Ananas erectifolius (CURAUÁ): PADRONIZAÇÃO DOS EXTRATOS, FRAÇÕES E DO MATERIAL VEGETAL

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1 Ananas erectifolius (CURAUÁ): PADRONIZAÇÃO DOS EXTRATOS, FRAÇÕES E DO MATERIAL VEGETAL RESUMO Geysa de Almeida Fujihashi (PIBIC/CNPq), Wagner Luiz Ramos Barbosa (PQ). Departamento de Farmácia, CCS, Universidade Federal do Pará, Campus Universitário do Guamá, , Belém, PA. barbosa@ufpa.br Ananas erectifolius é uma espécie vegetal pertencente à família das Bromeliáceas, pouco investigada quanto à composição química das espécies que a constitui. Como planta medicinal é tradicionalmente utilizada na cicatrização cutânea. O presente trabalho relata a padronização de extratos e frações microbiologicamente ativos, bem como, do material vegetal da variedade branca de A. erectifolius. Testes microbiológicos realizados no Departamento de Farmácia, mostraram a atividade antibacteriana da espécie frente a cepas de Staphylococcus aureus. O extrato hidroetanólico (70%) de folhas foi fracionado por partição líquido-líquido com clorofórmio e n-butanol. O extrato e as frações obtidas foram analisados fitoquimicamente, e testados, em diferentes concentrações, contra cepas de Staphylococcus aureus utilizando-se a técnica da cromaotgrafia/bioautografia. Verificou-se que o extrato bruto e a fração clorofórmica não possuem atividade antibacteriana. A fração mais polar, extraída com n-butanol, apresentou um halo de inibição de crescimento significativo ( = 10 mm) com Rf = 0,33. A Concentração Mínima Inibitória (MIC) da fração butanólica é de 40 mg/ml. Palavras-chave: Ananas erectifolius, Bromeliaceae, Staphylococcus aureus, Atividade antimicrobiana, bioautografia ABSTRACT Ananas erectifoilius is a plant species belonging to the botanical family Bromeliaceae, from which few chemical data are available in the literature. As medicinal plant it is traditionally employed to heal wounds. This work reports the standardisation of the botanical material as well the microbiologically active fraction obtained from the white phenotype of A. erectifolius. Microbiological assays performed at the Pharmacy Department, have shown the anti-microbial activity of the plant toward Staphylococcus aureus. The hydroalcoholic extract (70%) from the leaves was partitioned successively with chloroform and n-butanol. The extract and the obtained fractions were submitted to phytochemical analysis and were tested, in different concentrations, against S. aureus using thin layer chromatographic/ bioautographic method. No activity could be registered for the extract and the chloroform fraction. Otherwise, the most polar fraction extracted with n-butanol showed a significant growth inhibition area ( = 10 mm) at Rf = The butanolic fraction has a Minimal Inhibition Concentration (MIC) of 40mg/mL. Keywords: Ananas erectifolius, Bromeliaceae, Staphylococcus aureus, anti-microbial activity, bioautography.

2 INTRODUÇÃO Ananas erectifolius é uma espécie vegetal pertencente à família das Bromeliáceas, de porte herbáceo, muito comum na Amazônia, e que apresenta duas variedades: a roxa e a branca 1 (Fig.1), cuja folha é aproveitada para a produção de fibra no estado do Pará. A espécie tem sido pouco investigada em relação a sua composição química. As poucas informações atualmente disponíveis sobre espécies desta família indicam a presença de flavonóides 2,3, triterpenóides e de esteróides 4, além de polissacarídeos 5. A literatura menciona atividades antiinflamatória, hipoglicêmica, imunomoduladora, anticoagulante e antiviral relacionadas aos polissacarídeos mucilaginosos encontrados em diferentes espécies vegetais 6, 7 e que foram encontrados também em A.erectifolius 8, que é tradicionalmente utilizada como planta medicinal para a cicatrização de ferimentos causados pelos instrumentos utilizados para o desfibramento das folhas. Testes microbiológicos realizados no Laboratório de Microbiologia do Departamento de Farmácia 9 mostraram que a espécie A. erectifolius, tanto da variedade branca como da roxa, apresentam atividade antibacteriana contra cepas clínicas e padronizadas de Staphylococcus aureus 8. A padronização de espécies vegetais e de seus insumos é uma das condições previstas na Resolução n.º 17 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária para o registro de Medicamentos Fitoterápicos 10, uma vez validado o seu uso tradicional. A padronização de insumos por cromatografia necessita o uso de marcadores que podem ser substâncias isoladas a partir de extratos do vegetal em questão, ou mesmo substâncias estranhas a ele. Por entender que a espécie Ananas erectifolius pode vir a preencher os requisitos necessários para a sua inclusão na Resolução, empreendeu-se a caracterização do extrato hidroetanólico e da fração butanólica ativa a fim de que possam ser utilizados como insumo para o desenvolvimento de uma forma farmacêutica. PARTE EXPERIMENTAL 1 Ribeiro, J. E. L. da S. et al. Flora da Reserva Ducke: Guia de identificação das plantas vasculares de uma floresta de terra-firme na Amazônia Central. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA). Amazonas. 199; 706 (1999). 2 Aslanian, R. L. e Semitz, F. R., J. Nat. Prod., 49, 1177, (1986). 3 Williams, C. A., Phytochemistry, 17, , (1978). 4 Dahlgren, R. M. T., Clifford, H. T., e Yeo, F. F., The Families of the Monocotyledons, Springer-Verlag Berlin, (1985). 5 Moyna, P. e Tubio, R., Planta Med., 32, 201, (1977). 6 Sristava, R. e Kulshreshtha, D. K., Phytochemistry, 28, , (1989). 7 Shimizu, M., Naganishi, S., e Hikino, H., Phytochemistry, 26, , (1987). 8 Furtado, E.C.C., Jennings, Y.L., Freitas, M.L.N., Mascarenhas, C., Vieira, J.M., Barbosa, W.L.R., Quignard, E., V Congresso da Federação Farmacêutica Sul-americana, Goiânia, novembro, (1998). 9 Agradecimentos à Prof.a Dr.a Marlene Barros de Assis pela orientação nos testes microbiológicos. 10 Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Resolução de Diretoria Colegiada (RDC) nº 17 de 24/02/2000. Aprova regulamento técnico, normatizando o registro de medicamentos fitoterápicos junto ao Sistema de Vigilância Sanitária. Diário Oficial da Unia, 2000.

