies novas não foram sequer coletadas e outras permanecem depositadas em coleções científicas sem devida descrição padronizada ou muitas vezes com erros de identificação (Castanho & Haddad, 2000). As espécies crípticas, ou seja, morfologicamente idênticas, são relativamente comuns entre anuros da fauna brasileira. Deste modo, dentro de um complexo, elas só podem ser identificadas quando se utiliza dados que não provenham somente da morfologia, como citogenética, padrões de coloração, seqüência de DNA, ecologia, e etologia da vida dos animais (Kwet et al., 2001). Em Leptodactylus algumas inconsistências morfológicas e taxonômicas podem ser encontradas devido à sua ampla distribuição geográfica. No Estado de Sergipe foram 22

26 observadas diferenças morfométricas, principalmente em tamanho, em amostras populacionais de L. fuscus e L. latrans. Embora já existam alguns trabalhos de revisão sistemática e taxonômica destas espécies, estudos envolvendo animais da Caatinga de Sergipe são escassos. Portanto, a caracterização citogenética e morfométrica de amostras populacionais de Leptodactylus fuscus e Leptodactylus latrans encontradas em Sergipe fornecerá novos dados, os quais podem contribuir para o esclarecimento de questões relacionadas à taxonomia e sistemática das espécies aqui estudadas. Objetivos Capítulo 2: Análise Citogenética Objetivo Geral: Caracterizar citogeneticamente (por meio de metodologias de coloração convencional, padrões de banda C e Ag-NORs) as espécies Leptodactylus fuscus e Leptodactylus latrans de ocorrência em diferentes fragmentos de Caatinga do Estado de Sergipe Capítulo 3: Análise Morfométrica Objetivo Geral: Caracterizar estatisticamente a variação morfométrica de amostras populacionais de Leptodactylus fuscus e Leptodactylus latrans, de ocorrência em diferentes fragmentos de Caatinga do Estado de Sergipe. 23

27 Material Coletado Durante o período de estudo foram visitadas algumas localidades da Caatinga, amostrando os ambientes de ocorrência das espécies no Estado de Sergipe (Figura A 1.1). Foram selecionados três municípios representativos do Estado de Sergipe: um município ao Norte (Poço Redondo), um na parte Central (Carira) e outro localizado ao Sul do Estado (Tobias Barreto). As coletas foram realizadas segundo protocolos autorizados pelo Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SISBIO) sob o número de processo vigente de 06/2009 a 08/2010. Para a localização e captura de espécimes de L. fuscus e L. latrans foi adotada a busca ativa, onde todos os corpos d água amostrados foram vistoriados. Os animais foram coletados manualmente, acondicionados em sacos plásticos individuais, umedecidos e previamente identificados, e transportados em caixas de isopor ao Laboratório de Genética e Conservação de Recursos Naturais do Departamento de Biologia da Universidade Federal de Sergipe. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AB SABER, A.N. Espaços ocupados pela extensão dos climas secos na América do Sul, por ocasião dos períodos glaciais quaternários. Paleoclimas. 3: AMPHIBIAWEB: Information on amphibian biology and conservation. [web application] Berkeley, California: AmphibiaWeb. Disponível em < acessado em Fev, ANGULO, A.; COCROFT, R.B.; REICHLE, S. Species identity in the genus Adenomera (Anura: Leptodactylidae) in southeastern Peru. Herpetol. 59: BASTOS, R.P.; MOTTA, J.A de O.; LIMA, L.P.; GUIMARÃES, L.D.A. Anfíbios da Floresta Nacional de Silvânia, estado de Góias. Stylo Gráfica e Editora, 82p

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33 SILVA, A.P.Z.; HADDAD, C.F.; GALASSI, G.G. & KASAHARA, S. Multiple nucleolus organizer regions in Leptodactylus mystacinus (Amphibia, Anura) and comments on its systematic position in the L. fuscus group based on cytogenetic and molecular analyses. Genetica 127: SILVANO, D.L. & SEGALLA, M.V. Conservação de Anfíbios no Brasil. Megadiversidade.1(1): WYNN, A. & HEYER, W.R. Do geographically widespread species of tropical amphibians exist? An estimate of genetic relatedness within the neotropical frog Leptodactylus fuscus (Schneider 1799) (Anura Leptodactylidae). Tropical Zoology 14: YOUNG, B.E., LIPS, K.R., REASER, J.K., IBAÑES, R.; SALAS, A.W.; et al. Population declines and priorities for amphibians conservation in Latin America. Conserv. Biol. 15(5),

34 Capítulo 2 Análise citogenética 31

35 Análise citogenética de populações de Leptodactylus fuscus Schneider, 1799 e Leptodactylus latrans Steffen, 1815 (Anura, Leptodactylidae) Betejane de Oliveira Núcleo de Pós-Graduação em Ecologia e Conservação Departamento de Biologia, Laboratório de Genética e Conservação de Recursos Naturais, Universidade Federal de Sergipe. CEP São Cristóvão, SE, Brasil. ABSTRACT The Leptodactylidae family has diploid numbers ranging from 2n=18 to 2n=26, but in most of the genera described in the literature there is a predominance of 2n=22. We performed a cytogenetic analysis, for the first time, of 44 specimens of Leptodactylus fuscus and Leptodactylus latrans from the state of Sergipe, in the municipalities of Carira, Poço Redondo and Tobias Barreto, using conventional staining techniques, C-band and Ag-RON. Mitotic chromosomes were studied from preparations of intestinal epithelium. The analyzed species showed diploid number 2n = 22, with metacentric, submetacentric and subtelocentric chromosomes. Constitutive heterochromatin was located in the centromeric region of chromosomes, besides telomeric and interstitial markings. The nucleolus organizer regions were found in the short arm of the eighth chromosome pair, coincident with the site of the secondary constriction in both species. The data showed that the species studied have similar karyotypic patterns and that there is no evidence of species-specific markers; however some variations in chromosome morphology and C- bands observed differed from those described in the literature for the same species and should be better analyzed in future studies. Keywords: Cytogenetic, Leptodactylus fuscus, Leptodactylus latrans, C-band, Ag-RON. 32

36 RESUMO A família Leptodactylidae apresenta números diplóides que variam de 2n=18 a 2n = 26, porém na maioria dos gêneros descritos na literatura há uma predominância de 2n=22. Neste trabalho foram analisados citogeneticamente, pela primeira vez, 44 exemplares de Leptodactylus fuscus e Leptodactylus latrans pertencentes ao Estado de Sergipe, dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, por meio de técnicas de coloração convencional, Banda C e Ag-RON. Os cromossomos mitóticos foram estudados a partir de preparações do epitélio intestinal. As espécies analisadas apresentaram número diplóide de 2n=22, com cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos. Os blocos de heterocromatina constitutiva foram localizados na região centromérica dos cromossomos, além de marcações intersticiais e teloméricas. As regiões organizadoras de nucléolo encontraram-se nos braços curtos do oitavo par cromossômico, coincidindo com o sítio da constrição secundária nas duas espécies. Os dados mostraram que as espécies aqui analisadas apresentaram padrões cariotípicos bastante similares e sem evidência de marcadores espécie-específicos; porém, algumas variações de morfologia cromossômica e bandas C observadas divergiram de cariótipos já descritos na literatura para as mesmas espécies e devem ser mais profundamente analisadas em estudos posteriores. Palavras-chave: citogenética, Leptodactylus fuscus, Leptodactylus latrans, Banda C, Ag- RON. 33

37 INTRODUÇÃO A classe Amphibia está dividida em três ordens (Anura, Caudata e Gymnophiona) e sessenta e uma famílias, com um total de 6771 espécies. A ordem Anura é a mais representativa, com 49 famílias e 5966 espécies. A Caudata tem nove famílias e 619 espécies e a Gymnophiona subdivide-se apenas em três famílias, com 186 espécies (Frost, 2011). Devido ao grande número de espécies e à variação morfológica dos animais, incluindo variação no padrão de coloração, dentre outras características, as relações filogenéticas em anfíbios não estão bem estabelecidas. Diversas tentativas de agrupamento das espécies já foram realizadas (Lynch, 1971; Heyer, 1975, Frost, 1985), porém, ainda há controvérsias no âmbito da taxonomia. Nos últimos anos, houve um aumento significativo nos estudos sobre a anurofauna (Silva et al., 2005; Lucas et al., 2008), muitas espécies novas foram descritas, porém, várias dessas espécies ainda não foram incluídas nos grupos de espécies tradicionais. Segundo a última atualização do catálogo on-line das espécies de anfíbios de Frost (2011), a família Leptodactylidae compreende quatro gêneros (Hydrolaetare, Leptodactylus, Paratelmatobius e Scythrophrys) e 100 espécies. O gênero Eleutherodactylus, incluído na antiga classificação de Leptodactylidae, atualmente encontra-se em outra família e sofreu modificações taxonômicas, sendo desmembrado em outros gêneros (Hedges et al., 2008). O gênero Leptodactylus (Fitzinger, 1826) compreende 89 espécies distribuídas no Sul da América do Norte, América do Sul, há também espécies endêmicas de ilhas situadas entre o Caribe e o Atlântico, incluindo as Antilhas e Bahamas (Frost, 2011). As espécies de Leptodactylus foram inicialmente divididas baseadas na morfometria e no comportamento, em 5 grupos de espécies: L. fuscus, L. melanonotus, L. ocellatus, L. pentadactylus e L. marmoratus (Heyer, 1969). Porém, a taxonomia de diversos grupos de espécies vem sendo ainda revisada e modificada (Angulo et al., 2003; Heyer, 2005). Segundo De Sá et al. 34

