Transferabilidade de locos microssatélites de Brycon sp. para Salminus franciscanus

Transcrição

1 1 Transferabilidade de locos microssatélites de Brycon sp. para Salminus franciscanus (Characiformes, Characidae) Bruno C Rossini 1 *, Pedro M Galetti Jr 1, Patrícia D Freitas 2 1 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, Via Washington Luiz km 235, Caixa Postal 676, CEP , São Carlos, SP, Brasil. 2 Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal da Bahia, Rua Barão de Jeremoabo, s/ número, Campus de Ondina, , Salvador, BA, Brasil * autor para correspondência: bu_rossini@yahoo.com.br Palavras-chave: conservação, dourado, genética de populações Título abreviado: Microssatélites heterólogos para o Dourado

2 2 ABSTRACT The species Salminus franciscanus, commonly known as dourado of São Francisco, is very appreciated in the sporting fishing and gastronomy. It is endemic of São Francisco River basin and an excellent migratory fish. Due to its great importance and the intense human mediated activities, such as fishing, degradation of their habitats and construction of hydroelectric dams, many populations are under threat. In order to access the genetic variability of natural populations, molecular markers such as microsatellites, have been widely used. However, species-specific microsatellites loci are not still described for this species and its demand expensive costs and laboratorial efforts. Inside this context, the present work had as objectives to validate a set of efficient microsatellite markers for S. franciscanus using heterologous loci, described for other species related to the Salminus group. Until now ten loci, described for two species of Brycon (B. hilarii, Sanches & Galetti, 2006 e B. opalinus, Barroso et al., 2003), were tested through PCR as proposed by the authors. From this total, five loci demonstrated satisfactory patterns of amplification in S. franciscanus. We hope with this work to supply a group of valuable information that subsidize the conservation studies and handling of this important migratory fish, besides contribute to a better understanding of aspects related to the reproductive behavior of this species. RESUMO A espécie Salminus franciscanus, comumente conhecida como dourado do São Francisco, é muito apreciada na pesca esportiva e gastronomia. Este peixe é endêmico da bacia do Rio São Francisco e é considerado um excelente migrador. Devido à sua grande importância e a intensa ação antrópica que vem sofrendo, principalmente devido

3 3 à pesca, degradação de seus hábitats e construção de barragens hidrelétricas, muitas populações de dourado encontram-se hoje sob ameaça. Na tentativa de acessar informações como variabilidade genética de populações naturais, marcadores microssatélites têm sido amplamente utilizados. No entanto, locos microssatélites para dourado ainda não foram descritos, apesar de já estarem sendo prospectados. Dentro deste contexto, o presente trabalho teve como objetivos validar um conjunto de marcadores microssatélites eficientes para S. franciscanus através do uso de locos heterólogos, descritos para outras espécies relacionadas ao grupo Salminus. Até o momento foram testados dez locos descritos para duas espécies de Brycon (B. hilarii, Sanches & Galetti, 2006 e B. opalinus, Barroso et al., 2003). Deste total, cinco locos evidenciaram padrão satisfatório de amplificação em S. franciscanus, demonstrando potencial de uso para os estudos genéticos nesta espécie. Esperamos com este trabalho fornecer, por hora, um conjunto eficiente de locos microssatélites, que sirvam para avaliar a estrutura genética deste importante peixe migrador visando subsidiar os estudos de conservação e manejo além do melhor entendimento de aspectos relacionados ao comportamento reprodutivo desses animais. INTRODUÇÃO A bacia do Rio São Francisco e a espécie Salminus franciscanus A bacia do Rio São Francisco cobre uma área de 7.4% do território brasileiro. Ela atravessa cinco estados brasileiros com quase 2700km de comprimento total, com 36 tributários no total e sendo dividida em quatro partes: alto (da nascente a cidade de Pirapora-MG), central (Pirapora a Remanso-BA), sub-central (Remanso a Paulo Afonso-BA) e baixo São Francisco (Paulo Afonso ao oceano Atlântico). O Rio São Francisco é de grande importância por causa de sua grande área de cobertura, além de