3 Espécimes representativos, oriundos da cidade de Santarém, foram herborizados a fim de prover exsicatas para a classificação botânica (Fig. 2). O material vegetal utilizado para os experimentos ora relatados era constituído de folhas de Ananas erectifolius, da variedade branca. Fig. 1: Acima: Fruto do Ananas erectifolius. Abaixo: Folhas da variedade branca e roxa, respectivamente. Uma vez confirmada a classificação botânica do vegetal, triturou-se 2 kg de folhas e procedeu-se à preparação do extrato hidroetanólico a 70% (EE) por maceração à frio do material ainda fresco. O volume de solvente usado foi de 3 L, obtendo-se o mesmo volume de extrato hidroetanólico. O material vegetal foi extraído uma segunda vez com mais 2 L de etanol a 70% o que forneceu 5 L de extrato etanólico (EE). Uma alíquota de 700 ml de EE foram concentrados a baixa pressão em evaporador rotativo. Uma vez reduzido o teor de etanol, o extrato foi fracionado por partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente clorofórmio, acetato de etila e n- butanol. O EE e as frações clorofórmica (EEC) e butanólica (EEB) foram analisados fitoquimicamente e testados microbiologicamente, em diferentes concentrações, contra cepas da bactéria Fig. 2: Exsicata de Ananas erectifolius. Staphylococcus aureus, utilizando-se duas técnicas; a da bioautografia 11 e a de difusão em meio sólido. No primeiro caso, preparou-se um cromatograma com EE, EEC e EEB, usando-se como eluente clorofórmio/metanol (90:10). O meio de cultura utilizado no experimento foi preparado com Ágar Mueller-Hinton e distribuído sobre a placa cromatográfica. Após a gelificação foi inoculado o Staphylococcus aureus em suspensão. Para a técnica de difusão em meio sólido usou-se o mesmo meio de cultura, onde as amostras, em mistura com o agar, foram aplicadas em cavidades feitas no bloco de meio de cultura gelificado. RESULTADOS E DISCUSSÃO A extração das folhas de A. erectifolius forneceu 183g de EE, calculados a partir da concentração do extrato hidroalcoólico inicial (36,6 mg/ml), correspondente a um 11 a) Billow J., Speaker T.J., Bioautography of antibiotic compounds: a simplification and improvement J. Chromatogr., 67(1):191-2, (1972); b) Van der Kop P.A.; Mac Neil J.D., J. Chromatogr; 508(2):386-90, (1990).