38 (2007), a associação de um espécime tipo com uma dada localidade é critica em espécies de Leptodactylus. Nas espécies de anuros denominadas por Linnaeus (1758) há frequentemente breve descrição seguida de uma distribuição geográfica ambígua, além de palavras sinônimas citadas por outros autores. No caso de Rana ocellata, uma das espécies neotropicais incluídas por Linneus na décima edição de seu Systema Naturae (Linnaeus, 1758), existe uma longa história de equívocos e erros de identificação. Uma das tentativas de resolver esses problemas foi realizado Lavilla et al. (2010) que, em uma revisão sobre nomenclatura, concluíram que a espécie Rana ocellata Linnaeus, 1758 referia-se à Osteopilus brunneus Gosse, 1851 da Jamaica, enquanto que o táxon conhecido como Leptodactylus ocellatus correspondia a Rana latrans Steffen, A Comissão Interacional de Nomenclatura Zoológica (ICZN, processo 3323) conservou o nome Leptodactylus ocellatus pela designação do neotipo Rana ocellata Linnaeus, Assim, foi revalidada uma nova combinação para a espécie, denominanda Leptodactylus latrans Steffen, Para a espécie Osteopilus ocellatus Linnaeus, 1758, uma nova combinação foi realizada e a classificaram como sinônimo de Osteopilus brunneus Gosse, A evolução cromossômica pode ou não ocorrer em paralelo com as mudanças morfológicas. A análise cariotípica geralmente fornece evidências diretas de variabilidade genética inter e intraespecífica. (Ruiz et al., 1982). Em relação à Leptodactylus, hipóteses filogenéticas sugeriram a necessidade de se testar o monofiletismo do gênero, assim como, confirmar grupos de espécies já conhecidos. Algumas análises afirmam que Leptodactylus é parafilético no que se refere à Adenomera, Lithodytes e Vanzolinius (Heyer, 1998). Larson & De Sá (1998) descreveram 26 caracteres em 22 espécies de Leptodactylus, nove pertencentes ao grupo L. fuscus, e confirmaram o parafiletismo do gênero sendo, então, proposto o remanejamento de algumas espécies dentro de cada agrupamento. Frost et al. (2006), porém, ratificaram o monofiletismo de gênero considerando Adenomera (Steindachner, 1867) como um sinônimo de Lithodytes (Fitzinger, 1843) e como subgênero de Leptodactylus. A divisão das espécies de Leptodactylus nos agrupamentos reconhecidos por Heyer (1969) foi mantida, porém, com várias espécies, principalmente aquelas dos antigos gêneros Adenomera, Lithodytes e Vanzolinius, não sendo alocadas em nenhum dos grupos estabelecidos (Frost et al., 2006; Kwet, 2001). 35

39 Camargo et al. (2006) usando dados moleculares de DNA mitocondrial, estudaram dezesseis populações de L. fuscus distribuídas em Tobago, Trindade, Guiana, Guiana Francesa, Brasil, Bolívia, Argentina, Panamá e Uruguai, reforçando a hipótese de várias espécies crípticas dentro do complexo de L. fuscus, onde populações localizadas no Norte divergiram das populações do Sul. Além disso, as análises também permitiram dividir as populações do Sul em dois clados, sem relação de parentesco entre eles. Estudos isoenzimáticos confirmaram os dados moleculares, mostrando elevada diferenciação e falta de fluxo gênico entre ambos. Estudos citogenéticos têm contribuído muito para o entendimento da evolução e filogenia de vários grupos de organismos. A análise das variações cromossômicas possibilita a realização de uma citotaxonomia de modo especial, em casos de espécies crípticas e de complexo de espécies, pois pode ocorrer a descoberta de espécies novas a partir do conhecimento do cariótipo (Kasahara, 2009). Em grupos com morfologia externa conservada e com cariótipos muito semelhantes em relação ao padrão de coloração, a identificação de marcadores citológicos por meio de bandamento cromossômico pode ser uma ferramenta importante para taxonomia e sistemática (Kuramoto, 1990; King, 1990). Contudo, existem casos, especialmente em anuros, em que os cariótipos são pouco diferenciados com técnicas de bandamento (Kasahara et al., 1996). Dentre as técnicas de bandamento, o padrão de banda C de espécies cariologicamente muito semelhantes pode diferir em relação à quantidade, localização e propriedades de coloração de heterocromatina, além do número de bandas, podendo ser um importante caráter sistemático para anfíbio, já que o seu cariótipo, em geral, é caracterizado pela presença de grande quantidade de heterocromatina (Sumner, 1990; Schmid et al., 1990). Diferentes padrões de banda C em três populações de L. latrans foram observados por Silva et al. (2000), sugerindo uma possível diferenciação cariotípica em um complexo de espécies, onde foram observadas variações referentes a morfologia externa e bioacústica entre os indivíduos estudados de ocorrência ao nível do mar e aqueles que habitavam áreas de platô. Outra técnica muito utilizada, particularmente na análise dos cariótipos de anuros, é aquela que detecta as Regiões Organizadoras do Nucléolo (RON) com coloração de prata, 36

40 chamada de Ag-RON. Essas regiões são os sítios cromossômicos dos genes que codificam os RNAs ribossômicos (RNAr), os quais em células interfásicas se expressam formando o nucléolo (Sumner, 1990). As RONs contêm numerosas cópias dos genes que codificam os RNAr 18S, 5,8S e 28S, arranjadas em tandem, separadas umas das outras por segmentos espaçadores. A técnica de impregnação pelo nitrato de prata pode, além de identificar as RONs, eventualmente, marcar os telômeros, os cinetócoros e também outras regiões dos cromossomos, como as de heterocromatina centromérica ou intersticial. Isto ocorre devido à presença de proteínas não-histônicas com afinidade pela prata nos sítios Ag-positivos, como acontece na Ag-RON verdadeira (Kasahara, 2009). As espécies apresentam, em geral, um único par de Ag-RON (Schmid et al., 1990). No entanto, em estudo realizado por Silva et al. (2006), espécimes de L. mystacinus apresentaram nove padrões distintos de sinais de Ag-positivos e, em algumas metáfases, cromossomos foram marcados pela prata na região centromérica, enquanto que em um determinado espécime a hibridização in situ ocorreu nos homólogos do par 4 e em um dos cromossomos do par 8. Em espécies da família Leptodactylidae, há predominância de cariótipos com número diploide de 2n=22. O padrão cariotípico em Leptodactylus é altamente similar, composto geralmente por cromossomos metacêntricos e submetacênctricos (Silva et al., 2004; Amaro-Ghilardi et al., 2006), os quais decrescem gradualmente em tamanho, com exceção do primeiro par, que é bem maior quando comparado aos outros pares (King, 1990). Arruda & Morielle-Versute (2008) analisaram os cariótipos de quatro espécies de leptodactilídeos (L. podicipinus, L. ocellatus, L. labyrinthicus e L. fuscus), que se mostraram semelhantes aos já descritos por Denaro (1972), Bianchi et al., (1973), Bogart (1974), Agostinho (1994), Silva et al., (2000), Baldo (2002), e Amaro-Ghilardi et al., (2006). Esses autores apontaram o conservadorismo do cariótipo. Em relação à L. ocellatus - hoje chamada L. latrans Steffen, 1815 as duas populações analisadas apresentaram 22 cromossomos (2n=22). O cariótipo é composto principalmente de cromossomos metacêntricos e submetacêntricos, representado por sete pares de metacêntricos (1, 5, 6 e 8-11), três pares de submetacêntricos (2, 3 e 7) e um par de cromossomos subtelocêntricos (4). Os espécimes estudados de L. fuscus apresentaram também 22 cromossomos metacêntricos ou submetacêntricos e cariótipo semelhante à L. latrans com sete pares de 37

41 metacêntricos (1, 5, 6 e 8-11), três pares de submetacêntricos (2, 3 e 7) e um par de subtelocêntricos (4). Contudo, diferentes ambientes ocupados por populações de anfíbios podem ser responsáveis por alguns polimorfismos cromossômicos já observados, assim como, alterações comportamentais, morfológicas e reprodutivas (Ruiz et al., 1982; Kaiser et al., 1996). Nesse sentido, o presente estudo objetivou caracterizar citogeneticamente, por meio de coloração convencional e por padrões de bandamentos C e Ag-RON, as espécies Leptodactylus fuscus e Leptodactylus latrans de ocorrência no Estado de Sergipe. MATERIAL E MÉTODOS Animais Neste trabalho foram analisados citogeneticamente oito exemplares de Leptodactylus fuscus e 36 de Leptodactylus latrans (Figura 2.1), provenientes dos municípios de Poço Redondo (9º S e 37 º O), Carira (10º S e 37 º O) e Tobias Barreto (11 o S e 38 º O) no Estado de Sergipe (Figura 2.2). Não foram encontrados, porém, indivíduos de L. fuscus em Carira, no período da coleta. Os espécimes foram coletados, no período de setembro de 2009 a julho de 2010, sendo a licença liberada pelo Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SISBIO) sob o número de processo vigente de 06/2009 a 08/2010. Todos os animais estão depositados na coleção herpetológica do Laboratório de Cordados - Herpetologia/Ictiologia do Departamento de Biologia, da Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, Sergipe. 38

42 (A) (B) Figura 2.1: Imagens de animais provenientes de Poço Redondo SE: (A) Leptodactylus fuscus; (B) Leptodactylus latrans. CRC de L. fuscus: 44 mm e CRC de L. latrans: 53 mm (Foto: Betejane de Oliveira). Figura 2.2: Área de estudo e sua localização relativa no Brasil e no Estado de Sergipe - municípios de Poço Redondo, Carira e Tobias Barreto. (Modificado, 39