4 4 compreender diversos domínios ecológicos, da mata Atlântica ao Cerrado e Caatinga (Sato & Godinho, 2003). Segundo Sato & Godinho (2003), estão presentes na bacia 152 espécies de peixes, das quais, cerca de 8% é migradora. Dois grupos destacam-se com espécies economicamente importantes: Characiformes (S. franciscanus, Leporinus elongatus, Prochilodus affinis, por exemplo) e Siluriformes (Conorhynchus conirostris, Pseudoplatystoma corruscans, por exemplo). Estes peixes realizam migrações periódicas com fins de reprodução (piracema). As migrações ocorrem anualmente no período das chuvas (outubro a janeiro), quando o nível dos rios sobe, as temperaturas da água são mais altas e os dias mais longos. Dentro do grupo dos Characiformes temos a família Characidae, possuindo 952 espécies reconhecidas, englobando cerca de 12 subfamílias. Deste total, mais de 600 espécies estão distribuídas em 88 gêneros, na maioria dos casos, com colocação ainda incerta. A maior parte desses peixes pode ser encontrada na região Neotropical e é utilizada para alimentação humana e/ou aquariofilia (Lima et al., 2003). O gênero Salminus (Characidae) inclui atualmente quatro espécies, sendo elas: Salminus afinnis, Salminus brasiliensis, Salminus hilarii e Salminus franciscanus (Lima et al., 2003; Lima & Britski, 2007). Salminus affinis é encontrado apenas na Colômbia e Equador, no entanto, as outras espécies ocorrem na Argentina, Brasil, Bolívia, Paraguai, Uruguai, Peru e Venezuela. Estes peixes possuem tamanho médio a grande, podendo atingir até um metro de comprimento e pesar mais de 30 kg. O seu desenvolvimento é considerado lento e, em geral, somente após 25 anos o peixe passa a ter um significado comercial. Eles habitam grandes rios e possuem comportamento predatório, se alimentando, principalmente, de outros peixes (Godoy, 1975; Lima et al., 2003).

5 5 No Brasil, até pouco tempo atrás, acreditava-se haver apenas duas espécies representantes deste gênero: a espécie S. brasiliensis e a espécie S. hilarii, também chamada de tabarana (Lima et al., 2003). Recentemente, no entanto, foi descrita uma nova espécie de ocorrência na bacia do rio São Francisco, denominada S. franciscanus (Lima & Britski, 2007). Esta espécie pode alcançar 1.4 m de comprimento, sendo endêmica da bacia do Rio São Francisco e de grande importância econômica (Sato & Godinho, 2003; Lima & Britski, 2007). Em relação aos impactos ambientais, verifica-se a presença de barragens por toda a bacia, sendo seis grandes (Três Marias e Sobradinho, Itaparica, Moxotó, Complexo Paulo Afonso e Xingó) e outras seis menores nos tributários. Estas grandes barragens interferem na migração dos peixes ao longo do rio, porém duas pequenas barragens presentes nos tributários também demonstram efeitos negativos sobre a migração (Cajuru no rio Pará e Gafanhoto no rio Paraopeba). Além disso, há registro de declínio da produção pesqueira ao longo das décadas de 70, 80 e 90 na bacia do rio São Francisco (Sato & Godinho, 2003). A construção de reservatórios e hidrelétricas, por exemplo, cria barreiras para a migração de peixes. Como conseqüências dessas alterações, problemas genéticos secundários, advindos do número reduzido de indivíduos e alteração nos padrões de fluxo gênico das populações, podem contribuir efetivamente para o surgimento de isolados populacionais com constituição gênica divergente e, em alguns casos, na extinção de populações pouco viáveis (Moran, 2002; Vrijenhoek, 1998). A barragem de Três Marias, por exemplo, possui uma altura de 75m e nenhum sistema de passagem de peixes, tornando-se assim, uma barreira física intransponível aos peixes (Sato & Godinho, 2003).