4 rendimento de 9,15% em relação ao material vegetal fresco. A partição de 700 ml do extrato hidroetanólico obtido, feita com solventes de polaridades crescentes, resultou nas seguintes frações: clorofórmica, EEC, 7,81g, 4,27% ; acetato de etila, EEAE, 1,34g, 0,73% e butanólica, EEB, 8,46g, 4,62% os rendimentos foram calculados em relação à massa total de extrato EE. O extrato etanólico bruto foi analisado fitoquimicamente, utilizando como metodologia a Farmacopéia Brasileira III 12. Alguns dos resultados negativos podem estar relacionados com a real ausência dos metabólitos tais como; açúcares redutores, alcalóides e saponinas espumídicas. Outra classes testadas não puderam ser evidenciadas devido a intensa interferência dos pigmentos naturais do vegetal sobre a coloração de cada reação, assim, fenóis e taninos, ácidos orgânicos, polissacarídeos(!), catequinas, proteínas e aminoácidos, esteróides e terpenóides, carotenóides e antraquinonas. A análise cromatográfica de EE, EEC, EEAE e EEB mostrou a presença de ß- sitosterol em EE e EEC através da comparação em três sistemas cromatográficos diferentes. Partindo-se da constatação de que a fração butanólica apresentam atividade antimicrobiana 8, determinou-se o perfil cromatográfico por cromatografia em camada delgada (CCD) da fração ativa em relação ao extrato, utilizando-se o sistema sílica gel normal como suporte e clorofórmio/metanol (90:10) com eluente. Na tabela 1, abaixo, pode-se verificar as principais manchas observadas mediante a aplicação do reativo anisaldeído/ácido sulfúrico. Atualmente encontra-se em desenvolvimento uma programação que permita caracterizar por cromatografia líquida de alta eficiência Tabela 1: Perfil cromatográfico de EE e EEB Rf (EE) Aspecto da mancha Rf (EEB) Aspecto da mancha 0,55 Violeta 0,25 Levemente castanho 0,68 Levemente cinzenta 0,63 Violeta 0,77 Violeta 0,91 Verde escuro 0,91 Verde escuro Experimentos anteriores demonstraram que a fração acetato de etila não apresenta atividade antibacteriana 8, portanto somente EE, EEC e EEB foram testados quanta esta atividade. O cromatograma utilizado para a bioautografia foi obtido aplicando-se o mesmo sistema cromatográfico citado acima. A avaliação do antibiograma obtido mostrou uma zona de inibição de crescimento bacteriano com Rf = 0,31 devido a um dos componentes da fração butanólica (Tab. 2 e Fig. 3). Tabela 2: Atividade antimicrobiana do extrato bruto e frações. Amostra Concentração (mg/ml) da amostra (MIC) Resultado 12 Farmacopéia Brasileira. Editora Andrei, 3ª edição, São Paulo, (1977).

5 EE 160 R EEC 160 R EEB 40 S (Rf 0,31) R = Resistente S = Sensível Fig.3 : Antibiograma obtido por bioautografia de EE, EEC e EEB. A zona amarelada `a altura do clip (colorizada para maior contraste) com Rf= 0,31 corresponde à substância inibidora de crescimento bacteriano. Os grumos de colônias de bactérias conferem turbidez ao fundo da placa de Petri. A técnica de difusão em meio sólido foi aplicada para avaliar a atividade de componentes de EEB obtidos por cromatografia em camada delgada preparativa. Três desses componentes mostraram atividade sendo que apenas um produziu halo de inibição de crescimento bacteriano (Tab. 3). Tabela 3: Atividade antimicrobiana da fração butanólica. Mancha (Rf) Resultado/Halo 1 0,15 I (<10 mm) 2 0,16 I (<10 mm) 3 0,22 R 4 0,28 R 5 0,35 R 6 0,44 R 7 0,5 S (10 mm) I = Indicação; S = Sensível; R= Resistente DISCUSSÃO

6 A abordagem fitoquímica do extrato etanólico de Ananas erectifolius pouco contribuiu para a caracterização do vegetal, já vez a técnica por via úmida é intrinsecamente pouco sensível, pois a interferência que os pigmentos presentes nas amostras podem gerar nas reações coradas, em que se baseia a abordagem, pode mascarar resultados. Portanto, a análise cromatográfica por CCD, que apresenta melhor sensibilidade, será otimizada e adotada para a caracterização rápida de amostras do vegetal. Paralelamente, o desenvolvimento de uma programação para a determinação do perfil cromatográfico de EE e EEB por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) encontra-se em estágio adiantado. O extrato bruto, que anteriormente apresentara atividade 8, foi inócuo nos experimentos realizados nesta oportunidade, dentre os possíveis fatores que contribuíram para esta observação pode-se inclui-se a sazonalidade metabólica do vegetal e a conservação das amostras de vegetal fresco. Ademais confirmou-se que a fração clorofórmica não possui atividade antibacteriana significativa. Por outro lado, a fração mais polar, extraída com n- butanol, apresentou um halo inibitório significativo na bioautografia com Rf = 0,31. A tentativa de isolamento da substância ativa, por CCD preparativa, não apresentou substâncias com o mesmo Rf da bioautografia, mas permitiu isolar um componente ativo. Possivelmente trata-se de um polissacarídeo ou oligossacarídeo, pois não reage com o anisaldeído em meio sulfúrico nas análise por CCD (um dos parâmetros para otimizar). Esta classe de metabólito inibe a ação da hialuronidase microbiana impedindo a sua multiplicação e sua ação da sua toxina 13. CONCLUSÃO A espécie Ananas erectifolius apresenta um potencial para o aproveitamento farmacêutico, já que a atividade é persistente e passível de enriquecimento mediante um processo relativamente simples partição líquido-líquido. A padronização da fração ativa por CCD está próximo à conclusão, restando acertar o reativo de caracterização da substância ativa, que deverá ser isolada em quantidade suficiente para identificação, com o que estará viabilizada a padronização por CLAE. 13 Steinegger, E., Haensel, R., Pharmakognosie, 5ª edição, p. 716, Springer Verlag, Berlin, (1992).