43 Obtenção das metáfases e técnicas empregadas O procedimento laboratorial foi desenvolvido no Laboratório de Genética e Conservação de Recursos Naturais do Departamento de Biologia da Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, SE. Os cromossomos metafásicos foram obtidos a partir do epitélio intestinal, devido à riqueza na quantidade de células em divisão mitótica, no procedimento in vivo, seguindo o protocolo de Schmid (1978), com pequenas modificações. Em cada espécime, foi administrada intraperitoneamente solução de colchicina a 1% (Sigma) na proporção aproximada de 0,1ml/10g de peso do animal. Após cerca de 4 horas, os animais foram anestesiados por via nasal, com altas dosagens de Lidocaína a 2% (Hipolabor- Sanval) e, em seguida, eutanasiados, para a retirada de todo o intestino, o qual foi aberto longitudinalmente e submetido a lavagens sucessivas com solução hipotônica de KCl 0,075M. Posteriormente, o intestino foi colocado em uma placa de Petri com 3ml da mesma solução para tratamento hipotônico durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Após a hipotonização, o intestino foi transferido para outra placa de Petri contendo fixador Carnoy (metanol e ácido acético, na proporção 3:1), raspando-se a mucosa intestinal com auxílio de uma pequena espátula. Depois de 20 minutos, a suspensão foi transferida para um tubo de Eppendorf e centrifugada a 1000 rpm por 7min e descartado o sobrenadante. O pellet foi desmanchado com a pipeta Pasteur e o fixador foi adicionado vagarosamente, pipetando em seguida, para a lavagem das células. Tal procedimento foi realizado por mais duas vezes. Na última centrifugação o sobrenadante foi descartado, sendo adicionada quantidade de fixador suficiente para o preparo das lâminas. Técnica de Coloração Convencional (Giemsa) A coloração convencional foi realizada com corante Giemsa diluído em tampão fostato ph 6,8 durante 10 minutos. Em seguida, a lâmina foi lavada em água destilada e deixada para secar à temperatura ambiente. 40

44 Técnica de Marcação de Regiões Heterocromáticas (Banda C) A técnica de Banda C foi realizada segundo Sumner (1972), com algumas modificações. A lâmina foi colocada em solução 0,2N de ácido clorídrico à temperatura ambiente. Após 45 minutos foi lavada com água destilada e incubada em solução de hidróxido de bário octahidratado (Merck Chemicals) a 5%, à temperatura de 60 C, durante 37 segundos. Depois de lavada em água destilada, a lâmina foi mergulhada rapidamente em solução 1N de ácido clorídrico a 60 C e incubada em solução de 2xSSC por 45 minutos também a 60 C, em seguida, lavada novamente em água destilada. Por fim, a lâmina foi colocada em solução de Giemsa (Cinética - 2ml da solução comercial + 28ml de tampão fosfato de ph 6,8), durante 20 minutos e lavada em água destilada, deixando-se para secar à temperatura ambiente. Técnica de Marcação das Regiões Organizadoras de Nucléolo pelo Nitrato de Prata (Ag-RON) A técnica de Ag-RON foi baseada em Howell & Black (1980). A lâmina foi incubada em solução 1N de ácido clorídrico, a 60 C, durante 3 minutos. Sobre a lâmina seca, à temperatura ambiente, foi pingada uma gota de solução coloidal reveladora e, sobre ela, duas gotas de solução de nitrato de prata a 50% e, em seguida foi coberta com lamínula. Uma câmara úmida foi preparada usando uma placa de Petri forrada com papelfiltro, a 60 C, e a lâmina foi incubada durante aproximadamente 3 minutos. Em seguida, foi lavada em água destilada e corada em solução de Giemsa por 30 segundos. Foi lavada outra vez em água destilada e colocada para secar. Análise das lâminas e montagem do cariograma As lâminas foram analisadas em microscópio de luz e as metáfases foram fotografadas com sistema de câmera de vídeo digital Moticam 2500 (MOTICAM), juntamente com seu software para captura e análise de imagem, com objetiva de imersão de 100x. Os cromossomos homólogos foram emparelhados e classificados de acordo com Green & Sessions (1991, 2007). 41

45 RESULTADOS Leptodactylus fuscus As figuras 2.3 a 2.5 mostram os cariótipos de L. fuscus submetidos às colorações convencional, Bandamento C e Ag-RON, respectivamente. Os espécimes analisados de L. fuscus (8 animais) apresentaram número diploide 2n=22 cromossomos e número fundamental NF=44. O cariótipo é constituído por 2 pares de cromossomos grandes, 5 pares médios e 4 pares pequenos. Os pares 1, 5 e 6 são metacêntricos, os pares 2, 3 e 7 são submetacêntricos, o par 4 é subtelocêntrico e, por fim, os pares 8, 9, 10 e 11 que são metacêntricos ou submetacêntricos, apresentando morfologias de difícil definição (Figura 2.3). Nas populações de L. fuscus foi visualizada constrição secundária na região terminal do braço curto em ambos os homólogos do par 8. Nos animais das duas populações, a heterocromatina constitutiva foi encontrada na região centromérica/pericentromérica dos cromossomos e, em algumas metáfases, nas regiões intersticiais, em quantidades maiores ou menores, sendo estas diferenças de caráter interindividual (Figura 2.4). Os cromossomos do par 8 mostraram marcação na região adjacente à RON, na região proximal dos braços curtos. As regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foram observadas na região intersticial do braço curto do par 8, coincidindo com o sítio da constrição secundária (Figura 2.5). 42

46 (A) (B) Figura 2.3: Cariogramas com coloração convencional: (A) Leptodactylus fuscus de Poço Redondo e (B) Leptodactylus fuscus de Tobias Barreto, SE. Notar constrição secundária no par cromossômico 8, indicada pela seta. 43

47 (A) (B) Figura 2.4: Padrão de distribuição de Banda C em (A) Leptodactylus fuscus de Poço Redondo e (B) Leptodactylus fuscus de Tobias Barreto, SE. Em (B), par cromossômico 4, observa-se variação na quantidade de heterocromatina entre os homólogos. (A) (B) (A.1) (B.1) Figura 2.5: Metáfases mostrando a localização das Ag-RONs (seta). (A) Leptodactylus fuscus de Poço Redondo e (B) Leptodactylus fuscus de Tobias Barreto, SE. Notar a presença de RONs no braço curto do par 8 (A.1 e B.1). 44

48 Leptodactylus latrans As figuras 2.6 a 2.8 mostram os cariótipos de L. latrans submetidos às colorações convencional, Bandamento C e Ag-RON, respectivamente. As três populações de L. latrans (A - Carira, B - Poço Redondo e C - Tobias Barreto) observadas mostraram número diploide 2n=22, com cromossomos metacêntricos, submetacêntricos ou subtelocênctricos e NF=44. Quanto à morfologia e tamanho cromossômico, o par 1 é metacêntrico grande, os pares 2 e 3 são representados por submetacêntricos grandes e médios, respectivamente, o par 4 é subtelocêntrico médio, os pares 5 e 6 são metacêntricos médios, o par 7 é submetacêntrico médio e os pares de 8 a 11 são submetacêntricos ou metacêntricos pequenos (Figura 2.6). Nos espécimes analisados, não se notou a presença de constrição secundária. Como mostra a figura 2.7, banda C centromérica/pericentromérica foi observada em todos os cromossomos da espécie nas duas populações; no entanto, marcações teloméricas foram evidentes somente na população de Tobias Barreto (B). Os pares 4, 7, 8 e 9, de indivíduos de Poço Redondo e Tobias Barreto, apresentaram blocos pericentroméricos nos braços curtos, com marcação C-positiva. Os pares 10 e 11 mostraram padrões equivalentes nos representantes de Tobias Barreto, com sutis marcações terminais nos braços curtos, enquanto que os mesmos pares na amostra de Poço Redondo não tiveram marcações evidentes. No geral, os espécimes de L. latrans de Tobias Barreto mostraram padrão de bandas mais acentuado e de resultado tecnicamente melhor entre os exemplares das localidades estudadas, porém, não foi possível obter dados de Banda C nos indivíduos procedentes de Carira. As regiões organizadoras de nucléolo foram observadas na região terminal dos braços curtos do par 8 (Figura 2.8) e, em alguns casos, identificou-se a presença de RONs em associação (Figura 2.8, B.1). 45

49 (A) (B) (C) Figura 2.6: Cariótipos em coloração convencional. (A) L. latrans de Carira, (B) L. latrans de Poço Redondo e (C) L. latrans de Tobias Barreto, SE. 46

50 (A) (B) Figura 2.7: Padrões de bandamento C em (A) Leptodactylus latrans de Poço Redondo e (B) Leptodactylus latrans de Tobias Barreto, SE. Notar associação entre os homólogos do par 8 em A. (A) (B) (A.1) (B.1) Figura 2.8: Metáfases destacando a localização das RONs (setas). (A) Leptodactylus latrans de Poço Redondo e (B) Leptodactylus latrans de Tobias Barreto, SE. Destaque: A.1, RONs no braço curto do par 8; B.1, presença de RONs associadas. 47