6 6 Estudos realizados em peixes migradores de diferentes bacias hidrográficas têm observado tanto a presença de populações panmíticas (Revaldaves et al., 1997) quanto a presença metapopulações, ou seja, populações geneticamente diferenciadas que mantém fluxo gênico entre si (Hatanaka et al., 2006). Neste caso em específico, sob o ponto de vista conservacionista, a ocorrência e caracterização de populações geneticamente diferenciadas, as quais formam uma aparente única grande população, merece atenção especial, uma vez que a identificação de unidades geneticamente estruturadas implica em estratégias de manejo também diferenciadas (Frankham et al., 2004). No Brasil, as causas mais comuns de perda de biodiversidade em ambientes aquáticos estão ligadas a eutrofização do meio, assoreamento e níveis altos de poluição, além de fatores como introdução de espécies alóctones e atividade de pesca predatória (Agostinho et al., 2005). Segundo o Ministério do Meio Ambiente (MMA, 2004), aproximadamente 37 espécies de peixes Characiformes, 32 destas pertencentes à família Characidae, estão sob ameaça de extinção. Um grande problema para populações naturais, além de sua super-exploração para consumo, é a destruição e/ou interferência em seus habitats de reprodução e também a quebra de relações ecológicas importantes que podem propiciar uma redução significativa no tamanho efetivo das populações, levando, em alguns casos, à extinção destas (Vrijenhoek, 1998; Agostinho et al., 2005). Marcadores microssatélites aplicados ao estudo de populações de peixes Os microssatélites ou SSR (Simple Sequence Repeats) têm sido considerados atualmente a classe de marcador molecular mais polimórfica e com o maior conteúdo de informações. Eles consistem em pequenos trechos de DNA (seqüência motif) com 1 a 6 nucleotídeos, repetidos em tandem (lado a lado) e possuem caráter co-dominante. Em

7 7 genomas de eucariotos estas seqüências são freqüentes, distribuídas ao acaso, formando locos extremamente polimórficos (Ferreira & Grattapaglia, 1995). Para a espécie Brycon hilarii, Sanches & Galetti (2007), baseados em locos microssatélites, verificaram que há populações geneticamente diferenciadas e que estas diferenças são bastante significativas entre épocas do ano e áreas de coleta distintas e que desse modo, a conservação desta espécie depende da manutenção de todas as unidades genéticas identificadas. Em Prochilodus argenteus, estudos similares, utilizando marcadores microssatélites, também demonstraram que há significativa diferenciação genética entre três populações coletadas na barragem da hidrelétrica de Três Marias, e que estratégias de manejo diferenciadas devem ser adotadas para preservar a integridade genética destas populações (Hatanaka & Galetti, 2003; Hatanaka et al., 2006). Carvalho-Costa et al. (2008), no entanto, também utilizando microssatélites, não encontrou diferenças significativas entre três populações de Prochilodus costatus na mesma região de Três Marias. Dois fenômenos têm sido apontados pelos diferentes autores para explicar a manutenção de estruturação populacional para essas espécies que realizam grandes migrações ao longo das bacias: o spawning waves, também conhecido como ondas reprodutivas, nos quais grupos de indivíduos geneticamente diferenciados se reproduzem em períodos distintos no mesmo local e o homing, fenômeno bastante observado nos salmonídeos, que consiste no reconhecimento dos indivíduos adultos ao local onde nasceram (Ryman, 1983; Sanches & Galetti, em prep). Estudos comparativos entre populações residentes e migradoras poderão auxiliar nesse debate. Transferabilidade de locos microssatélites

8 8 Apesar de extremamente eficientes, o uso de marcadores moleculares de microssatélites em estudos de genética populacional depende de uma etapa prévia, que consiste na caracterização e descrição destes locos no organismo que se deseja estudar. Devido ao alto custo e tempo para o desenvolvimento de primers espécie-específicos para locos microssatélites, muitos estudos vêm utilizando cada vez mais primers descritos para uma determinada espécie em outras espécies relacionadas que ainda não possuem seqüências microssatélites descritas e validadas (Oliveira et al., 2006). A transferabilidade de locos heterólogos de microssatélites pode ser extremamente alta quando realizada em espécies ou gêneros taxonomicamente relacionados. Dependendo de sua localização (se o loco está ou não presente em uma região codante do genoma) esta taxa pode ser ainda maior (Oliveira et al., 2006). Em peixes esta transferabilidade de microssatélites entre membros da família Characidae demonstra grande potencial. Sanches & Galetti (2006), utilizando primers específicos de B. hilarii, realizaram ensaios de transferabilidade em cinco diferentes espécies do gênero Brycon, sendo que duas delas, B. orbignyanus e B. insignis, encontram-se na lista de animais ameaçados de extinção no território brasileiro (MMA, 2004). Devido à grande importância do dourado e da intensa ação antrópica que esta espécie vem sofrendo, principalmente, devido à pesca e degradação de seus habitats, é necessária a descrição de marcadores eficientes para a avaliação de variabilidade genética e verificação da existência de estruturação de populações, para que estratégias de manejo específicas possam ser estabelecidas para conservar a integridade genética e o potencial evolutivo desta importante espécie de peixe migrador, visando à manutenção dos diferentes pools gênicos existentes.

9 9 Desta forma, o presente trabalho visa contribuir efetivamente com a descrição de marcadores microssatélites polimórficos que sejam eficientes para os estudos de caracterização da estrutura genética de populações do dourado baseados na utilização de locos descritos para Brycon sp na espécie S. franciscanus. METODOLOGIA As amostras de tecido de indivíduos de S. franciscanus foram coletadas de animais provenientes da bacia Rio São Francisco, na região da barragem de Três Marias, estado de Minas Gerais. A extração de DNA foi realizada utilizando-se tampão salino (sem fenol), segundo o protocolo descrito por Aljanabi & Martinez (1997). Após a extração, as amostras de DNA foram quantificadas em gel de agarose 0.8%, imerso em tampão TBE 1x (Tris-Base, Ácido Bórico, EDTA), contendo brometo de etídeo (0.5 µg/ml), sob uma condição de corrida de 1 hora a 100 volts. O marcador de peso molecular Low DNA Mass Ladder (Invitrogen) foi utilizado como parâmetro de quantificação. Este marcador evidencia bandas de 10, 20, 40, 80, 120 e 200ng. Após a quantificação, alíquotas de 50ng foram confeccionadas e estocadas a 20º C para posteriormente serem testadas em reações de PCR. Os locos microssatélites utilizados no presente trabalho foram aqueles descritos para a espécie B. hilarii (Sanches & Galetti, 2006) e também da espécie B. opalinus (Barroso et al., 2003). As reações de PCR foram realizadas seguindo-se, inicialmente, os protocolos sugeridos pelos respectivos autores. Foram utilizados 5µl de GoTaq Colorless Master Mix (Promega), 50ng de DNA e concentrações de primer sugeridos pelos autores dos primers. Os testes de transferabilidade foram realizados utilizando-se apenas três indivíduos, sendo dois coletados a jusante e um a montante da barragem.