51 DISCUSSÃO Informações baseadas no estudo da fauna de répteis e anfíbios da Caatinga são essenciais para a compreensão da história do atual ecossistema. Deste modo, dados sistemáticos da herpetofauna de áreas geográficas abrangentes devem contribuir para o início de um aprendizado sobre os padrões e processos que afetaram historicamente alguns dos espaços geográficos da Caatinga e ampliar as medidas de conservação contemporâneas (Rodrigues, 2005). Espécies de Leptodactylidae possuem ampla distribuição geográfica, com ocorrência em quase todo o Brasil. A maioria dos trabalhos de citogenética com anfíbios da fauna brasileira são da década de 1970, realizados apenas com coloração convencional (Beçak, 1968; Beçak et al., 1970; Denaro, 1972). Nos últimos anos, no entanto, alguns trabalhos já foram desenvolvidos, utilizando-se várias técnicas de coloração diferencial (Kasahara et al., 1998; Silva et al., 2000; Lourenço et al., 2003, Amaro-Ghilardi et al., 2006; Arruda & Morielle-Versute, 2008; Campos, et al., 2009; Paiva et al., 2010). No presente estudo, foram analisados cariótipos de duas espécies de Leptodactylus, as quais apresentaram número diplóide 2n=22, número fundamental NF=44 e cromossomos metacêntricos, submetacêntricos ou subtelocêntricos. Pela primeira vez, foi realizado um trabalho citogenético, utilizando-se técnicas de coloração convencional, Banda C e Ag-RON, com as espécies L. fuscus e L. latrans do Estado de Sergipe. Os representantes da família Leptodactylidae possuem número diploide que variam de 2n=18 a 2n=26, porém há uma predominância de 2n=22. Esse número é quase que exclusivo das espécies de Leptodactylus, as quais possuem cariótipos altamente semelhantes incluindo cromossomos morfologicamente classificados como metacêntricos e submetacêntricos, como observado no presente estudo. Contudo, Amaro-Ghilardi et al. (2006) encontrou variação no número diploide de Leptodactylus ao analisar o cariótipo de Leptodactylus silvanimbus que possui 2n=24. Em estudo realizado por Campos et al. (2009) as espécies L. cf. marmoratus, Leptodactylus sp. (aff. Bokermanni) e L. hylaedactylus, anteriormente incluídas no gênero Adenomera, apresentaram, respectivamente, 2n=24, 2n=23 e 2n=26, diferentemente do observado até então para o 48

52 gênero Leptodactylus, que possui número diploide característico 2n=22 (Beçak et al., 1970; Silva et al., 2000; Silva et al., 2004; Amaro-Ghilardi et al., 2004; Silva et al., 2006). A constituição cariotípica dos espécimes de L. fuscus e L. latrans aqui estudados, mostrou-se semelhante à descrita por Arruda & Morielle-Versute (2008), Silva et al. (2000) e Amaro-Ghilardi et al. (2006), ainda que a nomenclatura da morfologia dos cromossomos não seja a mesma. Em determinados grupos taxonômicos é comum a conservação dos cariótipos; deste modo, todas as espécies do mesmo gênero possuem idêntico cariótipo modal, podendo ser indistinguível, mesmo com a utilização de algumas técnicas de coloração diferencial. Nas duas populações de L. fuscus foi observada constrição secundária evidente na região terminal do braço curto do par cromossômico 8, coincidindo com o sítio da Ag- RON. Entretanto, nos espécimes de L. latrans analisados não se visualizou tal estrutura. Em espécies muito próximas, o padrão de banda C pode ser diferente no que diz respeito à quantidade de heterocromatina, números de bandas, localização e propriedades de coloração da heterocromatina, o que pode corresponder a um importante caráter citotaxonômico e sugerir possíveis rearranjos cromossômicos ocorridos na evolução do grupo em questão (Sumner, 1990). Tanto em L. fuscus como em L. latrans, o padrão de banda C é centromérico. Porém, a heterocromativa constitutiva predominantemente centromérica/pericentromérica foi encontrada em todas as amostras das duas espécies, além de marcações adicionais em alguns cromossomos, como nas regiões teloméricas, intersticiais ou ainda no sítio das Ag-RONs. Em L. fuscus não foram encontradas diferenças populacionais nos padrões de bandas C. As regiões teloméricas não foram marcadas, situação observada também por Silva et al. (2000) em indivíduos de Rio Claro, SP. Os cromossomos homólogos do par 4 da amostra de Tobias Barreto tiveram quantidade variável de heterocromatina, característica típica das bandas C, quando se observa os homólogos de um mesmo par (Kasahara, 2009). Diferenças na quantidade e distribuição da heterocromatina têm sido essencial para caracterizar espécies e subespécies de anfíbios (Matsui et al., 1985). O padrão de distribuição de heterocromatina em L. latrans de Tobias Barreto foi semelhante 49

53 ao descrito por Amaro-Ghilardi et al. (2006) em espécimes de Igarassu (PE), que apresentou nos pares 4, 7, e 8 blocos pericentroméricos nos braços curtos, com marcação C-positiva. Em estudo realizado com três populações de L. latrans (Rio Claro, SP; Santa Maria, RS e Guaratuba, PR), Silva et al. (2000) observaram três distintos padrões de distribuição de heterocromatina, porém estes resultados não foram atribuídos a diferentes formas taxonômicas; eles são sugestivos da variação geográfica do cariótipo ou até mesmo estarem relacionados com a idéia de um complexo de espécies, já que indivíduos de L. latrans podem também se distinguir pela morfologia externa, bioacústica e hábitat (Silva et al., 2006). Segundo Kasahara (2009) é possível encontrar variações de bandas C entre indivíduos de uma mesma espécie ou população, ou ainda, estas podem diferenciar populações de uma mesma espécie. A técnica Ag-RON pode, eventualmente, marcar os telômeros, os cinetócoros e também outras regiões, em geral de DNA repetido, dos cromossomos, fazendo com que tais marcações sejam confundidas com a das regiões organizadoras de nucléolo (Kasahara, 2009). As espécies apresentam, geralmente, somente um par de Ag-RON (Schmid et al., 1990). É o que ocorre com o gênero Leptodactylus, que tem RONs localizados sempre no par 8 (Lisanti et al., 1990; Silva et al., 2000, 2004; Baldo, 2002; Amaro-Ghilardi, 2004). Porém, Amaro-Ghilardi (2005) os localizou também no par 4 em L. petersii. Nos espécimes de L. fuscus analisados aqui, as RONs foram visualizadas na região intersticial do braço curto do par 8, coincidindo com o sítio da constrição secundária. Enquanto que em L. latrans as RONs foram observadas na região terminal também do braço curto do par 8, com uma pequena região eucromática no final da constrição, o mesmo encontrado por Amaro-Ghilardi (2005) e Silva et al., (2000). As espécies aqui analisadas apresentaram padrões cariotípicos bastante similares aos já descritos na literatura, com exemplares de diferentes localidades, porém com diferenças na Banda C. Contudo, novos padrões tendem a ser descobertos à medida que outros estudos de citogenética sejam realizados em Leptodactylus, principalmente por meio de técnicas mais refinadas capazes de identificar marcadores cromossômicos espécie- 50

54 específicos, assim como, abordando novas localidades no Estado de Sergipe, a fim de esclarecer as relações evolutivas e taxonômicas do grupo. CONCLUSÃO As espécies L. fuscus e L. latrans analisadas no presente estudo apresentaram número diplóide 2n=22, com cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos. Comparando os cariótipos das populações de L. fuscus com os de L. latrans não foi observada variação significativa. Em L. fuscus não foram observadas variações interpopulacionais com relação à Banda C. Entretanto, foram identificadas algumas diferenças nos padrões de bandamento entre as amostras de L. latrans de Tobias Barreto e Poço Redondo, assim como entre exemplares já descritos em outros estudos e localidades, o que pode sugerir que as espécies em questão, apresentando ampla distribuição geográfica, façam parte de um complexo de espécie ou que estejam em processo de diferenciação. As informações geradas no presente estudo ampliaram o conhecimento sobre as espécies L. fuscus e L. latrans presentes no Estado de Sergipe, apresentando pela primeira vez dados citogenéticos sobre essas espécies. Porém, para responder mais diretamente as questões levantadas aqui, outras metodologias como as moleculares, sistemáticas, ecológicas, dentre outras, devem ser empregadas, assim como a avaliação de outras localidades no Estado de Sergipe, que possam fornecer informações sobre a sistemática e evolução das espécies analisadas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGOSTINHO, C.A. Caracterização de populações de rã-pimenta Leptodactylus labyrinthicus (Spix, 1824) e avaliação de seu desempenho em cativeiro. Unpublished Ph.D. thesis, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos

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62 Capítulo 3 Análise morfométrica 59

63 Análise morfométrica de populações de Leptodactylus fuscus Schneider, 1799 e Leptodactylus latrans Steffen, 1815 (Anura, Leptodactylidae) Betejane de Oliveira Núcleo de Pós-Graduação em Ecologia e Conservação Departamento de Biologia, Laboratório de Genética e Conservação de Recursos Naturais, Universidade Federal de Sergipe. CEP São Cristóvão, SE, Brasil. ABSTRACT Anurans are widely distributed geographically, concentrating mainly in the Neotropical region. The species Leptodactylus fuscus and Leptodactylus latrans are found in the state of Sergipe in the Caatinga biome. There is a lack of basic information about the biology, ecology and ethology of these species. Thus, the present study was based on the analysis of morphometric data from three populations of L. fuscus and L. latrans from Sergipe, in order to ascertain the level of intra-and interspecific variations in these species and their localities. For the morphometric analysis, there were used 72 individuals of which 21 measures were taken. Morphometric analysis allowed to identify variations among different populations of L. latrans, however, the same was not observed in populations of L. fuscus. These findings suggest the existence of a considerable adaptive plasticity in L. latrans, which can occur, for example, due to the different environments exploited by this species. Keywords: Cytogenetic, morphometry, Leptodactylus fuscus, Leptodactylus latrans, Caatinga. 60

64 RESUMO Os anuros possuem ampla distribuição geográfica, concentrando-se principalmente na região Neotropical. As espécies Leptodactylus fuscus e Leptodactylus latrans são encontradas no Estado de Sergipe no bioma Caatinga. Há carência de informações básicas sobre a biologia, ecologia, e etologia nestas espécies. Assim, o presente trabalho baseou-se na análise de dados morfométricos de três populações de L. fuscus e de L. latrans de Sergipe, a fim de verificar o nível de variação intra e interespecífica destas espécies e suas localidades. Para a análise morfométrica foram utilizados 72 indivíduos dos quais foram tomadas 21 medidas. As análises morfométricas permitiram identificar variações entre as diferentes populações de L. latrans, contudo, o mesmo não foi observado nas populações de L. fuscus. Os resultados desse trabalho permitem sugerir a existência de uma considerável plasticidade adaptativa em L. latrans, que pode ocorrer, por exemplo, em função dos diferentes ambientes explorados pela espécie. Palavras-chave: Morfometria, Caatinga, Leptodactylus latrans, Leptodactylus fuscus. 61

65 INTRODUÇÃO A classe Amphibia está dividida em três ordens (Anura, Caudata e Gymnophiona), sessenta e uma famílias e 6771 espécies. A ordem Anura é a mais representativa, com 49 famílias e 5966 espécies, seguida por Caudata com nove famílias e 619 espécies e Gymnophiona com apenas três famílias e 186 espécies (Frost, 2011). Inicialmente a família Leptodactylidae foi dividida em quatro subfamílias (Ceratophryinae, Hylodinae, Leptodactylinae e Telmatobiinae) e considerada como um grupo parafilético, já que a mesma não apresentava sinapomorfias evidentes (Frost, 1985; Ford & Cannatella, 1993), além de ser classificada como uma das famílias com maior diversidade entre os anuros, continha 1243 espécies, a maioria alocada na subfamília Eleutherodactylinae (Frost et al., 2006). Contudo, de acordo com a última atualização do catálogo on-line das espécies de anfíbios de Frost (2011), a família Leptodactylidae compreende quatro gêneros (Hydrolaetare, Leptodactylus, Paratelmatobius e Scythrophrys) e 100 espécies, com distribuição principalmente na região Neotropical. Os representantes são, em geral, de pequeno e médio porte, insetívoros, terrestres ou semiaquáticos e de atividade noturna. Devido ao grande número de espécies e à variação morfológica dos animais, incluindo variação no padrão de coloração, dentre outras características, as relações filogenéticas em anfíbios não estão bem estabelecidas e têm sido objeto de estudo de várias pesquisas, provocando diversas mudanças taxonômicas dentro dos grupos (Angulo et al., 2003; Heyer, 2005; Frost et al., 2006; Grant et al., 2006; Hedges et al., 2008; Guayasamin et al., 2009). Diversas tentativas de agrupamento já foram realizadas (Lynch, 1971; Heyer, 1975, Frost, 1985), porém, ainda há controvérsias de classificação entre as espécies. O gênero Leptodactylus (Fitzinger, 1826) compreende 89 espécies distribuídas no Sul da América do Norte, América do Sul e nas Índias Ocidentais (Frost, 2011). As espécies de Leptodactylus foram divididas baseadas em morfometria e comportamento, em cinco grupos de espécies: L. fuscus, L. melanonotus, L. ocellatus, L. pentadactylus e L. marmoratus (Heyer, 1969). 62

66 A espécie Leptodactylus fuscus, conhecida popularmente como rã-assobiadeira, apresenta focinho longo e obtuso em vista dorsal; alguns espécimes podem apresentar uma linha dorsal clara e a íris é sempre bronze (Bastos et al., 2003). O dorso é castanho esverdeado, com seis pregas longitudinais e pequenas manchas negras, possuem porte médio para o gênero, possuindo os machos 44 a 47 mm e as fêmeas 45 a 47 mm (Lima et al., 2006). Esta rã é uma espécie terrestre e noturna, encontrada em campos abertos, savanas, pastagens, áreas pantanosas, florestas degradadas e habitat urbanos (Reynolds et al., 2004). Sua distribuição é ampla na América do Sul e Central, sendo encontrada desde o Panamá até a Argentina (Frost, 2011). Leptodactylus latrans é considerada uma rã de grande porte, os machos podem medir entre 90 e 120 mm, enquanto que as fêmeas medem entre 80 e 110 mm, possuem dorso escuro, cinzento, oliváceo ou castanho avermelhado, com grandes ocelos negros dispostos irregularmente. Esta espécie é frequentemente encontrada em lagoas, lagos ou áreas alagadas, onde a desova é depositada em grandes ninhos de espuma. É uma espécie carnívora e sua dieta consiste de insetos, aracnídeos, miriápodes e anelídeos (AmphibiaWeb, 2011). Sua distribuição geográfica abrange toda a América do Sul Cisandina (Rangel & Ferreira, 2007). Diferentes fenótipos são frequentemente observados em indivíduos de uma única espécie que habitam regiões geográficas distintas ou que são expostos a várias condições ambientais (Gould & Johnston, 1972). A análise da variabilidade geográfica intraespecífica da morfologia revelou, em muitas situações, grande variação no tamanho corporal entre os anfíbios (Babik & Rafinski, 2000; Castellano et al., 2000). A morfometria é definida como o estudo da forma e sua relação com o tamanho. Diversas disciplinas têm utilizado em seus estudos a morfometria como ferramenta. Os taxonomistas empregam estudos morfométricos para mensurar as diferenças existentes entre espécies. Os ecólogos relacionam a forma e o tamanho de um organismo com aspectos como alimentação, uso do microhábitat, dentre outros, sempre enfatizando que a morfometria de um indivíduo é o resultado final de sua evolução. Já os geneticistas, especialmente os quantitativos, se interessam em medir a herdabilidade de caracteres morfométricos (Peres-Neto, 1995). 63

67 Os métodos da morfometria podem ser utilizados para a percepção de diferenças sutis entre populações (Reyment et al., 1981), por meio de medidas corporais padrão para cada espécie (ver Figura 3.3). Em estudos de diferenciação morfométrica, no contexto de hipóteses históricas, a morfometria tem um papel peculiar que é o de descrever a natureza da variação morfológica. Contudo, este tipo de análise não é comum, pois necessita de hipóteses filogenéticas deduzidas de fontes diferentes daquelas utilizadas na morfometria. Já os métodos que utilizam análises matriciais e os que são estritamente geométricos serão essenciais tanto nos estudos de mecanismos e padrões de diversificação a nível de organismo como no estudo de processos de estabilidade evolutiva (Reis, 1988). A morfometria multivariada é importante na percepção de diferenças, assim como no estudo das variações de caracteres quantitativos (Cavalcanti & Lopes, 1993). O desenvolvimento de métodos de análise multivariada e a disponibilidade de pacotes estatísticos têm auxiliado na avaliação da diferença integrada do organismo e comparações de formas e estruturas, as quais são indispensáveis ao estudo da sistemática (Neff & Marcus 1980; Reyment, 1985). Dentre as técnicas multivariadas mais aplicadas a ecologia e sistemática estão as análises de componentes principais e a análise das funções discriminantes (Peres-Neto, 1995). Estudos utilizando morfometria em diferentes espécies têm sido realizados com a finalidade de investigar os padrões de variação morfológica entre grupos ou populações podem ser encontrados na literatura (Querino & Zucchi, 2004; Cabral et al., 2004; Absalão et al., 2005; Silva et al, 2008; Da Silva et al., 2009; Napoli et al., 2009). No entanto, trabalhos com anuros, em especial L. fuscus e L. latrans são escassos. No Estado de Sergipe foram observadas diferenças morfométricas, principalmente em tamanho, em amostras populacionais de L. fuscus e L. latrans. Esta observação levanta duas possibilidades: 1) que essas diferenças sejam apenas variações fenotípicas adaptativas às localidades onde as espécies se encontram ou 2) de que sejam espécies distintas dos complexos L. fuscus e L. latrans. Assim, este trabalho teve como objetivo caracterizar morfometricamente amostras populacionais de L. fuscus e L. latrans do Estado de Sergipe, na tentativa de responder a essas questões. 64

68 MATERIAL E MÉTODOS Animais Os exemplares de Leptodactylus fuscus e Leptodactylus latrans, utilizados neste trabalho, (Figura 3.1 e Tabela 3.1) foram provenientes dos municípios de Carira (10º S e 37 º O), Poço Redondo (9º S e 37 º O) e Tobias Barreto (11 o S e 38 º O), todos pertencentes ao Estado de Sergipe (Figura 3.2). (A) (B) Figura 3.1: Imagens de animais provenientes da Unidade de Conservação Estadual Monumento Natural Grota do Angico do município de Poço Redondo SE: (A) Leptodactylus latrans; (B) Leptodactylus fuscus. CRC de L. fuscus: 44 mm e CRC de L. latrans: 53 mm (Foto: Betejane de Oliveira). 65

69 Figura 3.2: Área de estudo e sua localização relativa no Brasil e no Estado de Sergipe - municípios de Poço Redondo, Carira e Tobias Barreto. (Modificado, Tabela 3.1: Relação das espécies, localidade, sexo e número de exemplares analisados. Espécie Localidade Sexo N. de exemplares Leptodactylus fuscus Poço Redondo - SE Macho 3 Indeterminado 5 Tobias Barreto - SE Macho 4 Fêmea 6 Leptodactylus latrans Carira - SE Macho 10 Fêmea 11 Poço Redondo - SE Macho 10 Fêmea 11 Indeterminado 4 Tobias Barreto - SE Macho 4 Fêmea 4 66

70 Análises Morfométricas Para a análise morfométrica foram utilizados 72 indivíduos (21 de Carira, 33 de Poço Redondo, e 18 de Tobias Barreto) (Tabela 3.1), dos quais foram tomadas 21 medidas com o auxílio de um paquímetro digital (Digimess, precisão de 0,01 mm): comprimento (CC), altura (ACA) e largura da cabeça (LCA); distâncias olho-narina (DON), interocular (DIO) e internasal (DI), diâmetros do olho (DO) e do tímpano (DT); comprimento rostrocloacal (CRC); altura (ACO) e largura do corpo (LC), comprimento (CB) e largura do braço (LB); comprimento (CAB) e largura do antebraço (LAB); comprimento (CCX) e largura da coxa (LCX); comprimento (CPE) e largura da perna (LPE); e comprimentos da mão (CM) e do pé (CP) (Figura 3.3). Figura 3.3: Características morfológicas: CC, comprimento da cabeça; ACA, altura da cabeça; LCA, largura da cabeça; DON, distância olho-narina; DIO, distância interocular; DO, diâmetro do olho; DI, distância internasal; DT, Diâmetro do tímpano; CRC, comprimento rostro-cloacal; ACO, altura do corpo; LC, largura do corpo; LB, largura do braço; CB, comprimento do braço; LAB, largura do ante-braço; CAB, comprimento do ante-braço; CM, comprimento da mão; LCX, largura da coxa; CCX, comprimento da coxa; LPE, largura da perna; CPE, comprimento da perna; CP, comprimento do pé (Desenho: Betejane de Oliveira). 67

71 Antes das análises todas as variáveis morfométricas foram log 10 -transformadas visando aproximar a amostra de uma distribuição normal e reduzir os efeitos de escala. Os tamanhos (CRC) dos espécimes e suas massas foram comparados por análises de variância (ANOVA) para dois fatores (espécie e área), seguido do teste de Tukey. Uma Análise de Componentes Principais (ACP) dos dados morfológicos log 10 - transformados foi realizada para distinguir possíveis grupos ecomorfológicos e identificar quais variáveis melhor explicam os agrupamentos. Para refinar um pouco mais as informações, os dois primeiros componentes principais foram testados separadamente por análises de variância, também para dois fatores (espécies e área), seguidas do teste de Tukey. O primeiro eixo (eixo isomérico), gerado a partir da Análise de Componentes Principais, representa a contribuição de todas as variáveis morfométricas em relação aquilo que chamamos de tamanho. Já o segundo eixo (eixo alométrico) refere-se à contribuição das variáveis morfométricas na forma dos organismos (Peres-Neto, 1995). Todos os dados foram armazenados em planilhas do Excel 2007 e as análises realizadas no programa Systat 12.0 (Wilkinson, 1990). O nível de significância adotado para os testes de hipóteses foi de 5%. Todos os animais foram depositados na Coleção Herpetológica da Universidade Federal de Sergipe (CHUFS), São Cristóvão, Sergipe. RESULTADOS Um resumo da morfometria dos 72 espécimes de L. fuscus e L. latrans dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, Estado de Sergipe está disponível na Tabela

72 Tabela 3.2: Estatística descritiva das variáveis morfométricas de indivíduos de L. fuscus e L. latrans dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, Estado de Sergipe, Brasil. Medidas lineares são dadas em milímetros e a massa em gramas. Leptodactylus fuscus Leptodactylus latrans Variáveis Poço Redondo Tobias Barreto Carira Poço Redondo Tobias Barreto Média ± dp Mín. - Máx. Média ± dp Mín. - Máx. Média ± dp Mín. - Máx. Média ± dp Mín. - Máx. Média ± dp Mín. - Máx. Massa 7,6 ± 0,9 6,0-9,0 7,9 ± 1,3 6,2-10,0 27,9 ± 13,6 6,0-59,0 14,7 ± 11,5 4,0-39,0 36,2 ± 21,1 12,0-77,0 Comprimento rostro-cloacal 44,3 ± 2,7 40,9-48,3 44,0 ± 1,7 42,0-48,0 64,7 ± 10,7 43,4-92,2 53,3 ± 12,7 36,0-74,2 73,1 ± 14,4 53,0-98,5 Largura do corpo 18,2 ± 3,5 13,8-23,6 19,7 ± 2,7 13,2-23,0 29,8 ± 10,0 19,2-68,4 21,1 ± 7,2 8,8-34,7 33,4 ± 12,8 16,0-58,0 Altura do corpo 13,0 ± 2,2 9,5-16,6 14,8 ± 2,1 12,0-18,5 18,2 ± 5,5 7,9-29,7 11,5 ± 3,3 7,2-18,4 23,8 ± 7,3 13,0-31,8 Comprimento da cabeça 13,4 ± 1,2 11,8-15,7 13,7 ± 1,8 11,1-16,2 20,0 ± 4,0 13,7-30,9 16,1 ± 4,4 3,8-26,0 23,0 ± 4,8 17,1-31,5 Largura da cabeça 16,0 ± 1,0 14,2-17,0 15,2 ± 0,9 14,2-17,2 22,5 ± 3,5 15,6-29,9 18,4 ± 4,1 12,8-26,7 24,8 ± 5,6 16,5-33,8 Altura da cabeça 12,5 ±2,2 8,2-15,1 11,0 ± 1,4 9,5-13,5 14,3 ± 2,7 8,8-18,9 11,0 ± 2,7 7,8-17,2 16,0 ± 4,3 10,0-23,0 Diâmetro do tímpano 3,4 ± 0,3 2,9-3,8 3,6 ± 0,6 3,0-5,0 5,2 ± 0,7 3,7-6,6 4,4 ± 0,8 3,1-6,0 6,2 ± 1,2 4,8-8,2 Distância inter-ocular 6,7 ± 1,0 5,7-8,4 6,6 ± 0,5 6,1-7,5 10,2 ± 1,9 5,9-16,9 8,7 ±1,9 3,5-12,1 10,4 ± 1,8 8,0-13,0 Distância olho-narina 4,8 ± 0,5 4,0-5,8 4,5 ± 0,4 3,5-5,1 6,6 ± 1,4 3,5-11,6 6,0 ± 1,2 3,8-8,2 14,1 ± 18,9 6,0-61,0 Diâmetro do olho 5,2 ± 0,5 4,6-6,3 5,4 ± 0,8 4,2-6,5 6,9 ± 1,5 4,5-9,9 5,4 ± 0,9 3,5-6,8 8,1 ± 1,3 6,2-9,8 Distância Inter-nasal 3,8 ± 0,4 2,9-4,2 3,8 ± 0,5 3,0-5,1 4,7 ± 0,6 3,4-6,2 3,8 ± 0,6 2,9-4,9 5,4-0,7 4,2-6,5 Comprimento do braço 5,8 ± 1,1 4,6-7,7 5,1 ± 0,8 4,0-7,0 9,7 ± 2,2 6,0-14,8 8,1 ± 2,2 4,7-12,9 10,4 ± 3,1 6,0-16,0 Largura do braço 4,2 ± 0,4 3,2-4,9 4,5 ± 0,4 3,9-5,2 5,8 ± 1,4 3,9-8,6 4,3 ± 1,2 2,7-8,4 7,4 ± 2,6 5,0-13,0 Comprimento do antebraço 7,0 ± 0,6 6,0-8,0 7,5 ± 0,8 6,0-8,8 11,1 ± 2,0 7,7-16,6 9,1 ± 1,9 6,3-12,8 13,2 ± 2,9 10,0-17,0 Largura do antebraço 3,9 ± 0,8 3,1-5,6 4,2 ± 0,5 3,5-5,2 5,9 ± 1,2 4,0-8,2 4,7 ± 1,5 2,8-9,8 6,9 ± 1,6 4,8-9,0 Comprimento da mão 9,1 ± 0,5 8,4-10,1 8,9 ± 0,6 7,9-10,1 13,2 ± 2,2 7,2-16,6 10,4 ± 2,8 5,6-16,1 15,0 ± 2,7 11,8-20,0 Comprimento da coxa 16,1 ± 1,3 14,4-18,5 17,8 ± 2,0 14,3-20,5 28,6 ± 5,3 15,1-39,8 24,2 ± 6,2 17,0-36,0 30,5 ± 5,0 25,2-40,0 Largura da coxa 8,8 ± 2,3 3,7-10,8 10,4 ± 1,3 8,3-12,5 15,1 ± 2,8 10,2-19,5 11,0 ± 3,3 7,1-17,9 16,2 ± 1,5 13,7-18,0 Comprimento da perna 20,9 ± 3,1 16,5-23,6 20,5 ± 2,1 17,1-23,0 30,2 ± 5,1 17,9-42,4 26,6 ± 6,0 17,1-38,5 31,5 ± 5,4 24,3-38,0 Largura da perna 6,5 ± 1,2 4,9-8,4 7,6 ± 0,7 6,2-8,5 10,7 ± 2,0 6,5-13,5 8,1 ± 3,1 4,7-19,7 10,7 ± 2,5 7,5-15,5 Comprimento do pé 31,4 ± 2,2 28,0-35,2 28,9 ± 2,6 24,0-32,0 46,2 ± 7,2 29,9-60,0 38,1 ± 8,4 26,8-53,6 48,1 ± 7,9 38,1-62,0 69