10 10 RESULTADOS E DISCUSSÃO Até o momento foram testados dez locos microssatélites, sendo sete de B. opalinus e três de B. hilarii. A tabela 1 resume os dados dos locos descritos pelos autores para os dez locos testados. Lócus Motif n a Tamanho (pb) BoM1¹ (CA) BoM2¹ (CA) BoM5¹ (AC) 4 T(AC) 10 AT(AC) BoM6¹ (CA) 5 TA(CA) 10 T(CA) BoM7¹ (CA) BoM12¹ (GT) BoM13¹ (CT) Bh5² (AC) Bh6² (GT) Bh8² (GAT) Tabela 1. Descrição dos locos utilizados no presente trabalho, com os motifs microssatélites, tamanho do fragmento e número de alelos (n a ). Dados retirados de Barroso et al., 2003¹ e de Sanches & Galetti, 2006². Do total de locos testados, sete apresentaram amplificação satisfatória. O critério de avaliação para estabelecer o padrão como satisfatório considerou somente locos com amplificação nos três indivíduos e com padrão de tamanho de fragmento próximo ao descrito pelos autores dos primers. A tabela 2 resume os resultados obtidos.

11 11 Lócus Tamanho (pb) Número de indivíduos com amplificação BoM BoM2* BoM5* BoM6* BoM7* BoM12* BoM Bh5-0 Bh6 ±600 e ±150 3 Bh8 ±600 1 *Loci com padrão satisfatório de amplificação, - ausência de amplificação Tabela 2. Descrição dos locos testados, apresentando o tamanho observado em gel de agarose 2% e o número de indivíduos amplificados com sucesso seguindo-se as condições descritas pelos autores. O loco Bh5 não apresentou amplificação e Bh6 apresentou duas bandas. Cinco locos foram considerados com amplificação satisfatória, apresentando grande potencial para uso com a espécie S. franciscanus. Os locos BoM1 e Bh8 foram descartados pela presença de uma banda com tamanho muito superior ao relatado pelos autores. Já o loco Bh6 também foi descartado pela presença de uma banda com tamanho muito superior, apesar de apresentar uma banda de aproximadamente 150pb. Porém, o descarte de tais locos é apenas provisório, pois um seqüenciamento posterior desses fragmentos pode revelar sua similaridade com as seqüências descritas depositadas no GenBank. Apesar do loco BoM13 ter apresentado amplificação na faixa de 100 a

12 12 150pb, este loco apresentou amplificação fraca. Novos testes serão realizados com esse loco, modificando-se os padrões de reação para obter uma melhor amplificação e confiabilidade. Cerca de 50% dos locos testados demonstram potencial de aplicação como marcadores eficientes para S. franciscanus. Dentro do gênero Brycon, Sanches & Galetti (2006) encontraram resultados superiores ao deste trabalho, com cerca de 89% de sucesso de transferabilidade de locos microssatélites em cinco espécies relacionadas. Do mesmo modo, Barroso et al. (2003) obteve 100% de sucesso de amplificação de sete locos microssatélites em quatro espécies relacionadas. O sucesso de transferabilidade de locos microssatélites entre espécies parece estar diretamente ligado as relações filogenéticas entre os grupos testados. Em uma revisão, Barbará et al. (2007) revelou que para peixes, no caso de testes entre espécies do mesmo gênero, esta transferabilidade pode chegar à cerca de 70%, decaindo, porém, para 60% em gêneros dentro de uma mesma família e para 20% entre famílias dentro de uma mesma ordem. Os autores ainda dizem que desses percentuais, aproximadamente 70%, 50% e 30% dos locos heterólogos amplificados respectivamente, são polimórficos. Desse modo, os resultados aqui apresentados corroboram com dados da literatura relatados para transferabilidade de SSRs. A etapa futura consiste em aumentar o número amostral e realizar a genotipagem dos locos para avaliar o nível de polimorfismo dos locos testados. CONCLUSÕES Acreditamos que os locos heterólogos descritos no presente trabalho possuem um grande potencial para serem usados como marcadores moleculares para o estudo de populações naturais de S. franciscanus até que os locos espécie-específicos sejam