73 Diferenças foram verificadas nos tamanhos (CRC) (ANOVA, F 4,67 = 15,142; P < 0,0001) e nas massas (ANOVA, F 4,67 = 13,629; P < 0,0001) dos indivíduos entre as localidades estudadas (Figura A 3.1 e 3.2). Porém, essas diferenças foram representativas apenas para L. latrans (Tabela 3.3). Os indivíduos de maiores tamanhos e massa foram encontrados nas populações de Carira e Tobias Barreto (Tabela 3.2). Tabela 3.3: Diferenças em relação à Massa e CRC, utilizando a análise de variância para dois fatores (espécie e área) seguida do Teste de Tukey (p < 0,05), para as espécies L. fuscus e L. latrans dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. MASSA CRC Espécie - Área Espécie - Área Valor de p Valor de p L. latrans - Poço Redondo L.latrans - Carira <0,0001 0,002 L. latrans - Poço Redondo L. latrans - Tobias Barreto 0,001 <0,0001 L. latrans - Carira L. latrans - Tobias Barreto 0,896 0,532 L. latrans - Poço Redondo L. fuscus - Tobias Barreto 0,535 0,122 L.latrans - Carira L. fuscus - Tobias Barreto <0,0001 <0,0001 L. fuscus - Poço Redondo L. fuscus - Tobias Barreto 1,000 1,000 L. fuscus - Poço Redondo L. latrans - Poço Redondo 0,535 0,207 L. fuscus - Poço Redondo L.latrans - Carira <0,0001 <0,0001 L. fuscus - Poço Redondo L. latrans - Tobias Barreto <0,0001 <0,0001 L. fuscus - Tobias Barreto L. latrans - Tobias Barreto <0,0001 <0,0001 Variações adicionais em tamanho (PC1 - eixo isométrico) e forma (PC2 - eixo alométrico) foram expressas nos resultados da Análise de Componentes Principais (ACP). Sendo que, os dois primeiros componentes, acumularam juntos pouco mais de 80% da variação explicada pelo conjunto da ACP (PC1 = 73,90% e PC2 = 6,225). Diferenças significativas no tamanho (PC1 - eixo isométrico) entre as populações foram também confirmadas com este tipo de tratamento (ANOVA, F 4,67 = 18,188; P < 0,0001) (Figura A 3.3), tendo os caracteres: comprimento rostro-cloacal, largura da cabeça, diâmetro do tímpano, comprimento do antebraço, largura d0o antebraço, comprimento da mão e comprimento do pé contribuído mais com estas variações (Tabela 3.4 e Tabela 3.5). 70

74 Tabela 3.4: Escores dos cinco primeiros Componentes Principais para caracteres morfométricos de L. fuscus e L. latrans dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. Variáveis Tabela 3.5: Resultado da análise de variância para os fatores (espécie e área) adotando o primeiro componente principal (PC1) com o Teste de Tukey (p < 0,05), para as espécies L. fuscus e L. latrans dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. Componentes Principais Comprimento rostro-cloacal 0,969-0,031 0,011-0,071 0,026 Largura do corpo 0,874 0,123 0,004 0,023 0,063 Altura do corpo 0,787 0,379 0,013 0,304 0,131 Comprimento da cabeça 0,825-0,026-0,150-0,227-0,357 Largura da cabeça 0,962 0,024 0,040-0,119-0,048 Altura da cabeça 0,758 0,421 0,024-0,090-0,089 Diâmetro do tímpano 0,927-0,054-0,028 0,031-0,122 Distância inter-ocular 0,724-0,466 0,218 0,327 0,049 Distância olho-narina 0,582-0,293-0,737 0,062 0,088 Diâmetro do olho 0,842 0,211 0,000 0,195-0,297 Distância Inter-nasal 0,855 0,092-0,083 0,363-0,065 Comprimento do braço 0,843-0,358 0,220 0,057-0,068 Largura do braço 0,845 0,348 0,001 0,064 0,040 Comprimento do antebraço 0,910-0,099 0,010 0,028-0,120 Largura do antebraço 0,902 0,144 0,054-0,078 0,201 Comprimento da mão 0,912 0,043-0,055 0,031 0,200 Comprimento da coxa 0,866-0,388 0,065-0,102 0,096 Largura da coxa 0,870 0,137 0,008-0,177 0,224 Comprimento da perna 0,887-0,300 0,086-0,136-0,026 Largura da perna 0,888 0,200 0,023-0,253 0,020 Comprimento do pé 0,937-0,171 0,058 0,100 0,056 Variância explicada pelos componentes 15,520 1,308 0,693 0,602 0,441 Porcentagem da variância 73,905 6,227 3,301 2,869 2,101 Espécie - Área Espécie - Área Valor de p L. latrans - Poço Redondo L.latrans - Carira <0,0001 L. latrans - Poço Redondo L. latrans - Tobias Barreto <0,0001 L. latrans - Carira L. latrans - Tobias Barreto 0,442 L. latrans - Poço Redondo L. fuscus - Tobias Barreto 0,326 L.latrans - Carira L. fuscus - Tobias Barreto <0,0001 L. fuscus - Poço Redondo L. fuscus - Tobias Barreto 0,999 L. fuscus - Poço Redondo L. latrans - Poço Redondo 0,258 L. fuscus - Poço Redondo L.latrans - Carira <0,0001 L. fuscus - Poço Redondo L. latrans - Tobias Barreto <0,0001 L. fuscus - Tobias Barreto L. latrans - Tobias Barreto <0,

75 Já no segundo componente principal (PC2 eixo alométrico), as divergências na forma (ANOVA, F 4,67 = 14,862; P < 0,0001) foram positivamente relacionadas com a altura do corpo, altura da cabeça e largura do braço; e inversamente relacionadas com a distância do tímpano, comprimento do braço e comprimento da coxa (Tabela 3.6). Tabela 3.6: Resultado da análise de variância para os fatores (espécie e área) adotando o segundo componente principal (PC2) com o Teste de Tukey (p < 0,05), para as espécies L. fuscus e L. latrans dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. Espécie - Área Espécie - Área Valor de p L. latrans - Poço Redondo L.latrans - Carira 0,011 L. latrans - Poço Redondo L. latrans - Tobias Barreto 0,011 L. latrans - Carira L. latrans - Tobias Barreto 0,902 L. latrans - Poço Redondo L. fuscus - Tobias Barreto <0,0001 L.latrans - Carira L. fuscus - Tobias Barreto 0,001 L. fuscus - Poço Redondo L. fuscus - Tobias Barreto 0,874 L. fuscus - Poço Redondo L. latrans - Poço Redondo <0,0001 L. fuscus - Poço Redondo L.latrans - Carira 0,074 L. fuscus - Poço Redondo L. latrans - Tobias Barreto 0,591 L. fuscus - Tobias Barreto L. latrans - Tobias Barreto 0,104 A projeção dos escores individuais resultantes da análise dos componentes principais apresentou agrupamentos peculiares, em PC1 entre as amostras, de acordo com a localidade. Um dos grupos é formado por L. fuscus das duas localidades (Poço Redondo e Tobias Barreto) e L. latrans de Poço Redondo. O outro grupo reuniu L. latrans de Carira e Tobias Barreto (Figura 3.4). Porém, quando esta projeção é analisada com ênfase em PC2 as amostras ficam difusas, não demonstrando aglomeração (Figura 3.4). 72

76 A : L. fuscus de Poço Redondo B: L. fuscus de Tobias Barreto C: L. latrans de Poço - Redondo D: L. latrans de Carira E: L. latrans de Tobias Barreto Figura 3.4: Projeção dos escores individuais resultantes da Análise dos Componentes Principais (ACP) para as variáveis morfométricas de exemplares adultos de Leptodactylus fuscus e Leptodactylus latrans provenientes dos municípios de Carira, Poço Redondo e Tobias Barreto, SE. DISCUSSÃO A ampla distribuição geográfica do gênero Leptodactylus (Fitzinger, 1826) (Frost, 2011), nas diversas zonas climáticas e fisiográficas tem levantado inúmeros questionamentos de caráter taxonômico. À medida que a compreensão da sistemática de anfíbios melhora, muitas espécies que são consideradas de grande distribuição geográfica têm mostrado tratar-se de duas ou mais espécies estreitamente relacionadas, com faixas geograficamente reduzidas. Em anfíbios, diferentes técnicas têm sido empregadas para resolver problemas de limite de espécies: moleculares, bioquímicas e citogenéticas (Wynn & Heyer, 2001). 73

77 As espécies Leptodactylus fuscus e Leptodactylus latrans são encontradas no Estado de Sergipe em regiões de Mata Atlântica e Caatinga, onde vivem associadas à serrapilheira ou próximos à água. Embora já existam alguns trabalhos de revisão sistemática e taxonômica dessas espécies na literatura, ainda não há estudo nesta linha de pesquisa, nem envolvendo análise morfométrica, com os animais do Estado de Sergipe. Nas duas populações de L. fuscus analisadas neste trabalho, não foram verificadas diferenças nos tamanhos e nas massas dos indivíduos. Em estudos realizados com L. fuscus, no geral, não se observou variação de tamanho entre diferentes localidades. Indivíduos observados por Lima et al. (2006) e De-Carvalho et al. (2008) apresentaram CRC que mediam de 44 a 47 mm e 42 a 52 mm, respectivamente. Esses valores são próximos aos encontrados para as populações de Sergipe (40,9 48,3 mm). Porém, os espécimes de L. latrans diferiram na massa e no tamanho entre as populações analisadas nesse estudo. Diferenças no tamanho (PC1 - eixo isométrico) entre as populações foram também confirmadas com a análise dos componentes principais, o que reforça a análise inicial dos dados. As divergências em forma têm que ser avaliadas com certa cautela visto que o segundo componente principal (PC2 eixo alométrico), acumulou menos de 7% da variação obtida pela análise. O tamanho do corpo é a mais importante fonte de variação morfométrica, tanto a nível intra e inter-populacional. Porém a forma do corpo, apesar de ter um papel secundário na explicação de variação, ainda mantém alto poder discriminatório entre as populações (Rosso et al., 2004). Neste estudo, o comprimento rostro-cloacal de L. latrans variou de 43 a 98 mm. Gallardo (1964) em seu trabalho encontrou CRC de 92 a 120 mm, próximo àqueles disponíveis no site (80 a 120 mm). Teixeira & Vrcibradic (2003) observaram variação de 18,5 a 100,4mm e, em estudo mais recente de Solé et al. (2009), com indivíduos coletados na Bahia, o valor encontrado ficou entre a mm. Desde modo, os dados amostrados no presente estudo mostraram tamanho inferior aos já descritos na literatura. 74

78 As análises morfométricas realizadas aqui, permitiram agrupar as diferentes populações de L.latrans em dois blocos baseados em variações, principalmente, no tamanho dos indivíduos (PCI). Os grupos formados compreendem: 1) populações de Carira e Tobias Barreto, as quais mostraram-se mais semelhantes, 2) a população de Poço Redondo, que se diferenciou significantemente das outras localidades já citadas. As divergências morfométricas observadas entre os 2 grupos foram concordantes com a distância entre cada um deles, visto que as amostragens foram realizadas entre extremos de distribuição no Estado. Os dados mostram que as populações de Tobias Barreto e Carira são muito semelhantes, no entanto, existem diferenças entre as amostras de Carira e Poço Redondo, assim como entre os espécimes de Tobias Barreto e Poço Redondo. Segundo Gould & Johnston (1972), entre indivíduos de uma mesma espécie, podem existir distintos fenótipos quando habitam diferentes regiões geográficas ou são expostos a várias condições ambientais. Em anuros, o tamanho do corpo de um indivíduo adulto depende de muitos fatores, incluindo o tempo de metamorfose, a taxa de crescimento antes e depois da maturidade, a idade da maturidade e a longevidade (Rosso et al., 2004). Contudo, além destas variáveis, as diferenças ambientais e genéticas podem causar diversidade do desenvolvimento ontogenético, resultando em variação de tamanho corporal entre populações (Silva et al., 2008). A análise dos períodos de desenvolvimento das populações podem explicar a variação do tamanho do corpo, de acordo com a região geográfica. No presente estudo, foram coletados indivíduos aparentemente adultos, cujo fase de maturidade foram confirmados com a análise das suas gônadas; em alguns indivíduos, porém, não foi possível determinar o sexo. A água também tem um efeito muito importante sobre a morfologia e desenvolvimento larval e, portanto, é um fator relevante para o tamanho do corpo em animais ectotérmicos (Atkinson, 1996). Deste modo, informações dos dados fisicoquimicos em escala local, tais como temperatura e ph do ambiente aquático durante o desenvolvimento do girino, devem ser levadas em consideração. 75

79 Adaptações fisiológicas e comportamentais ao estresse hídrico têm sido encontradas em estágios larval e adulto em L. fuscus, principalmente em climas secos, onde é característica a sazonalidade (Downie & Smith, 2003). De acordo com Rothermel & Smelistch (2002), os anfíbios evitam ambientes abertos, como campos e estradas, e se deslocam principalmente em áreas florestais. Esse comportamento é justificado pelo aumento de risco da dessecação e da predação em áreas abertas (Spear et al., 2005). Algo semelhante pode estar ocorrendo com L. latrans provenientes da Caatinga de Sergipe, uma vez que este bioma é formado por diversas composições florísticas adaptadas ao clima semi-árido, apresentando um aspecto de mosaico de ambientes (Ab Saber, 1977). O comportamento dos animais pode ser responsável pelo reduzido fluxo gênico, causando diferenciação genética e morfológica entre populações (Silva et al., 2008). Em estudo realizado por Camargo et al. (2006) com dezesseis populações de L. fuscus distribuídas em Tobago, Trindade, Guiana, Guiana Francesa, Brasil, Bolívia, Argentina, Panamá e Uruguai, os dados morfológicos e acústicos mostraram que o complexo L. fuscus se trata somente de uma espécie, enquanto que os resultados moleculares apoiam a hipótese de um grupo com várias espécies. Assim, foram atribuídos três clados (A, B e C) ocorrendo no nordeste, sul e sudeste, e oeste da América do sul, respectivamente, em diferentes unidades filogenéticas. Os autores sugerem uma hipótese de delimitação de espécie de L. fuscus em três linhagens geográficas, mas alertam para a necessidade de estudos mais amplos que incluam dados de campo, história natural e dados moleculares. Pelo exposto, as populações de L. fuscus analisadas morfometricamente neste trabalho não mostraram variação significativa, ao contrário das amostras de L. latrans, o que permite sugerir a existência de uma considerável plasticidade adaptativa nesta espécie, a qual pode ocorrer em função dos diferentes ambientes explorados e das condições fisicoquímicos locais. Contudo, como atestado por Wynn et al. (2001) e Camargo et al. (2006) as espécies podem não variar na morfologia e acústica, porém com técnicas moleculares as diferenças podem apresentar-se expressivas indicando várias unidades filogenéticas. 76

80 CONCLUSÃO Os dados coletados no presente estudo nos permite concluir que não houve diferenças morfométricas significativas entre os espécimes de L. fuscus dos municípios estudados. Porém, as populações de L. latrans diferiram na massa e no tamanho entre as amostras. Variações no tamanho destas populações foram também confirmadas com a análise dos componentes principais (PC1), o que reforça a análise inicial dos dados. Os exemplares de Carira e Tobias Barreto mostraram-se mais semelhantes, apresentando maiores tamanhos, enquanto que os indivíduos de Poço Redondo foram os menores. Contudo, as divergências em forma necessitam de uma avaliação com certa cautela, visto que o segundo componente principal (PC2) acumulou menos de 7% da variação obtida pela análise. O tamanho do corpo do anuro adulto depende de muitos fatores, incluindo o tempo de metamorfose, a taxa de crescimento antes e depois da maturidade, dentre outros, além das diferenças ambientais e genéticas, as quais podem causar diversidade do desenvolvimento ontogenético, resultando em variação de tamanho corporal entre populações. Assim, analisando somente dados morfométricos fica difícil responder se estas diferenças são apenas variações fenotípicas adaptativas às localidades onde as espécies se encontram. As informações geradas neste estudo ampliaram o conhecimento sobre as espécies L. fuscus e L. latrans presentes em Sergipe. Porém, para responder mais diretamente as questões discutidas, novas pesquisas devem ser realizadas, inclusive abrangendo outras áreas do Estado, utilizando outras ferramentas e metodologias. 77

81 CONSIDERAÇÕES FINAIS A família Leptodactylidae tem sido objeto de estudo taxonômico e sistemático há várias décadas, devido a questionamentos sobre a sua monofilia. Graças ao advento da biologia molecular e técnicas refinadas da citogenética, grandes revisões taxonômicas foram realizadas, resultando em importantes mudanças na taxonomia e sistemática dos anfíbios em geral. No entanto, o número de espécies cariotipadas ainda é relativamente pequeno. No Estado de Sergipe, as informações sobre a anurofauna são escassas, incluindo as mais básicas como, por exemplo, dieta, recursos espaciais mais utilizados, período reprodutivo. Porém, mesmo ainda pouco estudada, já se sabe que a biota da Caatinga não é pobre em espécies nem endemismos. Desta forma, o presente trabalho se propôs a analisar cariotipicamente e morfologicamente populações de L. fuscus e L. latrans de áreas de Caatinga do Estado de Sergipe, a fim de contribuir com o conhecimento dessas espécies e nesse bioma, além de aumentar a coleção de anurofauna do Estado. Os dados cariotípicos mostram que as espécies analisadas possuem número diploide 2n=22, composto por cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos. As populações de L. fuscus não apresentaram diferenças interpopulacionais com relação à banda C; no entanto, foi observada variação no padrão de banda C entre as populações de L. latrans. Resultados semelhantes foram obtidos por meio das análises morfométricas, onde as populações de L. fuscus não mostraram variação significativa, ao contrário das amostras de L. latrans. Desse modo, quando juntamos os dados morfométricos aos dados citogenéticos, podemos verificar que houve uma complementação nos resultados. Estas informações sugerem variação geográfica do cariótipo e do tamanho do corpo, podendo confirmar ou mesmo corroborar com a hipótese de um complexo de espécies, já que esta espécie tem ampla distribuição geográfica. Contudo, é necessária a realização de outros estudos citogenéticos com novos exemplares das espécies aqui amostradas, assim como, a utilização de técnicas mais 78

82 refinadas, incluindo as de citogenética molecular, na busca do entendimento dos mecanismos responsáveis pela diferenciação cariotípica entre esses anuros e das suas relações filogenéticas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABSALÃO, R.S. SILVA, P.H.A & DE PAULA, T.S. Shell morphometrics in four species of Gadilidae (Mollusca, Scaphopoda) in Southwestern Atlantic Ocean, Brazil. Rev. Bras. Zool. 22 (1): , AB SABER, A.N. Espaços ocupados pela extensão dos climas secos na América do Sul, por ocasião dos períodos glaciais quaternários. Paleoclimas. 3: AMPHIBIAWEB: Information on amphibian biology and conservation. [web application] Berkeley, California: AmphibiaWeb. Disponível em < acessado em Jan, ANGULO, A.; COCROFT, R.B. & REICHLE, S. Species identity in the genus Adenomera (Anura: Leptodactylidae) in southeastern Peru. Herpetologica 59: , ATKINSON, D. Ectotherm life-history responses to developmental temperature. In: Johnston, I.A. & Bennett, A.F. eds. Animals and temperature: phenotypic and evolutionary adaptation. Cambridge, Cambridge University. p BABIK, W. & RAFINSKI, J. Morphometric differentiation of the moor frog (Rana arvalis Nilss.) in Central Europe. J. of Zoology and Systematic Evolutionary Research 38: , BASTOS, R.P.; MOTTA, J.A de O.; LIMA, L.P.; GUIMARÃES, L.D.A. Anfíbios da Floresta Nacional de Silvânia, estado de Góias. Stylo Gráfica e Editora, 82p

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88 APÊNDICE CAPÍTULO 1 A B C Figura A 1.1: Lagoas temporárias onde foram realizadas as coletas de L. fuscus e L. latrans. A: Carira, B: Poço Redondo e C: Tobias Barreto, SE. 85