13 13 descritos para esta importante espécie de peixe migrador, contribuindo, por ora, para avaliação da estrutura genética de diferentes populações. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Agostinho AA, Thomaz SM, Gomes LC Conservation of the Biodiversity of Brazil s Inland Waters. Conservation Biology, 19 (3): Aljanabi SM, Martinez, I Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR- based techniques. Nucleic Acids Research, 25: Barbará T, Palma-Silva C, Paggi GM, Bered F, Fay MF, Lexer C Cross-species transfer of nuclear microsatellite markers: potential and limitations. Molecular Ecology, 16: Barroso RM, Hilsdorf WS, Moreira LM, Mello AM, Guimarães SEF, Cabello PH, Traub-Cseko M Identification and characterization os microsatellites loci in Brycon opalinus (Cuvier, 1819) (Characiforme, Characidae, Bryconiae). Molecular Ecology Notes 3: Carvalho-Costa LF, Hatanaka T, Galetti PM Evidence of lack of population substructuring in the Brazilian freshwater fish Prochilodus costatus. Genetics and Molecular Biology, 31 (1): Ferreira ME, Grattapaglia D Introdução ao uso de marcadores RAPD e RFLP em análise genética. EMBRAPA-Cenargen, Brasília, Brasil: 220p. Frankham R, Ballou JD, Briscoe DA A primer of conservation genetics. Cambridge University Press, 220pp.

14 14 Godoy MP Peixes do Brasil. Subordem Characoidei. Bacia do Rio Mogi Guassu. Editora Franciscana, volume 1, Piracicaba, SP, Brasil: 216p. Hatanaka T, Galetti Jr PM RAPD markers indicate the occurrence of structured populations of a migratory freshwater fish species. Genetics and Molecular Biology, 26: Hatanaka T, Henrique-Silva F, Galetti Jr PM Population substructutring in a migratory freshwater fish Prochilodus argenteus (Characiformes, Prochilodontidae) from the São Francisco River. Genetica, 126: 1-7. Lima FCT, Malabarba LR, Buckup PA et al Genera Incertae Sedis in Characidae In: R.E. Reis, S.O. Kullander & C.J. Ferraris Jr (eds) Check list of the freshwater fishes of South and Central America. EDIPUCRS, Porto Alegre, Brasil: 742p. Lima FCT, Britski HA Salminus franciscanus, a new species from the rio São Francisco basin, Brazil (Ostariophysi: Characiformes: Characidae). Neotropical Ichthyology, 5: Ministério do Meio Ambiente Instrução Normativa nº 005, de 21 de maio de En prensa. Moran P Current conservation genetics: building an ecological approach to the synthesis of molecular and quantitative genetic methods. Ecology of Freshwater Fish, 11 (1): Oliveira EJ, Pádua, JG, Zucchi MI, Vencovsky R, Vieira MLC Origin, evolution and genome distribution of microsatellites. Genetics and Molecular Biology, 29 (2):

15 15 Revaldaves E, Renesto E, Machado MFPS Genetic variability of Prochilodus lineatus (Characiformes, Prochilodontidae) in the upper Paraná river. Brazilian Journal of Genetics, 20: Ryman N Patterns of distribution of biochemical genetic variation in salmonids: differences between species. Aquaculture, 33: Sanches A, Galetti Jr, PM Microsatellites loci isolated in the freshwater fish Brycon hilarii. Molecular Ecology Notes, 6: Sanches A, Galetti Jr PM Genetic evidence of population structuring in the neotropical freshwater fish Brycon. Brazilian Journal of Biology, 67 (4): Sato Y, Godinho HP Migratory fishes of the São Francisco River. Em Carolsfeld et al. (ed) Migratory fishes of South America: biology, fisheries and conservation status.the International Bank for Reconstruction and Development/The World Bank, Washingotn, DC, Estados Unidos da América, 5: Vrijenhoek RC Conservation genetics of freshwater fish. Journal of Fish Biology 53: AGRADECIMENTOS Agradecemos o apoio financeiro da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e do Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq).